非甲醇誘導型畢赤酵母蛋白表達系統及其用途的製作方法

2023-04-25 03:36:21

專利名稱：：非甲醇誘導型畢赤酵母蛋白表達系統及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種可採用無毒氮源成分來誘導生產外源蛋白的畢赤酵母表達系統及其在醫藥與食品級蛋白生產中的應用。
背景技術：
：基因表達體系是分子生物學及生命科學研究領域的重要內容，也是基因工程藥物和疫苗研製等應用領域所必需的重要生物反應器。大腸桿菌(E.coli)—直被用作表達外源基因的宿主菌，並成功地表達了多種外源蛋白，但是，它不能表達結構複雜的蛋白質，且分泌型表達產量較低，而包涵體表達產物的完全復性尚存在諸多問題，在表達產物中還常伴有內毒素成分。哺乳動物細胞、昆蟲細胞表達體系雖然能夠表達結構複雜的蛋白質，但其操作複雜，培養成本較高，而其表達水平通常較低，特別是在培養過程中多採用加血清培養，不但增加了成本，而且還可能帶來動物源性病源微生物汙染的風險(如狂牛症朊粒等)，目前我國在基因工程藥物產業化生產中，由於昂貴的造價和技術方面的原因，無血清、大規模懸浮培養動物細胞，尚難於普遍使用。由於歷史的原因及釀造工業的發展，人們對酵母的遺傳背景和生物學特性研究得較透徹，其表達的產物安全性易被接受。因此，最近二十年來，酵母被認為是一個很有前途的真核表達體系，受到廣泛的研究和應用。釀酒酵母(S.ce"vz'w'ae)是首先被用來作為外源基因的表達宿主菌，然而，人們在應用中發現S.cwevW加表達重組蛋白具有其局限性(1)產量通常較低；(2)表達質粒易於丟失，外源基因整合不穩定；(3)缺乏強有力的受嚴格調控的啟動子；(4)外源蛋白過度糖基化作用而使其抗原性明顯增強，不適於治療用途；(5)分泌效率差，特別是分子量大於30kDa的外源蛋白幾乎不分泌，使下遊純化複雜化；(6)不適於高密度發酵，難於產業化生產。因此S.ce"Ww'fle並不總是理想的表達宿主。基於上述問題，人們用其它酵母菌株構建了一個能夠高效穩定的外源基因表達體系一—甲醇營養型酵母(Me^y/o&opWc^flW)表達體系，作為第二代酵母表達體系，它克服了傳統釀酒酵母表達體系的諸多缺點和不足，成為國內外廣泛而大量生產外源真核或者結構較為複雜的原核蛋白的一個較為理想的、最具有發展前途的表達體系，是實現基因工程疫苗、抗體、酶、激素和毒素等蛋白藥物產業化生產的一個重要技術平臺。P.pastories不僅生長快、表達量大，而且能對外源蛋白進行翻譯後加工和修飾(包括糖基化)，同時又不產生自身毒素的優點。因此同以往的基因表達體系相比，它具有無可匹敵的優勢，已被認為是最具有發展前景的蛋白質生產工具之一。近10多年來，已有200多種外源蛋白的基因在該體系中成功表達，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。儘管各種外源蛋白質在甲醇酵母中的表達水平不一，但表達量均為在細菌、昆蟲或哺乳動物表達體系中產生量的10-100倍。據報導，P.pastories紅中外源蛋白質的產生量最高可達12g/L。由於採用P.pastories表達體系，通常可實現大量、廉價的高活性、高純度、低毒的重組目的蛋白，特別對於真核生物中的糖蛋白而言是最為理想的表達體系，因此，i^"Wor&被譽稱為"生產外源蛋白的工廠"。畢赤酵母(P.pastories)是一種典型的甲醇營養型酵母，廣泛應用於外源基因的表達。到目前為止，雖然大多數蛋白已經用戶^加啟動子獲得成功表達，但是在實際應用中，該啟動子在很多情況下卻帶來許多問題或者不方便，例如，在搖瓶培養中，甲醇極易快速揮發，既不利於控制甲醇濃度，並需要多次向培養基中添加甲醇，量少時不足以誘導表達，據報導，高濃度甲醇將使Mut+酵母株的AOXl(乙醇氧化酶l，alcoholP.pastories)失活99%，並引起細胞中毒而死亡。同時，還可能導致實驗室及周圍環境中有大量有毒的甲醇氣體瀰漫；再如，當採用重組畢赤酵母P.pastories進行外源蛋白的大規模的發酵生產時，存放和使用大量易燃、易爆的甲醇，無疑是一個較大的安全隱患；還有，在重組畢赤酵母P.pastories表達的外源蛋白中往往都伴隨有一定量的甲醇成分，由於甲醇對人及動物具有較高毒性，因此在目的蛋白質純化過程中，還不得不考慮甲醇殘留與脫甲醇毒的問題，特別是以甲醇誘導表達生產的藥品和食品，依據美國FDA(U.S.FoodandDrugsAdministration)標準，通常被認為是不安全的即NOGRAS(generallyregardedassafe)0隨著現代分子生物學理論研究的深入和基因工程藥物中、下遊工作的普遍開展，集多種優勢於一身的P.;flWon、表達體系已經成為廣大研究者和製藥界的重要選擇，同時從根本上避免以有毒的甲醇為誘導物，實現基因工程藥物的產業化、無毒害化顯得尤為重要。美國學者ShigangShen(1998)首先發現甲醛脫氫酶I(FLDl，formaldehydedehydrogenasel)基因在P.pastories也是一個可調控的高表達基因，發現FLD除了作用於甲醇外，還參與作為唯一氮源的垸基化胺如甲胺和膽鹼等的代謝。畢赤酵母(Pi^WOA7'力細胞中的甲醇代謝途徑示意圖參見圖1。本發明依據畢赤酵母碳源與氮源代謝途徑及其遺傳特性，對可採用膽鹼等無毒氮源成分誘導表達的甲醛脫氫酶啟動子PFLD1，進行基因克隆與分析，在功能預測與定向誘變的基礎上進行DNA重組，以螢光蛋白為模式蛋白，以PAO)a為參照，創建了戶pflWor^/pFLDZaA和PpaWoA/pFLDZA"綠色"安全醫藥與食品蛋白生產體系。
發明內容本發明的目的之一是提供一種能夠利用膽鹼等無毒氮源誘導表達的畢赤酵母表達載體，其製備方法及應用，將本發明的表達載體用於表達醫藥與食品用途的重組蛋白質，以克服現有利用甲醇誘導表達技術的不足。本發明的第二個目的是提供一種畢赤酵母表達系統及其應用，將本發明的表達系統用於表達醫藥與食品用途的重組蛋白質，能夠利用膽鹼等無毒氮源誘導表達目的蛋白。本發明的構思是這樣的依據畢赤酵母(i^"Wor的遺傳特性,以常用的突變型/^aWw^GS115和野生型i^ay欣AX-33菌株為宿主菌，利用基因操作技術分別對其中在甲醇代謝途徑中可經膽鹼、甲胺等為氮源誘導的甲醛脫氫酶iViw強啟動子克隆、進行結構與功能分析,並以生物信息學為指導，採用已克隆的啟動子序列分別替代表達載體pPICZA和pPICZctA中各自以甲醇誘導的i^aw啟動子,適當調整酶切位點，並以綠色螢光蛋白為模式蛋白，在對改造前後該蛋白的表達結果進行綜合分析和評價的基礎上，對無毒氮源誘導物進行優選，通過優化和篩選，獲得一套便於基因工程藥物產業化生產的畢赤酵母"綠色"基因表達體系，為生產安全的基因工程藥物或食品服務。發明研究內容在畢赤酵母(i^awwly)細胞中所體現的代謝途徑改變示意圖參見圖2。本發明一方面提供了一種畢赤酵母表達載體，其啟動子序列為酵母的甲醛脫氫酶啟動子FLD1序列。優選的，上述啟動子序列為SEQIDNO:1:1gcatgcaggaatctctggcacggtgctaatggtagttatc61atatatctggatatgccgcctataggataaaaacaggaga121tactagattgttcttgtactctgaattctcattatgggaa181gtgttgcagtactattgaatcgttgtagtatctacctgga2413gataacsgagttgggtaact3g3g3gaataatagacgtac咖ggagctg鄉tagtcggggtgaaccttgcttatggcactaaactaatctcatctgtgggcattccatgaattagtgtgcatgattactacacaacg301gatgtcgcactctttccttagttaaaactatcatccaatcacaagatgcgggctggaaag361acttgctcccgaaggataatcttctgcttctatctcccttcctcatatggtttcgcaggg421ctcatgccccttcttccttcgaactgcccgatgaggaagtccttagcctatcaaagaatt481cgggaccatcatcgatttttagagccttacctgatcgcaatcaggatttcactactcata541taaatacatcgctcaaagctccaactttgcttgttcatacaattcttgatattcaca上述畢赤酵母表達載體，為將已知的畢赤酵母表達載體(含戶必;《啟動子，如PPICZA或pPICZaA)的啟動子替換為酵母的甲醛脫氫酶啟動子FLD1後獲得。除啟動子區域外，表達載體其餘的酵母分泌信號肽a-factor、多克隆位點區、檢測純化標記區、抗性篩選標記區與轉錄終止區都來源於已知的畢赤酵母表達載體。上述表達載體為分泌型表達載體或胞內表達載體。其中，分泌型表達載體為優選pFLDZaA，胞內表達載體優選pFLDZA。根據本發明的教導，所屬
技術領域：
的研究員還可將甲醛脫氫酶啟動子FLD1替換入除pPICZA或pPICZaA外的其它含Ao"啟動子的畢赤酵母表達載體(pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、、pPICZaB、pPICZC、pPICZaC)中，獲得可經非甲醇誘導的畢赤酵母表達載體。本發明第二方面，提供了上述畢赤酵母表達載體的製備方法，包括下列步驟-1)克隆畢赤酵母FLD1蛋白結構基因與調控序列；2)將克隆產物採用合適的限制性酶切位點切割後，與去除乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母表達載體pPICZA或pPICZaA連接。克隆畢赤酵母FLD1蛋白結構基因與調控序列的方法可採用生物學常規的克隆方法進行，優選的，克隆畢赤酵母FLD1蛋白結構基因與調控序列時，採用PCR方法進行克隆。本發明採用了下述方案構建pFLDZaA和pFLDZA:根據《分子克隆》(科學出版社，第二版，2002年)，分別採用不同的引物將FLD1蛋白結構基因與調控序列從酵母基因組中克隆出來，並經過序列測定與結構分析正確後，採用限制性酶切位點切割下來分別與去除乙醇氧化酶啟動子的pPICZotA與pPICZA骨架以及部分表達元件連接而成。本發明所利用PCR克隆FLD1蛋白結構基因及其啟動子的引物序列分別為PFLD1(SEQIDNO:4):5，-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3BgUIPFLD2(SEQIDNO:5):5,-CTGGGATCCGAATTCTGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3，BamHI-EcoRIPFLD1(SEQIDNO:6):5、ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3BglIIPFLD2a(SEQIDNO:7):GCACATATGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3，NdelFLD11(SEQIDNO:8):5，隱ACTGGATCCCATATGTCTACCGAAGGTCAAATCATCAAATGTAAGGCAGCT陽3'BamHINdeIFLD22(SEQIDNO:9):5，-TCAGGGCCCTTAGTGCATAGTAATCACAGC-3,Apal進一步優選的，克隆獲得的FLD1蛋白的核苷酸序列為SEQIDN0:2:1atgtctaccgaaggtcaaatcatcaaatgtaaggcagctgttgcctgggaggcaggaaag61gatctctctattgaggagattgaggttcttcctccaagagcccatgaagttagagtgaaa121gtggaattcactggtgtatgccacactgatgcttacacgctttctggtgcagatgcagag181ggaagtttccctgttgtgttcggccatgaaggtgctggtgttgtcgagtc3gttgg卿3241ggtgttgagtccgtgaaggttggggattctgtatgtgcttctgtgLcactcctgagtgcaga301gagtgcaagttctgtctgtctggtaagacgaacctctgtggtaaaatcagagccacccag361ggtaaaggtttgttaccagacgggacttctcgtttccgttgtaagggcaaggatttgttt421cactatatgggatgttcttccttttctcaatacactgtggtggctgacatctcagtggtt481aaagtccaagacgaagctcctaaggacaagacatgtctgttgggttgtggtgttaccaca541gggtacggtgctgctatcaacactgctaagatctctaagggtgacaagatcggtgtgttt601ggtgctggatgtattggattatctgtcatccaaggtgcagtttccaaaggtgcaagcgag661attattgtaattgacatcaatgattcaaagaaggcatgggcggaccaatttggtgcaact721aagtttgtcaatcctaicaaccttaccagaaggtaccaatattgttgactacttgattgat781atcactgacggaggctttgactataccttcgactgtaccggt犯tgttcaagtaatgaga841aatgcacttgaatcttgccacaagggttggggtgagtcgatcatcatcggtgtcgctgct901gctggtaaaga犯tctctacccgtcctttccagttggttactggcagagtctggagagga961tgcgcctttggaggtatcaagggacgtactcaaatgccatctttggttcaggactatctt1021gatggtaagattaaagttgacgagtttatcacacacagacatgacctggacaacatcaac1081aaagcatttcatgacatgcatgctggaaactgtattcgtgctgtgattactatgcactaa其對應編碼的胺基酸序列為SEQIDN0:3:MSTEGQIIKCKAAVAWEAGKDLSIEEIEVLPPRAHEVRVKVEFTGVCHTDAYTLSGADAEGSFPVVFGHEGAGVVESVGEGVESVKVGDSVVLLYTPECRECKFCLSGKTNLCGKIRATQGKGLLPDGTSRFRCKGKDLFHYMGCSSFSQYTVVADISVVKVQDEAPKDKTCLLGCGVTTGYGAAINTAKISKGDKIGVFGAGCIGLSVIQGAVSKGASEIIVIDINDSKKAWADQFGATKFVNPTTLPEGTNIVDYLIDITDGGFDYTFDCTGNVQVMRNALESCHKGWGESIIIGVAAAGKEISTRPFQLVTGRVWRGCAFGGIKGRTQMPSLVQDYLDGKIKVDEFITHRHDLDNINKAFHDMHAGNCI證ITM照本發明第三方面，公開了將上述畢赤酵母表達載體用於表達生產外源蛋白。本發明第四方面，公開了一種畢赤酵母表達系統，其表達載體為上述畢赤酵母表達載體，宿主為畢赤酵母P.pastoris，表達誘導物為無毒氮源成分，包括垸基化胺、氨鹽等其他可以為生物體利用的氮源。較佳的，上述無毒氮源成分為烷基化胺，烷基化胺優選甲胺或膽鹼。本發明第五方面，公開了將上述畢赤酵母表達系統用於表達或生產醫藥或者食品用途的重組蛋白質。通過該表達系統可製備無毒安全的藥用和食用重組蛋白。本發明所提及的無毒安全的藥用和食用重組蛋白，可以是任何類型的採用本表達系統表達產生的可食性或可醫用的蛋白質，進一步優選的為經純化的或含表達蛋白的菌體的利用。例如增強性綠色螢光蛋白(EGFP)、脂肪酶、甲醛脫氫酶蛋白等。在本發明一個表達試驗的方案中，表達載體為pFLDZaA和pFLDZA，宿主細胞為畢赤酵母屍i^wto^。表達的測試蛋白為增強性綠色螢光蛋白(EGFP)、脂肪酶、甲醛脫氫酶蛋白等。所採用的對照表達體系有pPICZaA和pPICZA與P;flWw^X-33和Pj3a加rfsGS1150本發明的啟動子基因克隆自酵母的甲醛脫氫酶啟動子Pfum基因全序列，具有SEQIDNO:l的序列。在載體構建方案中，本發明克隆的甲醛脫氫酶蛋白基因編碼序列為SEQIDNO:3的蛋白，優選的具有SEQIDNO:2的序列。本發明所提及的非甲醇誘導物即為無毒氮源，包括膽鹼、甲胺、氨鹽等其他可以為生物體利用的氮源。本發明的特點與優點在於本發明得到的屍戸WonVpFLDZaA、P戸WonVpFLDZA表達系統，能夠通過在誘導表達過程中添加非甲醇的無毒氮物質，有效地誘導外源基因的表達，而且在目標蛋白的表達量與表達活性方面與採用甲醇誘導沒有差異。本發明有效地避免了通常採用甲醇帶來的一系列問題，如甲醇的易揮發性，致使難於控制其濃度，導致不足以誘導表達或甲醇中毒；另外揮發於實驗室會危害生命；特別是大規模發酵中存放和使用大量易燃、爆的甲醇，無疑是一個大的安全隱患；尤其是在下遊純化中，還須進行脫甲醇毒與殘留檢測；特別是以甲醇誘導生產的藥品與食品據美國FDA標準被認為是不安全的。因此，利用該基因工程蛋白表達系統，尤其適合於利用畢赤酵母高效生產具有安全性要求高的藥品與食品，這預示著本發明良好的應用前景。圖l.畢赤酵母(P/70StoW力細胞中的甲醇代謝途徑示意圖AOX:alcoholoxidase,乙醇氧化酶DAS:dihydroxyacetonesynthase,二羥基丙酮合酶CAT:catalase，過氧化氫酶FLD:formaldehydedehydrogenase,甲醛脫氫酶FDH:formatedehydrogenase,甲酸脫氧酶圖2發明研究內容在畢赤酵母(i^aww的細胞中所體現的代謝途徑改變示意圖AOX:乙醇氧化酶FLD:甲醛脫氫酶FDH:甲酸脫氫酶圖3所構建的畢赤酵母非甲醇誘導表達載體結構示意圖具體實施例方式本發明的技術方案如下首先，克隆酵母甲醛脫氫酶蛋白(FLD1)及其啟動子。而後，將酵母甲醛脫氫酶啟動子克隆入pPICZaA及pPICZA，獲得pFLDZaA及pFLDZA表達載體。所構建的畢赤酵母非甲醇誘導表達載體結構示意圖參見圖3。接著，分別將甲醛脫氫酶、增強性綠色螢光蛋白及脂肪酶基因，以合適的位點亞克隆到本發明中已經構建成功的PFLDZaA和pFLDZA表達載體上，同時也亞克隆到載體pPICZaA和pPICZA上，作為表達對照，經提取載體酶切、PCR和序列測定分別獲得了相應的重組載體，將重組載體經適合的限制性內切酶線性化後，回收大片段，電轉化畢赤酵母戶；^^^&，採用Zeocin抗性篩選後，經過高保真PCR鑑定，獲得經同源重組正確的陽性畢赤酵母表達株，分別進行表達實驗，對於Pj^Wo/ls/pPICZaA，P/astorz;y/pPICZA重組表達系統採用0.5%甲醇誘導；PpaWonVpFLDZaA,P;aWo/^/pFLDZA重組表達系統採用烷基化胺如甲胺和膽鹼進行誘導表達。經過SDS-PAGE檢測2組試驗所產生的目的蛋白在產量與分泌方式方面有否顯著差別。試驗結果證明本發明所構建的PpastonVpFLDZaA禾llPpaWoA/pFLDZA表達體系，除了不採用甲醇作為誘導劑外，對目標蛋白的表達水平沒有顯著的影響。下面結合實施例，對本發明做進一步地說明，但本發明並不受限於下述實施例。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。材料以下實驗所用主要菌株與試劑來源酵母細胞系Ppawor/sX-33和戶pa^^'sOWA5、pPIC9、載體pPICZaA和pPICZA購自Invitrogen公司；pEGM—T載體、大腸桿菌DH5a菌株、釀酒酵母(S.m"m'wk)來自上海生工生物技術公司。工具酶來自TaKaRa公司，引物合成以及基因測序來自上海英駿生物技術公司。實施例l.酵母甲醛脫氫酶蛋白(FLD1)及其啟動子的克隆利用酵母基因組提取試劑盒，從酵母細胞系P/oy/or/sX-33和Pp"Wo/^OW"、釀酒酵母(S.cewv加M)提取基因組DNA,經瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，根據已經報導的同源序列設計和利用如下一對引物PFLD1:5，-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3(BglII);FLD22:5,-TCAGGGCCCTTAGTGCATAGTAATCACAGC-3，(Apal)以所提酵母基因組為模板，採用常規高保真PCR，擴增出約1.7Kb的DNA條帶，經回收與pEGM—T載體連接，獲得pEGM—T-FLD，在上海英駿生物技術公司測序後，經過序列分析與比對，發現所克隆序列為SEQIDNO:1所示。是我們所需要的包含調控區(包括FLD1啟動子)的酵母甲醛脫氫酶蛋白(FLD1)的核酸全序列，並包含有一個內含子。實施例2.//HM/w/s/pFLDZaA表達系統的構建為了構建以FLD1為啟動子的Z^arfo^/pFLDZaA分泌型表達體系，我們以pEGM—T-FLD為模板，利用引物PFLD1:5，-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3，(BglII)和PFLD2a:GCACATATGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3，(NdeI)高保真擴增出約600bp的FLD1啟動子序列，同時分別以pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5、、pPICZctB、pPICZC、pPICZaC為模板，以Pafl:5，-CGACATATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCT-3，(NdeI);Paf2:5'陽TCAGGATCCACGAGAAGAAACAAAATGAC-3，(BamHI)擴增出約4000bp的包含酵母分泌信號肽a-factor、多克隆位點區、檢測純化標記區與轉錄終止區，擴增條件採用常規條件，最後將之前獲得的約600bp的片段分別與之前獲得的約4000bp的片段中的一個，以及經BglII—BamHI切割pPICZaA，回收的大約為2200bp的片段相連接，轉化大腸桿菌DH5c菌株，經提取載體酶切、PCR和序列測定鑑定，均符合預期，最終確認獲得了用於戶；^Wor紅表達的pFLDZaA表達載體。實施例3./pflWwis/pFLDZA表達系統的構建為了構建以FLD1為啟動子的？pflWoni/pFLDZA胞內表達體系，我們以pEGM—T-FLD為模板，利用引物PFLD1:5，-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG陽3，(BglII)和PFLD2:5'隱CTGGGATCCGAATTCTGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3，(BamHI-EcoRI)高保真擴增出約600bpd的FLD1啟動子序列，然後將這1片段與經BglII—EcoRI切割pPICZA回收的大約為2500bp的包含酵母分泌信號肽a-factor、多克隆位點區、抗性篩選標記、檢測純化標記區與轉錄終止區的片段相連接，轉化大腸桿菌DH5a菌株，經提取載體酶切、PCR和序列測定鑑定，均符合預期，最終獲得了用於戶/Eton's表達的pFLDZA表達載體。實施例4.甲醛脫氫酶在pflstof&4DFLDZaA、/wwtor&4)FLDZA中的誘導表達為驗證所構建的畢赤酵母表達體系中甲醛脫氫酶啟動子的作用效果，首先選擇該啟動子的天然作用對象甲醛脫氫酶作為試驗對象，以證實其作用功效。將pEGM—T-FLD1中的甲醛脫氫酶分別以EcoRI與NotI位點亞克隆到本發明中已經構建成功的pFLDZaA和pFLDZA表達載體，同時也以EcoRI與NotI位點亞克隆以採用乙醇氧化酶啟動子購自Invitrogen公司的載體pPICZaA和pPICZA，作為表達對照，經提取載體酶切、PCR和序列測定，結果符合預期，分別獲得了pFLDZaA-FLD1和pFLDZA-FLD1、pPICZaA-FLD1和pPICZA-FLD1，經SacI酶線性化後，回收大片段，電轉化畢赤酵母/myton's，採用Zeocin抗性篩選後，經過高保真PCR鑑定符合預期，獲得經同源重組正確的陽性畢赤酵母表達株，分別進行表達實驗，對於戶戸WonVpPICZaA-FLD1，屍pa"o"'s/pPICZaA-FLD1採用0.5%甲醇誘導；PpaWonVpFLDZaA-FLD1，Ppa加A/pFLDZA-FLD1採用膽鹼進行誘導表達。經過SDS-PAGE檢測，發現2組試驗所產生的目的蛋白FLD1在產量與分泌方式方面沒有顯著差別，蛋白序列分析結果也表明表達的蛋白與文獻報導的FLD1蛋白序列一致。證明本發明所構建的戶/^tonVpFLDZaA禾卩P戸加A/pFLDZA表達體系，除了不採用甲醇作為誘導劑外，對目標蛋白FLD1的表達水平沒有顯著的影響。實施例5.報告基因在/;做tor&4)FLDZaA、p做tor&4)FLDZA中的誘導表達為驗證所構建的畢赤酵母表達體系中甲醛脫氫酶啟動子對外源蛋白表達啟動的作用效果，選擇具有顯色效果的蛋白質，即增強性綠色螢光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)為試驗對象，以證實其表達功效。利用pEGM-T載體，採用常規方法，構建pEGM—T-EGFP，或將現有的pEGM—T-EGFP中的EGFP蛋白分別以合適的位點亞克隆到本發明中已經構建成功的pFLDZaA和pFLDZA表達載體中，同時也亞克隆到載體pPICZaA和pPICZA(均採用乙醇氧化酶啟動子)中，作為表達對照，經提取載體酶切、PCR和序列測定鑑定符合預期，分別獲得了pFLDZaA-EGFP和pFLDZA-EGFP、pPICZaA-EGFP和pPICZA-EGFP，經適合的限制性內切酶線性化後，回收大片段，經電轉化後畢赤酵母戶/7氾toA後，採用Zeocin抗性篩選後，經過高保真PCR鑑定符合預期，獲得經同源重組正確的陽性畢赤酵母表達株，分別進行表達實驗，對於P戸WonVpPICZaA-EGFP,P/a^o^/pPICZaA-EGFP採用0.5%甲醇誘導；P戸Won's/pFLDZaA-EGFP，_Rpastoris/pFLDZA-EGFP採用膽鹼進行誘導表達。經過SDS-PAGE等檢測，發現2組試驗所產生的目的蛋白EGFP在產量與分泌方式方面沒有顯著差別，蛋白序列分析結果也表明表達的蛋白與文獻報導的EGFP蛋白序列一致。證明本發明所構建的^戸WwvVpFLDZaA禾卩P戸WoWs/pFLDZA表達體系，除了不採用甲醇作為誘導劑外，對外源目標蛋白EGFP的表達水平沒有顯著的影響。1實施例6.脂肪酶在//7flWw/s/bFLDZaA、//><wtor/s4)FLDZA中的誘導表達脂肪酶是一種廣泛應用於醫藥與食品領域的一種重要酶，該酶的分子結構較為複雜，許多採用大腸桿菌表達體系生產的脂肪酶為沒有活性的包涵體，復性較為困難。一些採用釀酒酵母系統來表達，但是其表達效率較低。而選擇畢赤酵母表達體系，其不可避免地要用到易燃、易爆、易揮發的有毒甲醇，這無疑會帶來諸多便，特別是在最終的產物中易存在有毒甲醇殘留，從而極大地影響工程化的脂肪酶在醫藥與食品領域的應用。為了避免這類事件的發生，本發明採用克隆自Yarrowialipolytic菌株的脂肪酶lip2在本發明所構建的P/aWonVpFLDZaA和PpaWon's/pFLDZA體系中表達。利用pEGM—T載體，採用常規方法，構建pEGM—T-lip2，或將現有的pEGM—T-lip2中的脂肪酶分別以合適的位點亞克隆到本發明中已經構建成功的PFLDZaA和pFLDZA表達載體，同時也亞克隆到以採用乙醇氧化酶啟動子購自Invitrogen公司的載體pPICZaA和pPICZA，作為表達對照，經提取載體酶切、PCR和序列測定鑑定分別獲得了pFLDZaA-lip2和pFLDZA-lip2、pPICZaA-lip2和pPICZA-lip2，經適合的限制性內切酶線性化後，回收大片段，經電轉化後畢赤酵母戶p"Wo/^後，採用Zeociii抗性篩選後，經過高保真PCR鑑定符合預期，獲得經同源重組正確的陽性畢赤酵母表達株，分別進行表達實驗，對於P/astonVpPICZaA-lip2，PpaytoAis/pPICZaA-lip2採用0.5%甲醇誘導；Pj7fl對onVpFLDZaA-lip2,PpflWoWs/pFLDZA-lip2採用膽鹼進行誘導表達。經過SDS-PAGE等檢測，發現2組試驗所產生的目的蛋白EGFP在產量與分泌方式方面沒有顯著差別，蛋白序列分析結果也表明表達的蛋白與文獻報導的EGFP蛋白序列一致。證明本發明所構建的P戸WonVpFLDZaA禾UP/"Won^/pFLDZA表達體系，除了不採用甲作為誘導劑外，對外源脂肪酶lip2的表達水平沒有顯著的影響。因此本發明所構建的畢赤酵母表達系統，適合於生產應用於醫藥與食品領域的重組蛋白質與酶的生產。序列表<110〉華東理工大學非甲醇誘導型畢赤酵母蛋白表達系統及其用途<130〉20070427〈160〉9Patervtlnversion3.1〈210〉1〈211〉597〈212〉DNA〈213>Pichiapastoris〈400〉1gCatgC鄉Elatc"tctggcacggtgctaatggtagttatccaacggagctgaggtagtcg60atatatctggatatgccgcca犯caggagagggtg獄cttgcttatggc120tactagattgttcttgtactctgaattctcatt3tggg犯actaaactaatctcatctgt180gtgttgcagtcgttgtagtatctacctggagggcattccatgaattagtg240agat犯cag3gttgggtaacaBt3g3cgt3tgcatgattactacaca8Cg300gatgtcgcsctctttccttagttsaa8ct3tcatccaatcggctggaaetg360acttgctcccga^ggataatcttctgcttctatctcccttcctcatatggtttcgcaggg420ctcatgccccttcttccttcgaactgcccgccttagcctatcaaagaatt480cgggaccatcatcgatttttetgagccttacctgatcgcaatcaggatttcactactcata540taaatacatcgctcaaagctccaactttgcttgttcatacaattcttgatattcaca597〈210>2〈211>1140〈212>DNA2atgtctaccgaaggtcaaa/tttgcctgggaggcagg犯ELg60gatctctctattgagg卿ttgaggttcttcctccasgagcccatgaagttagagtgaaa120gtggaattcactggtgtatgccacactgatgcttacacgctttctggtgc卿tgc卿g180ggaagtttccctgttgtgttcggccatga3ggtgctggtgttgtcgagtc240ggtgttgagtccgtg犯ggttgggga/ttctgtagtgcttctgtacactcctgagtgc卿300gagtgc卿ttctgtctgtctggt犯g3Cgaacctctgtggtaaaatcagagccacccag360ggt3犯ggtttgttaccag3cgggacttctcgtttccgttgtaagggc犯ggatttgttt420cactatatgggatgttcttccttttctcaatacactgtggtggctgacatctcagtggtt480已aeLgtcc犯g2LCg32lgCtCCtaagg3cei8igacatgtctgttgggttgtggtgttaccaca540gggtscggtgctgctatcaacactgctaagatctctaetgggtgacaagatcggtgtgttt600ggtgctggatgtattggattatctgtcatcC犯ggtgC3gtttccaaaggtgc鄉cgag660ttg3C3tC犯tgattc犯3g犯ggC3tgggcggaccaatttggtgcaact720aagtttgtca8tcct3caacCtt3CC3g犯ttgttgactacttgattgat780atcactgacgg郷Ctttg3ctataccttcgactgtaccggtaatgttca8gtaatgaga840犯tgcacttgaatcttgccac卿ggttggggtgagtcgatcatcatcggtgtcgctgct900gctggt犯agaaatctctacccgtcctttccagttggttactggc卿gtctgg卿gga960tgcgcctttgg3ggt3tC^ggg3Cgt3Ctc犯stgccatctttggttcaggactatctt廳gatggta卿tt犯agttgacgagtttatcatgacctgga畫aaagC3tttcatgacatgcatgctggELaactgtattcgtgctgtgattactatgcactaa1140〈210〉3〈211〉379〈212〉PRT〈213〉Pichiapastoris3MetSerThrGluGlyGinlielieLysCysLysAlaAlaValAlaTrp151015GluAlaGlyLysAspLeuSerlieGluGlulieGluValLeuProPro202530tableseeoriginaldocumentpage17260ThrGlyAsnValGinValMetArg275280GlyTrpGlyGluSerlielielie290295lieSerThrArgProPheGinLeu305310CysAlaPheGlyGlylieLysGly325GinAspTyrLeuAspGlyLyslie340ArgHisAspLeuAspAsnlieAsn355360GlyAsnCyslieArgAlaVallie370375431腿<213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉4acgagatctgcatgcaggaatctctggcacg31540〈212〉DNAartificialsequence18265270AsnAlaLeuGluSerCysHisLys285GlyValAlaAlaAlaGlyLysGlu300ValThrGlyArgValTrpArgGly315320ArgThrGinMetProSerLeuVal330335LysValAspGluPhelieThrHis345350LysAlaPheHisAspMetHisAla365ThrMetHis200710040184.4〈220>〈223〉引物〈400〉5ctgggatccgaattctgtgaatatc肪gaattgtatgaac40〈210>6〈211〉31〈212〉賺〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400>6acgagatctgcatgcagg3atctctggc3cg31〈210〉7〈211>32〈212>DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉7gcacatatgtgaatatcaagaattgtatgaac32〈210>8〈211〉51〈212〉DNA〈213>artificialsequence<220〉〈223〉引物tableseeoriginaldocumentpage20權利要求1.一種畢赤酵母表達載體，其特徵在於，其啟動子序列為酵母的甲醛脫氫酶啟動子FLD1序列。2.如權利要求l所述的畢赤酵母表達載體,其特徵在於，所述啟動子序列為SEQIDNO:3.如權利要求1或2所述的畢赤酵母表達載體，其特徵在於，所述表達載體為分泌型表達載體或胞內表達載體。4.如權利要求3所述的畢赤酵母表達載體，其特徵在於，所述分泌型表達載體為pFLDZaA，所述胞內表達載體為pFLDZA。5.權利要求1一4中任一權利要求所述畢赤酵母表達載體的製備方法，包括下列步驟(a)克隆畢赤酵母FLD1蛋白結構基因與調控序列；(b)將克隆產物採用合適的限制性酶切位點切割後，與去除乙醇氧化酶啟動子的畢赤酵母表達載體pPICZA或pPICZaA連接。6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，其中克隆畢赤酵母FLD1蛋白結構基因與調控序列時，採用PCR方法進行克隆，PCR所用引物選自下組1)PFLD1:5，-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3;2)PFLD2:5，-CTGGGATCCGAATTCTGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC國3，;3)PFLD1:5，-ACGAGATCTGCATGCAGGAATCTCTGGCACG-3:4)PFLD2a:GCACATATGTGAATATCAAGAATTGTATGAAC-3，:5)FLD11:5'-ACTGGATCCCATATGTCTACCGAAGGTCAAATCATCAAATGTAAGGCAGCT-3，；6)FLD22:5，-TCAGGGCCCTTAGTGCATAGTAATCACAGC陽3,。7.如權利要求5或6所述的製備方法，其特徵在於，其中克隆獲得的FLD1蛋白的核苷酸序列為SEQIDN0:2。8.權利要求l一4中任一權利要求所述畢赤酵母表達載體用於表達生產外源蛋白。9.一種畢赤酵母表達系統，其特徵在於，其表達載體為權利要求1一4中任一權利要求所述畢赤酵母表達載體，宿主為畢赤酵母i^"Won's，表達誘導物為無毒氮源成分。10.如權利要求9所述的畢赤酵母表達系統，其特徵在於，所述無毒氮源成分為烷基化胺。11.如權利要求10所述的畢赤酵母表達系統，其特徵在於，所述烷基化胺選自甲胺或膽鹼。12.權利要求9-11中任一權利要求所述的畢赤酵母表達系統用於表達或生產醫藥或者食品用途的重組蛋白質。全文摘要本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及對已有的甲醇酵母(Pichiapastoris)表達系統的改進技術及其應用。本發明依據畢赤酵母碳源與氮源代謝途徑及其遺傳特性，對可採用膽鹼等無毒氮源營養物質誘導表達的甲醛脫氫酶1(FLD1)啟動子PFLD1基因進行克隆與分析的基礎上，提供了啟動子為甲醛脫氫酶啟動子的畢赤酵母表達載體、其製備方法及應用，以及相應的表達系統及其應用。採用本發明提供的表達載體或表達系統表達外源蛋白質可採用無毒的膽鹼等氮源作為誘導劑，也可獲得與採用有毒誘導物甲醇接近同樣的外源蛋白表達效率。這種不用有毒誘導物的綠色安全表達體系可以應用於生產醫藥級與食品級的基因工程產品。文檔編號C12R1/84GK101104859SQ20071004018公開日2008年1月16日申請日期2007年4月28日優先權日2007年4月28日發明者劉美雲,宇鄭,鄭文雲,馬興元,魏東芝申請人:華東理工大學