胎盤保存液的製作方法

2023-04-24 20:11:31

胎盤保存液的製作方法
【專利摘要】一種胎盤保存液，pH值為7.33-7.83，每1000ml溶液有10mmol-15mmol磷酸二氫鉀、30mmol-40mmol氯化鈉、40mmol-50mmol氯化鉀、8mmol-10mmol硫酸鎂、70mmol-100mmol組氨酸、1.5mmol-2.0mmol別嘌呤、3mmol還原型穀胱苷肽、1ml-8ml2-巰基乙醇、8mol-10mmol腺苷、100000U-1000000U青黴素、60mg-100mg鏈黴素和50mg-70mg慶大黴素。本發明提供的胎盤保存液能對分娩後的胎盤進行長期保存，避免細胞活性的降低，並將胎盤染菌率控制在較低水平。
【專利說明】胎盤保存液
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於組織保存的組合物，尤其涉及一種胎盤保存液，用於胎盤的體外保存。
【背景技術】
[0002]人類胎盤由羊膜、絨毛膜和基蛻膜構成。羊膜和絨毛膜來源於胎兒，不同區域的蛻膜則起源於母體。胎盤除在胎兒發育、營養支持和維持耐受中發揮重要作用外，還是一個幹細胞儲備庫。胎盤組織容易得到，易於處理，不需要侵入性操作，對其研究不會涉及倫理道德問題，因此目前已成為尋找人類幹細胞新來源的研究熱點。
[0003]胎盤幹細胞的發現，解決了幹細胞的來源問題。胎盤的取材幾乎不受限制，在產婦知情同意的基礎上就可以獲得胎盤。胎盤的平均重量約為500克，其中含有豐富的幹細胞資源。胎盤是伴隨胚胎發育過程中的附屬品，其中的細胞成分相應也是處於胚胎發育早期，具有更強的增殖和分化能力。胎盤作為胎兒和母體之間的免疫屏障，其中的細胞成分同樣具有很強的免疫調節能力，尤其是胎盤幹細胞具有很低的免疫原性，這在異體移植治療過程中具有無可比擬的優勢。
[0004]然而胎盤在與胎兒離斷之後，缺少血液供應，其中的細胞成分會很快喪失活性，不利於胎盤幹細胞的分離培養。簡單安全的保存胎盤對胎盤幹細胞的分離培養及臨床應用都有著重要的意義。
[0005]生理鹽水是一種常用的胎盤保存液，雖然配製簡便，但不利於胎盤的體外保存，尤其不利於對胎盤中幹細胞的獲取。為實現動物器官、組織或細胞的體外保存，技術人員已為之付出了大量努力。
[0006]中國發明專利ZL00108778.9公開了一種動物細胞或器官的保存劑，是一種含有
0.lwt%-50wt%以兒茶素類為主要成分的多酚類，以及Euro-Collins液、UW液、血清和抗生素溶液的保存液，實現了可以不冷凍動物細胞而進行保存，但並不適用於胎盤組織的保存。
[0007]中國發明專利ZL200610130638.2公開了一種間充質幹細胞保存液及其用途，以人白蛋白和肝素作為主要成分，輔以人用細胞因子、磷酸根離子、金屬離子或單糖組成。該保存液能使人間充質幹細胞在運輸過程中的保持高存活率，減少了細胞之間和細胞與容器內壁的黏附，減少臨床輸注人間充質幹細胞時血管內出現細胞團栓塞的可能性。可使間充質幹細胞在環境溫度4°C -15°C時在24小時內保持單細胞懸液為主的狀態，大大增加了臨床使用人間充質幹細胞的範圍，所用的成分為符合臨床使用的成分，可滿足臨床使用人間充質幹細胞的需要。
[0008]中國發明專利ZL200910117522.9公開了一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取幹細胞的方法，使用PH7.4±0.2的磷酸緩衝液為保養液。與生理鹽水類似，經該保養液保存的胎盤獲取的幹細胞數量無顯著差異。
[0009]中國發明專利申請201210288706.3公開了一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法，由胎牛血清、二甲基亞碸和右旋糖酐40按體積比為7-9:1:1組成。採用三者組成的組合物對細胞的活性實現協同保護，防止細胞形成冰晶受到損傷，確保了復甦後的幹細胞活性與新製備的羊膜和絨毛膜幹細胞活性無差別。
[0010]中國發明專利申請201310243569.6記載了一種培養人臍帶間充質幹細胞的方法，使用含有青黴素鈉和硫酸鏈黴素的AIM-V培養基為臍帶保護液，其用量分別為100-200U/mL和100-200U/mL。AM-V培養基含有L-穀氨醯胺，加入抗生素後能使胎盤的染菌率下降，但獲取的幹細胞數量與生理鹽水亦無顯著差異。

【發明內容】

[0011]本發明的目的在於提供一種胎盤保存液，以利於胎盤的體外保存，提高獲取的幹細胞數量，將胎盤染菌率控制在較低水平。
[0012]本發明提供的一種胎盤保存液，pH值為7.33-7.83，每1000ml溶液加入的各組分和用量如下:
[0013]憐酸二氧鍾10mmol-15mmol、
[0014]氯化鈉30mmol-40mmol、
[0015]氯化鉀40mmol-50mmol、
[0016]硫酸續8mmol-10mmol、
[0017]組氨酸70mmol-100mmol、
[0018]別嘿呤醇1.Bmmol ~2.0mmol、
[0019]還原型穀胱苷肽3mmol、
[0020]2_ 疏基乙醇 lml_8ml、
[0021]腺苷8mol-10mmol、
[0022]青黴素100000U-1000000U、
[0023]鏈黴素60mg-100mg 和
[0024]慶大黴素5Omg-7Omg11
[0025]本發明中，以磷酸二氫鉀、組氨酸、氯化鈉和氯化鉀相組合共同作用，作為緩衝劑，有效防止細胞酸化或鹼化。
[0026]本發明還加入2-巰基乙醇，以其硫氫基為活性部分，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時，還能避免過氧化物對培養細胞的損害。每1000ml胎盤保存液中，用量優先選擇lml-8ml。
[0027]本發明還使用人參阜苷(ginsenoside, GS)如:但不僅限於Rbl、Rb2、Rb3、Re、Rd、Rg3、Rh2、Rgl和Rg2等，尤其是Rgl，用量優先選擇20mg_50mg。
[0028]為促進保持細胞的活性，本發明還使用5，7- 二羥基-3』，4』 - 二甲基黃酮。每1000ml盤保存液中，其用量優先選擇45mg-55mg。
[0029]地塞米松具有胎盤組織保存液中可以有效的起到保護細胞活性的作用。每1000ml胎盤保存液中，用量優先選擇0.01mmol-0.08mmol。
[0030]與使用生理 鹽水相比，人參皂苷、5，7-二羥基-3』，4』 - 二甲基黃酮和地塞米松等單獨使用對促進保持細胞活性並不顯著，當共同使用後，則能使細胞數量得到顯著提高。
[0031]本發明技術方案實現的有益效果:
[0032]本發明提供的胎盤保存液，能對分娩後的胎盤組織進行5天的保存、避免細胞活性的降低，將胎盤染菌率控制在較低水平。
[0033]本發明很好地解決了胎盤分娩之後不能長期保存、細胞活性降低、易滋生細菌等問題，對胎盤幹細胞的分離培養起到了非常重要的保證作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為使用生理鹽水保存的胎盤中所獲得的間充質幹細胞；
[0035]圖2為使用本發明提供個胎盤保存液保存的胎盤中所獲得的間充質幹細胞。
【具體實施方式】
[0036]以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍,其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍中。
[0037]本發明實施例其它所用的試劑若未經說明，均購自西格瑪一奧德裡奇(Sigma —Aldrich)公司。
[0038]實施例1胎盤保存液的製取
[0039]以去離子水為溶劑，加入10mmol-15mmol磷酸二氫鉀、30mmol-40mmol氯化鈉、40mmol-50mmol 氯化鉀、8mmol-10mmol 硫酸續、70mmol-100mmol 組氨酸、1.Smmol-2.0mmol別嘌呤、45mg-55mg5, 7- 二羥基_3』，4』- 二甲基黃酮、3mmol還原型穀胱苷肽、lml_8ml2-巰基乙醇、8mol-10mmol 腺苷、20mg_50mg 人參阜苷 Rgl、0.0Immo1-0.0HmmoI 地塞米松、100000U-1000000U青黴素、60mg-100mg鏈黴素和50mg-70mg慶大黴素，製成1000ml胎盤保存液，ρΗ7.33-7.83。分裝，封口，(TC _4°C保存。
[0040]實施例2細胞的增殖能力
[0041]將胎盤置於生理鹽水保存，5天後取出胎盤並分離獲得間充質幹細胞(參見圖1)。
[0042]將胎盤置於實施例1製取的胎盤保存液中保存，5天後取出胎盤並分離獲得間充質幹細胞(參見圖2)。
[0043]從圖1和圖2比較可見，使用胎盤保存液後，幹細胞形態保持更好。通過計算細胞數量，證明胎盤保存液保存後的胎盤細胞增殖能力更強，同一時間培養的間充質幹細胞數量更多。結果見表1。
[0044]表1
[0045]
【權利要求】
1.一種胎盤保存液，其特徵在於pH值為7.33-7.83，每1000ml溶液加入的各組分和用量如下: 憐酸二氣鍾 10mmol-15mmol、 氯化鈉 30mmol-40mmol、 氯化鉀 40mmol-50mmol、 硫酸鎮 8mmol-10mmol、 組氨酸 70mmol-100mmol、
別卩票呤醇 1.5mmol-2.0mmol、 還原型穀胱苷肽3mmol、 2-巰基乙醇lml-8ml、 腺苷 8mol-10mmol、 青黴素 100000U-1000000U、 鏈黴素60mg-100mg和 慶大黴素50mg-70mg。
2.根據權利要求1所述的胎盤保存液，其特徵在於還加入2-巰基乙醇Iml-Sml。
3.根據權利要求1所述的胎盤保存液，其特徵在於還加入人參皂苷20mg-50mg。
4.根據權利要求1所述的胎盤保存液，其特徵在於還加入人參皂苷Rgl，用量為20mg-50mgo
5.根據權利要求1所述的胎盤保存液，其特徵在於還加入5，7-二羥基-3』，4』 - 二甲基黃麗 45mg-55mg。
6.根據權利要求1所述的胎盤保存液，其特徵在於還加入地塞米松0.01mmol-0.08mmol。
【文檔編號】A01N1/02GK103704206SQ201410028687
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月13日 優先權日:2014年1月13日
【發明者】章毅, 霍思維, 陸瑤, 洪豔 申請人:章毅, 中國幹細胞集團上海生物科技有限公司, 重慶市幹細胞技術有限公司, 陝西省幹細胞技術有限公司, 蘇州市幹細胞技術有限公司, 上海市幹細胞技術有限公司, 三亞市幹細胞技術有限公司, 中國幹細胞集團上海有限公司, 中國幹細胞集團重慶有限公司, 中國幹細胞集團陝西有限公司, 中國幹細胞集團三亞有限公司