參與大環內酯類化合物的羥化作用的dna的製作方法

2023-04-24 19:24:51

專利名稱：參與大環內酯類化合物的羥化作用的dna的製作方法
技術領域：
本發明涉及參與大環內酯類化合物的羥化作用的DNA、其分離方法、由該DNA編碼的蛋白質、攜帶該DNA的質粒、經該質粒轉化的轉化體、以及使用該轉化體產生16位羥化的大環內酯類化合物的方法。
現有技術式(II) 所示的12元環大環內酯類化合物11107D是一種具有良好抗腫瘤活性的12元環大環內酯類化合物，其與式(I) 所示的12元環大環內酯類化合物11107B一起自鏈黴菌(Streptomyces sp.)Mer-11107株的培養物中發現(WO 02/060890)。大環內酯類化合物11107D相當於大環內酯類化合物11107B的16位羥化體，但其產量低於大環內酯類化合物11107B的產量，因此期望建立一種高效的製備方法。

發明內容
本發明的課題是發現了參與大環內酯類化合物11107B的羥化作用的DNA，提供了大環內酯類化合物11107D的新的產生方法。
本發明涉及以下的[1]～[15]項內容。
經分離的純DNA，其為參與將式(I) 所示的大環內酯類化合物(以下稱為大環內酯類化合物11107B)生物學轉化為式(II) 所示的16位羥化的大環內酯類化合物(以下稱為大環內酯類化合物11107D)的DNA，包含編碼部分或全長的具有16位羥化酶活性的蛋白質或鐵氧還蛋白的DNA或其變體。
如下述(a)、(b)或(c)所示的[1]所述DNA。
(a)編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質的DNA，所述DNA選自由序列編號1的鹼基1322位至鹼基2548位的連續鹼基序列、序列編號2的鹼基420位至鹼基1604位的連續鹼基序列和序列編號3的鹼基172位至鹼基1383位的連續鹼基序列組成的組。
(b)上述(a)所示DNA的變體，為這樣的DNA(i)與上述(a)所示的DNA在嚴格的條件下雜交，且(ii)編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質。
(c)這樣的DNA，由於基因密碼子的簡併性，與上述(a)所示的DNA在嚴格的條件下不雜交，但所編碼的蛋白質與自上述(a)或(b)所示的DNA編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列。
自[2]所述的DNA編碼的蛋白質。
攜帶[2]的DNA的自我複製型或整合複製型重組質粒。
經[4]的重組質粒轉化的轉化體。
編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質的DNA的分離方法，其特徵在於以包含[2]所述的DNA或其部分的DNA作為探針或引物使用。
下述(d)、(e)或(f)所示的[1]所述DNA。
(d)編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述DNA選自由序列編號1的鹼基2564位至鹼基2761位的連續鹼基序列、序列編號2的鹼基1643位至鹼基1834位的連續鹼基序列和序列編號3的鹼基1399位至鹼基1593位的連續鹼基序列組成的組。
(e)上述(d)所示DNA的變體，為這樣的DNA(i)與上述(d)所示的DNA在嚴格的條件下雜交，且(ii)編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質。
(f)這樣的DNA，由於基因密碼子的簡併性，與上述(d)所示的DNA在嚴格的條件下不雜交，但所編碼的蛋白質與自上述(d)或(e)所示的DNA編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列。
自[7]所述的DNA編碼的蛋白質。
攜帶[7]的DNA的自我複製型或整合複製型重組質粒。
經[9]所述的重組質粒轉化的轉化體。
編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA的分離方法，其特徵在於以包含[7]所述的DNA或其部分的DNA作為探針或引物使用。
16位羥化的大環內酯類化合物的產生方法，其特徵在於使用培養基培養[5]或[10]所述的轉化體，在培養中或培養後，將經增殖的轉化體與式(III) 〔式中，W表示 R12、R16b、R17a、R17b、R18、R20a、R20b、R21a和R21b相同或不同，表示(1)氫原子，(2)可具有取代基的C1-22烷基，(3)-OR(式中R表示1)氫原子，可以有取代基的2)C1-22烷基，3)C7-22芳烷基，4)5元環至14元環的雜芳氧基烷基，5)C2-22烷醯基，
6)C7-15芳醯基，7)C3-23不飽和烷醯基，8)-CORco(式中Rco可以有取代基，表示8-1)5元環至14元環的雜芳基，8-2)C1-22烷氧基，8-3)不飽和C2-22烷氧基，8-4)C6-14芳氧基，8-5)5元環至14元環的雜芳氧基，或8-6)3元環至14元環的含氮非芳族雜環)，9)C1-22烷基磺醯基，10)C6-14芳基磺醯基，或11)-SiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2、Rs3相同或不同，表示C1-6烷基或C6-14芳基))，(4)滷素原子或(5)-RM-NRN1RN2{式中RM表示單鍵或-O-CO-；RN1和RN21)相同或不同，表示1-1)氫原子或1-2)可以有取代基的(i)C1-22烷基，(ii)不飽和C2-22烷基，(iii)C2-22烷醯基，(iv)C7-15芳醯基，(v)不飽和C3-23烷醯基，
(vi)C6-14芳基，(vii)5元環至14元環的雜芳基，(viii)C7-22芳烷基，(ix)C1-22烷基磺醯基或(x)C6-14芳基磺醯基；或2)RN1和RN2與結合的氮原子一起形成可具有取代基的3元環至14元環含氮非芳族雜環}；但是，R21a和R21b一起可形成(i)酮結構(＝O)或(ii)肟結構{＝NORox(式中Rox表示可具有取代基的C1-22烷基、不飽和C2-22烷基、C6-14芳基、5元環至14元環的雜芳基或C7-22芳烷基)}；R16a表示氫原子；R21c表示(1)氫原子或(2) (式中R22a、R22b和R22c相同或不同，表示1)氫原子，2)C1-6烷基，3)-OR(式中R具有上述的含義)，4)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN1和RN2具有上述的含義)或5)滷素原子；或R21a和R21b中的任一方與R22a和R22b中的任一方一起可形成部分結構
R22a或R22b Gm表示(1)式(GM-I)所示的基團 {式中R2和R10相同或不同，表示氫原子或C1-22烷基；R3a、R3b、R5a、R5b、R6a和R6b相同或不同，表示1)氫原子，2)羥基，3)可具有取代基的3-1)C1-22烷基，3-2)C1-22烷氧基，3-3)C6-14芳氧基，3-4)5元環至14元環的雜芳氧基，3-5)C2-22烷醯氧基，3-6)C7-15芳醯氧基，3-7)C3-23不飽和烷醯氧基，3-8)-OCORco(式中Rco具有上述的含義)，3-9)C1-22烷基磺醯氧基，3-10)C6-14芳基磺醯氧基，或
3-11)-OSiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2和Rs3具有上述的含義)，4)滷素原子，或5)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN1和RN2具有上述的含義)；或者R5a和R5b可一起形成酮結構(＝O)；或者R6a和R6b可一起形成螺環氧乙烷基或環外亞甲基(exomethylene)；或者，R7a和R7b相同或不同，表示氫原子或-ORH(式中RH表示氫原子、C1-22烷基或C2-22烷醯基)}、(2)式(GM-II)所示的基團 (式中R2、R3a、R3b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10與式(GM-I)的定義相同)，(3)式(GM-III)所示的基團
(式中R2、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10與式(GM-I)的定義相同)，(4)式(GM-IV)所示的基團 (式中R2、R6a、R7a、R7b和R10與式(GM-I)的定義相同)；或(5)式(GM-V)所示的基團 (式中R2、R3a、R6a、R6b和R10與式(GM-I)的定義相同)〕所示的大環內酯類化合物接觸，轉化為式(IV) (式中W、R12、R16b、R17a、R17b、R20a、R20b、R21a、R21b、R21c和Gm表示與式(III)的定義相同)所示的16位羥化的大環內酯類化合物，收集如此轉化的16位羥化的大環內酯類化合物。
[12]所述的產生方法，其中轉化體為[5]所述的轉化體，且為具有編碼鐵氧還蛋白的DNA的轉化體。
[12]所述的產生方法，其特徵在於將式(III-a) (式中54表示雙鍵或單鍵、W』表示雙鍵或 R5』表示氫原子或乙醯氧基，R6』表示氫原子或羥基，R7』表示氫原子或乙醯基)所示的化合物轉化為式(IV-a) (式中54、W』、R5』、R6』和R7』與式(III-a)的定義相同)所示的化合物。
[14]所述的產生方法，向式(IV-a)的化合物轉化中的式(III-a)的化合物選自由以下化合物組成的組中(1)54是單鍵、W』是 R5』、R6』和R7』是氫原子的化合物，(2)
54是單鍵、W』是 R5』和R6』是氫原子，R7』是乙醯基的化合物，(3)54是單鍵、W』是 R5』和R7』是氫原子，R6』是羥基的化合物，(4)54是單鍵、W』是 R5』是氫原子，R6』是羥基，R7』是乙醯基的化合物，(5)54是單鍵、W』是雙鍵，R5』、R6』和R7』是氫原子的化合物，(6)54是單鍵、W』是雙鍵，R5』和R6』是氫原子，R7』是乙醯基的化合物，(7)54是單鍵、W』是雙鍵，R5』和R7』是氫原子，R6』是羥基的化合物，(8)54是單鍵、W』是雙鍵、R5』是氫原子、R6』是羥基、R7』是乙醯基的化合物、(9)
54是雙鍵、W』是 R5』和R7』是氫原子，R6』是羥基的化合物，(10)54是雙鍵、W』是 R5』是氫原子，R6』是羥基，R7』是乙醯基的化合物，(11)54是單鍵、W』是 R5』是乙醯氧基，R6』是羥基，R7』是氫原子的化合物，和(12)54是單鍵、W』是 R5』是乙醯氧基，R6』是羥基，R7』是乙醯基的化合物。
[5]或[10]所述的轉化體的用途，用於產生16位羥化的大環內酯類化合物。
根據本發明，可以分離編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質或鐵氧還蛋白的DNA，確定其鹼基序列，進一步地，可以製備攜帶該DNA的質粒、經該質粒轉化的轉化體，利用該轉化體，有效產生16位羥化的大環內酯類化合物。
以下，對本發明的實施方式進行詳細說明。
具有自大環內酯類化合物11107B轉化為大環內酯類化合物11107D的能力的微生物在本發明中，通過培養具有自大環內酯類化合物11107B轉化為大環內酯類化合物11107D的能力的微生物，自經培養的培養液收集的菌體分離編碼部分或全部具有16位羥化酶活性的蛋白質或鐵氧還蛋白的DNA，可確定其鹼基序列。然後，構建攜帶該DNA的自我複製型或整合複製型的重組質粒，使用該質粒製備轉化體。
如此製備的轉化體在培養基中培養，在培養中或培養後，通過使增殖的轉化體與上述式(III)所示的大環內酯類化合物接觸，轉化為式(IV)所示的16位羥化的大環內酯類化合物，通過收集所轉化的16位羥化的大環內酯類化合物，可獲得16位羥化的大環內酯類化合物。
作為具有自大環內酯類化合物11107B轉化為大環內酯類化合物11107D的能力的微生物，不管其種和株的種類如何，只要具有這個能力均可使用，但作為優選的微生物，可列舉任一自土壤分離的鏈黴菌(Streptomyces sp.)Mer-11107、A-1544株、或未鑑定的放線菌A-1560株。
另外，鏈黴菌Mer-11107作為FERM P-18144於2000年12月19日保藏在日本305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番3的工業技術院生命工學工業技術研究所，然後於2001年11月27日移管至日本305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(IPOD)，為國際保藏FERM BP-7812。A-1544株作為FERM P-18943於2002年7月23日保藏於日本305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，然後於2003年7月30日移管至日本305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(IPOD)，為國際保藏FERM BP-8446。A-1560株作為FERM P-19585於2003年11月13日保藏在日本305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番3號的工業技術院生命工學工業技術研究所，然後於2004年8月19日移管至日本305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6的獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(IPOD)，為國際保藏FERMBP-10102。
上述菌株的菌學性狀如下[Mer-11107株的菌學性狀](1)形態自營養菌絲伸長螺旋狀(Spirales)的氣生菌絲。在成熟的氣生菌絲頂部形成由10～20個左右的圓筒狀孢子組成的孢子鏈。孢子的大小約為0.7×1.0μm，孢子表面表現為平滑(smooth)，沒有觀察到孢子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在多種培養基中的生長狀態在多種培養基上於28℃培養2周後的培養性狀如下所示。將色調以Tresner’s Color wheels的顏色名稱和括號內的符號表示。
1)酵母·麥芽瓊脂培養基觀察到生長良好，其表面著生有氣生菌絲、灰色孢子(Light gray；d)。培養的下面是淺瓜黃色(Light melon yellow)(3ea)。不產生可溶性色素。
2)燕麥粉瓊脂培養基觀察到生長為中等程度，其表面著生有少量氣生菌絲、灰色孢子(Gray；g)。培養的下面是肉褐色(Nude tan)(4gc)或油灰色(Putty)(11/2ec)。不產生可溶性色素。
3)澱粉·無機鹽瓊脂培養基觀察到生長良好，其表面著生有氣生菌絲、灰色孢子(Gray；e)。培養的下面是淺黃褐色(Fawn)(4ig)或灰色(Gray)(g)。不產生可溶性色素。
4)甘油·天冬醯胺瓊脂培養基觀察到生長良好，其表面著生有氣生菌絲、白色孢子(White；a)。培養的下面是珍珠粉紅色(Pearl pink)(3ca)。不產生可溶性色素。
5)蛋白腖·酵母·鐵瓊脂培養基觀察到生長不好，其表面未著生有氣生菌絲。培養的下面是淺瓜黃色(3ea)。不產生可溶性色素。
6)酪氨酸瓊脂培養基觀察到生長良好，其表面著生有氣生菌絲、白色孢子(White；a)。培養的下面是珍珠粉紅色(3ca)。不產生可溶性色素。
(3)對多種碳源的同化性將不同碳源加入到Pridham-Gottlieb瓊脂培養基中並在28℃培養兩周，菌株的生長情況如以下所示。
1)L-阿拉伯糖 ±2)D-木糖 ±3)D-葡萄糖 +4)D-果糖 +5)蔗糖 +6)肌醇 +7)L-鼠李糖 -8)D-甘露醇 +9)棉子糖 +(+表示同化，±表示輕微同化，-表示幾乎不同化。)(4)生理學的性質本菌的生理學性質如下。
(a)生長溫度範圍(酵母·麥芽瓊脂培養基，2周培養)12℃～37℃(b)最適溫度範圍(酵母·麥芽瓊脂培養基，2周培養)21℃～33℃(c)明膠的液化(葡萄糖·蛋白腖·明膠培養基)陰性(d)牛奶的凝固(脫脂乳培養基)陰性(e)牛奶的腖化(脫脂乳培養基)陰性(f)澱粉的加水分解(澱粉·無機鹽瓊脂培養基)陽性(g)類黑素色素的產生(蛋白腖·酵母·鐵瓊脂培養基)陰性(酪氨酸培養基)陰性(h)硫化氫的產生(蛋白腖·酵母·鐵瓊脂培養基)陰性(i)硝酸鹽的還原(含0.1％硝酸鉀的肉湯)陰性(j)食鹽的耐性(酵母·麥芽瓊脂培養基，2周培養)在食鹽含有量4％以下生長(5)菌體成分自本菌的細胞壁檢測到LL-二氨基庚二酸和甘氨酸。

(1)形態自營養菌絲伸長螺旋狀(Spira type)的氣生菌絲。在成熟的氣生菌絲頂部形成由10～20個左右的圓筒狀孢子組成的孢子鏈。孢子的大小約為1.0×1.2～1.4μm，孢子表面表現為多刺狀(spiny)，沒有觀察到孢子囊、菌核、鞭毛等特殊器官。
(2)在多種培養基中的生長狀態在多種培養基上於28℃培養2周後的培養性狀如表1所示。將色調以Tresner’s Color wheels的顏色名稱和括號內的符號表示。
表1

(3)對多種碳源的同化性將不同碳源加入到Pridham-Gottlieb瓊脂培養基中並在28℃培養2周，菌株的生長情況如表2所示。
表2

+表示同化，±表示輕微同化，-表示幾乎不同化(4)生理學性質本菌的生理學性質如下。
(a)生長溫度範圍(酵母·麥芽瓊脂培養基，2周培養)15℃～41℃(b)最適生長溫度(酵母·麥芽瓊脂培養基，2周培養)20℃～37℃(c)明膠的液化(葡萄糖·蛋白腖·明膠培養基)陽性(d)牛奶的凝固(脫脂乳培養基)陽性(e)牛奶的腖化(脫脂乳培養基)陽性(f)澱粉的加水分解(澱粉·無機鹽瓊脂培養基)陽性(g)類黑素色素的產生(蛋白腖·酵母·鐵瓊脂培養基)陽性(酪氨酸培養基)陰性(h)硫化氫的產生(蛋白腖·酵母·鐵瓊脂培養基)陽性(i)硝酸鹽的還原(含有0.1％硝酸鉀的肉湯)陰性(j)食鹽的耐性(酵母·麥芽瓊脂培養基，2周培養)在食鹽含有量7％以下生長(5)菌體成分自本菌的細胞壁檢測到LL型二氨基庚二酸。
本發明的DNA本發明者們自上述微生物分離到參與大環內酯類化合物的16位羥化的DNA，即編碼具有16位羥化酶活性的蛋白質的DNA和編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA，確定了其鹼基序列。下文中，有時將編碼具有16位羥化酶活性的蛋白質的DNA和編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA總稱為「16位羥化酶相關的DNA」。
本發明的編碼具有16位羥化酶活性的蛋白質的DNA為下述(1-1)、(1-2)或(1-3)所示的DNA。
(1-1)選自由序列編號1的鹼基1322位至鹼基2548位的連續鹼基序列、序列編號2的鹼基420位至鹼基1604位的連續鹼基序列和序列編號3的鹼基172位至鹼基1383位的連續鹼基序列組成的組中的DNA。
(1-2)上述(1-1)所示DNA的變體，其(i)為與上述(1-1)所示的任一DNA在嚴格的條件下雜交的鹼基序列，且(ii)為編碼具有大環內酯類化合物的16位羥化酶活性的蛋白質的DNA。
(1-3)這樣的DNA，由於基因密碼子的簡併性，與上述(1-1)所示的任一DNA在嚴格的條件下不雜交，但所編碼的蛋白質與自上述(1-1)或(1-2)所示的DNA編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列。
另外，「16位羥化酶活性」是指將上述式(I)所示的大環內酯類化合物11107B的16位羥化，轉化為上述式(II)所示的大環內酯類化合物11107D的酶活性。
而本發明的編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA為下述(2-1)、(2-2)或(2-3)所示的DNA。
(2-1)編碼鐵氧還蛋白的DNA，其選自由序列編號1的鹼基2564位至鹼基2761位的連續鹼基序列、序列編號2的鹼基1643位至鹼基1834位的連續鹼基序列和序列編號3的鹼基1399位至鹼基1593位的連續鹼基序列組成的組中。
(2-2)上述(2-1)所示DNA的變體，其(i)與上述(2-1)所示的DNA在嚴格的條件下雜交，且(ii)為編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA。
(2-3)這樣的DNA，由於基因密碼子的簡併性，與上述(2-1)所示的DNA在嚴格的條件下不雜交，但所編碼的蛋白質與自上述(2-1)或(2-2)所示的DNA編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列。
另外，「鐵氧還蛋白功能」是指向上述16位羥化酶轉移電子，與上述16位羥化酶一起負責羥化反應的蛋白質功能。
在上述DNA的說明中「在嚴格條件下雜交的鹼基序列」是指以上述(1-1)或(2-1)的任一DNA作為探針使用時，通過集落雜交法、噬斑雜交法或Southern印跡雜交法等獲得的DNA的鹼基序列，例如可列舉通過使用固定有來自集落或噬斑的DNA或所述DNA的片段的濾膜，在0.7～1.0MNaCl存在下，於65℃雜交後，使用0.1～2×SSC溶液(1×SSC溶液為150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)，於65℃條件下洗淨濾膜而可鑑定的DNA等。雜交可根據Molecular CloningA laboratory Mannual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989(以下簡稱為分子克隆第2版)等所述的方法進行。
作為在嚴格條件下雜交的DNA，可例舉與作為探針使用的DNA的鹼基序列具有特定或以上的同源性的DNA，例如具有80％或以上，優選地85％或以上，更優選地90％或以上，更優選地95％或以上，最優選地98％或以上的同源性的DNA。
對獲得本發明的16位羥化酶相關DNA的方法沒有特別的限定。可基於本說明書序列表的序列編號1、序列編號2或序列編號3所示鹼基序列的情報，製備合適的探針或引物，使用它們篩選放線菌屬微生物的DNA文庫而分離本發明的DNA。DNA文庫可自表達上述16位羥化酶活性的微生物通過常規方法製備。
另外，通過PCR法可獲得本發明的16位羥化酶相關DNA。將上述微生物來源的DNA文庫作為模板使用，以可擴增序列編號1、序列編號2或序列編號3所述任一鹼基序列為目的而設計的1對引物進行PCR。PCR的反應條件可合理設定，可例舉例如以由94℃ 30秒(變性)、55℃ 30秒～1分鐘(退火)、72℃ 2分鐘(延伸)組成的反應步驟作為1個循環，如進行30個循環後，72℃反應7分鐘的條件等。接下來，可將所擴增的DNA片段克隆入可在合適的宿主中擴增的載體中。
上述探針或引物的製備、DNA文庫的構建、DNA文庫的篩選、以及目的基因的克隆等操作為本領域技術人員已知，例如可根據分子克隆第2版；Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1～38，JohnWiley Sons(1987-1997)等所述的方法進行。
對獲得本發明的蛋白質的方法沒有特別的限制，可以是通過化學合成而合成的蛋白質，也可以是通過基因重組技術而製備的重組蛋白質。製備重組蛋白質時，首先獲得編碼本說明書的上述蛋白質的DNA。可通過將該DNA導入合適的表達體系而產生本發明的蛋白質。關於使用表達體系表達蛋白質見本說明書中的後述內容。
本發明的重組載體可將本發明的DNA插入合適的載體使用。對本發明使用的載體的種類沒有特別的限制，如可為自我複製的載體(如質粒等)或為導入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，與所整合的染色體共同複製的載體。在表達載體中，本發明的DNA與轉錄所必需的元件(如啟動子等)功能性連接。啟動子為宿主細胞中顯示轉錄活性的DNA序列，可根據宿主的種類而進行合適的選擇。
本發明的轉化體以及使用所述轉化體製備重組蛋白質通過將本發明的DNA或重組載體導入合適的宿主可製備轉化體。本發明的DNA或重組載體所導入的宿主細胞可為任一細胞，只要其可表達本發明的基因即可，可例舉如細菌、酵母、真菌和高等真核細胞等。作為細菌細胞的例子，可例舉芽孢桿菌屬或鏈黴菌屬等革蘭氏陽性菌或大腸桿菌等革蘭氏陰性菌。這些細菌的轉化可通過使用感受態細胞採用原生質體法、電穿孔法或其它公知的方法進行。例如，電穿孔法可如下進行。將插入有外源基因的質粒加至感受態細胞的懸浮液，將該懸浮液放入電穿孔法專用杯，對所述杯施用高壓的電脈衝。然後使用選擇培養基培養，在平板瓊脂培養基上分離轉化體。
作為酵母細胞的例子，可例舉酵母屬或裂殖酵母屬細胞，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)等。作為向酵母宿主導入重組載體的方法，可例舉如電穿孔法、原生質球法、醋酸鋰法等。其它的真菌細胞例子有例如絲狀菌如麴黴屬(Aspergillus)、脈孢菌屬(Neurospora)、鐮孢屬(Fusarium)或木黴屬(Trichoderma)細胞。使用絲狀菌作為宿主細胞時，可通過將DNA構建體整合入宿主染色體，獲得重組宿主細胞，從而可實施轉化。將DNA構建體向宿主染色體的整合可按照公知方法通過如同源重組或異種重組實施。
將上述轉化體在可表達所導入基因的條件下，於合適的營養培養基中培養。對於自轉化體的培養物分離純化本發明的蛋白質，可使用常規的蛋白質分離、純化法。
例如，當本發明的蛋白質在細胞內以可溶形式表達時，在培養結束後，通過離心分離回收細胞，並懸浮於含水緩衝液後，使用超聲破碎儀等破碎細胞，獲得無細胞提取液。自離心分離該無細胞提取液得到的上清，通過單獨使用或組合使用常規的蛋白質分離純化法，即溶劑提取法、通過硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、通過有機溶劑的沉澱法、使用二乙氨基乙基(DEAE)瓊脂糖凝膠等樹脂的陰離子交換層析法、使用SP-Sepharose FF(AmashamBioscience公司生產)等樹脂的陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖凝膠、苯基瓊脂糖凝膠等樹脂的疏水層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、聚焦色譜法、等電點電泳等電泳法等操作，可獲得純化的製品。
16位羥化的大環內酯類化合物的產生方法本發明包含上述式(IV)所示16位羥化的大環內酯類化合物的產生方法，所述方法包括使用導入了這樣的DNA的轉化體，所述DNA為編碼具有16位羥化酶活性的蛋白質的DNA或為編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA；在該轉化體存在下使上述式(III)所示的大環內酯類化合物羥化。
使用本發明的轉化體可羥化的大環內酯類化合物為上述式(III)所示的大環內酯類化合物(上述式(IV)所示的大環內酯類化合物)，優選地為上述式(III-a)所示的大環內酯類化合物(上述式(IV-a)所示的大環內酯類化合物)，更優選地為大環內酯類化合物11107B(大環內酯類化合物11107D)。另外，括號內為作為羥化產物的16位羥化的大環內酯類化合物。
在轉化體存在下使大環內酯類化合物羥化的條件如下所述。
首先，根據需要添加誘導物，使轉化體中與16位羥化酶相關的DNA在菌體內表達。已表達這些DNA的菌體與作為底物的上述式(III)所示的大環內酯類化合物接觸，進行轉化反應。轉化反應的溫度可在考慮轉化體的最佳溫度後適當確定。另外，反應時間也在考慮向16位羥化的大環內酯類化合物的轉化率(反應的進行程度)等後可適當確定。如20～31℃，1～5天合適。而且，反應模式可以分批式實施，也可以連續式實施，任一形式均可。
所產生的16位羥化的大環內酯類化合物的分離及純化可利用通常用於將微生物代謝產物自其培養液分離所採用的分離、純化方法。如可使用甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙酸乙酯、醋酸丁酯、氯仿、甲苯等有機溶劑提取；使用Diaion HP-20等疏水性吸附樹脂的吸附洗脫處理；使用Sephadex LH-20等的凝膠過濾層析；使用活性炭、矽膠等的吸附層析；或通過薄層層析的吸附洗脫處理；或使用反相柱等的高效液相層析等所有公知的方法。而且，不特別限定為此處所示的方法。通過單獨使用這些方法或以任意順序組合使用這些方法，且反覆使用，可分離純化作為目的的16位羥化的大環內酯類化合物。
此外，在本發明中，DNA變體是指對組成鹼基通過刪除、替代、添加、插入等獲得的修飾體或其衍生物，均為表達與最初的DNA顯示同樣效果的DNA。
另外，本說明書中所用的「滷素原子」是指氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。
本說明書中所用的「C1-22烷基」是指碳數為1至22個的直鏈或支鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等，優選地碳數為1至6個的直鏈或支鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等。
本說明書中所用的「不飽和C2-22烷基」是指碳數2至22個的直鏈或支鏈鏈烯基、或者是指碳數2至22個的直鏈或支鏈炔基，如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基、1，3-己二烯基、1，5-己二烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-乙炔基-2-丙炔基、2-甲基-2-丙炔基、1-戊炔基、1-己炔基、1，3-己二炔基、1，5-己二炔基等，優選地為碳數2至10個的直鏈或支鏈鏈烯基、或者為碳數2至10個的直鏈或支鏈炔基，如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基等。
本說明書中所用的「C6-14芳基」是指由6至14個碳原子構成的芳族烴環式基團，如包含單環式基團、二環式基團、三環式基團等的稠環。可例舉如苯基、茚基、1-萘基、2-萘基、薁基、庚搭烯基、indacenyl、苊基、芴基、phenalenyl、菲基、蒽基等，優選地為苯基、1-萘基、2-萘基等。
本說明書中的「5元環至14元環的雜芳基」是指含有1個或1個以上選自氮原子、硫原子和氧原子的雜原子的單環式、二環式或三環式5至14元芳族雜環式基等。列舉合適的例子，作為含氮的芳族雜環式基，如吡咯基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三唑基、四唑基、苯並三唑基、吡唑基、咪唑基、苯並咪唑基、吲哚基、異吲哚基、中氮茚基、嘌呤基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、喹嗪基、2，3-二氮雜萘基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、肉啉基、蝶啶基、咪唑並三嗪基、吡嗪並噠嗪基、吖啶基、菲啶基、咔唑基、carbazolinyl、啶基、菲咯啉基、吩嗪基、咪唑並吡啶基、咪唑並嘧啶基、吡唑並吡啶基、吡唑並吡啶基等；作為含硫的芳族雜環式基，如噻吩基、苯並噻吩基等；作為含氧的芳族雜環式基，如呋喃基、吡喃基、環戊吡喃基、苯並呋喃基、異苯並呋喃基等；作為含有2個或2個以上的不同種雜原子的芳族雜環式基，如噻唑基、異噻唑基、苯並噻唑基、苯並噻二唑基、吩噻嗪基、異唑基、呋咱基、吩嗪基、唑基、isoxazoyl、苯並唑基、二唑基、吡唑並唑基、咪唑並噻唑基、噻吩並呋喃基、呋喃並吡咯基、吡啶並嗪基等，優選地為噻吩基、呋喃基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基等。
本說明書中所用的「3元環至14元環的含氮非芳族雜環基」是指含有1個或1個以上氮原子的單環式、二環式或三環式的3至14元環非芳族雜環基。列舉合適的例子，可列舉如azilidinyl、azetizyl、吡咯烷基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、高哌啶基、高哌嗪基、咪唑基、吡唑烷基、咪唑烷基、嗎啉基、硫代嗎啉基、咪唑啉基、唑啉基、奎寧環基等。此外，在所述含氮的非芳族雜環基中，也包含由吡啶酮環衍生的基團、非芳族性稠環(如由苯鄰二甲醯亞胺環、琥珀醯亞胺環等衍生的基團)。
本說明書中所用的「C2-22烷醯基」是指在上述定義的「C1-22烷基」的末端是羰基，可例舉如乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、新戊醯基、己醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、花生醯基等，優選地為碳數2至6個的烷醯基，如乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基等。
本說明書中所用的「C7-15芳醯基」是指上述定義的「C6-14芳基」、「5元環至14元環雜芳基」的末端結合有羰基的基團，可例舉如苯甲醯基、1-萘醯基、2-萘醯基、吡啶甲醯基、煙醯基、異煙醯基、呋喃甲醯基等。
本說明書中所用的「C3-23不飽和烷醯基」是指上述定義的「不飽和C2-22烷基」的末端結合有羰基的基團，可例舉如丙烯醯基、丙炔醯基、巴豆醯基、異巴豆醯基、油醯基、亞麻醯基等，優選地為碳數2至6個的不飽和烷醯基，如丙烯醯基等。
本說明書中所用的「C7-22芳烷基」是指在上述定義的「C1-22烷基」中在可取代的部分使用上述定義的「C6-14芳基」取代的由7至22個碳原子組成的基團，具體地可例舉如苄基、苯乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基、1-萘甲基、2-萘甲基等，優選地為碳數7至10個的芳烷基，如苄基、苯乙基等。
本說明書中所用的「C1-22烷氧基」是指在上述定義的「C1-22烷基」的末端結合有氧原子的基團，合適的基團可例舉如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、仲戊氧基、正己氧基、異己氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、2-乙基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、己氧基等。
本說明書中所用的「不飽和C2-22烷氧基」是指上述定義的「不飽和C2-22烷基」的末端結合有氧原子的基團，作為合適的基團可例舉如乙烯氧基、烯丙氧基、1-丙烯氧基、異丙烯氧基、2-甲基-1-丙烯氧基、2-甲基-2-丙烯氧基、1-丁烯氧基、2-丁烯氧基、3-丁烯氧基、1-戊烯氧基、1-己烯氧基、1，3-己二烯氧基、1，5-己二烯氧基、炔丙氧基、2-丁炔氧基等。
本說明書中所用的「C6-14芳氧基」是指在上述定義的「C6-14芳基」的末端結合有氧原子的基團，具體地可例舉如苯氧基、茚氧基、1-萘氧基、2-萘氧基、薁氧基、庚搭烯氧基、indacenyl氧基、苊基氧基、芴基氧基、phenalenyl氧基、菲基氧基、蒽基氧基等。
本說明書中所用的「5元環至14元環的雜芳氧基」是指在上述定義的「5元環至14元環的雜芳基」末端結合有氧原子的基團，具體地可例舉如吡咯基氧基、吡啶基氧基、噠嗪基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基、三唑基氧基、四唑基氧基、苯並三唑基氧基、吡唑基氧基、咪唑基氧基、苯並咪唑基氧基、吲哚基氧基、異吲哚基氧基、中氮茚基氧基、嘌呤基氧基、吲唑基氧基、喹啉基氧基、異喹啉基氧基、喹嗪基氧基、2，3-二氮雜萘基氧基、萘啶氧基、喹喔啉基氧基、喹唑啉基氧基、肉啉基氧基、蝶啶基氧基、咪唑並三嗪基氧基、吡嗪並噠嗪基氧基、吖啶基氧基、菲啶基氧基、咔唑基氧基、carbazolinyl氧基、啶基氧基、菲咯啉基氧基、吩嗪基氧基、咪唑並吡啶基氧基、咪唑並嘧啶基氧基、吡唑並吡啶基氧基、吡唑並吡啶基氧基、噻吩基氧基、苯並噻吩基氧基、呋喃基氧基、吡喃基氧基、環戊吡喃基氧基、苯並呋喃基氧基、異苯並呋喃基氧基、噻唑基氧基、異噻唑基氧基、苯並噻唑基氧基、苯並噻二唑基氧基、吩噻嗪基氧基、異唑基氧基、呋咱基氧基、吩嗪基氧基、唑基氧基、isoxazoyl氧基、苯並唑基氧基、二唑基氧基、吡唑並唑基氧基、咪唑並噻唑基氧基、噻吩並呋喃基氧基、呋喃並吡咯基氧基、吡啶並嗪基氧基等，優選地為噻吩基氧基、呋喃基氧基、吡啶基氧基、噠嗪基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基。
本說明書中所用的「5元環至14元環的雜芳氧基烷基」是指在上述的C1-6烷基中取代有上述的「5元環至14元環雜芳氧基」的基團。
本說明書中所用的「C1-22烷基磺醯基」是指結合有上述定義的「C1-22烷基」的磺醯基，具體地可例舉如甲磺醯基、乙磺醯基、正丙磺醯基、異丙磺醯基等。
本說明書中所用的「C6-14芳基磺醯基」是指結合有上述定義的「C6-14芳基」的磺醯基，具體地可例舉如苯磺醯基、1-萘磺醯基、2-萘磺醯基等。
本說明書中所用的「C1-22烷基磺醯氧基」是指上述定義的「C1-22烷基磺醯基」的末端結合有氧原子的基團，可例舉如甲磺醯氧基、乙磺醯氧基、正丙磺醯氧基、異丙磺醯氧基等。
本說明書中所用的「有取代基也可」中的取代基是指如選自以下的基團(1)滷素原子、(2)羥基、
(3)硫醇基、(4)硝基、(5)亞硝基、(6)氰基、(7)羧基、(8)磺醯氧基、(9)氨基、(10)C1-22烷基(如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等)、(11)不飽和C2-22烷基(如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基等)、(12)C6-14芳基(如苯基、1-萘基、2-萘基等)、(13)5元環至14元環雜芳基(如噻吩基、呋喃基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基等)、(14)3元環至14元環含氮非芳族雜環(如azilidinyl、azetizyl、吡咯烷基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、咪唑基、吡唑烷基、咪唑烷基、嗎啉基、咪唑啉基、唑啉基、奎寧環基等)、(15)C1-22烷氧基(如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、伸丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等)、(16)C6-14芳氧基(如苯氧基、1-萘氧基、2-萘氧基等)、(17)C7-22芳烷基氧基(如苄氧基、苯乙氧基、3-苯基丙基氧基、4-苯基丁基氧基、1-萘甲基氧基、2-萘甲基氧基等)
(18)5元環至14元環雜芳氧基(如噻吩基氧基、呋喃基氧基、吡啶基氧基、噠嗪基氧基、嘧啶基氧基、吡嗪基氧基等)、(19)C2-23烷醯基(如乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、新戊醯基、己醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、花生醯基等)、(20)C7-15芳醯基(如苯甲醯基、1-萘醯基、2-萘醯基等)、(21)C3-23不飽和烷醯基(如丙烯醯基、丙炔醯基、巴豆醯基、異巴豆醯基、油醯基、亞麻醯基等)、(22)C2-23烷醯氧基(如乙醯氧基、丙醯氧基、丙烯醯氧基等)、(23)C2-22烷氧基羰基(如甲氧基羰基、乙氧基羰基、正丙氧基羰基、異丙氧基羰基、正丁氧基羰基、異丁氧基羰基、仲丁氧基羰基、叔丁氧基羰基等)(24)不飽和C3-22烷氧基羰基(乙烯氧基羰基、烯丙氧基羰基、1-丙烯氧基羰基、異丙烯氧基羰基、炔丙氧基羰基、2-丁炔氧基羰基)、(25)C1-22烷基磺醯基(如甲磺醯基、乙磺醯基、正丙磺醯基、異丙磺醯基等)、(26)C6-14芳基磺醯基(如苯磺醯基、1-萘磺醯基、2-萘磺醯基等)和(27)C1-22烷基磺醯氧基(如甲磺醯基氧基、乙磺醯基氧基、正丙磺醯基氧基、異丙磺醯基氧基等)。
實施例參考例1(作為原料的大環內酯類化合物11107B的製備)自鏈黴菌(Streptomyces sp.)Mer-11107株(FERM BP-7812)的斜面培養(ISP-2培養基)取1鉑環量接種至已加入了50ml種子培養基[葡萄糖2％、Esusan-meat(味の素(株)生產)1％、酵母提取物(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生產)0.5％、氯化鈉0.25％、碳酸鈣0.32％，滅菌前pH6.8]的500ml容量三角瓶，於28℃培養2天獲得第一階段種子培養液。將該培養液0.1ml接種至已加入了同樣的種子培養基100ml的500ml容量三角瓶，於28℃培養1天獲得第二階段種子培養液。將由此獲得的第二階段種子培養液800ml接種至已加入了生產培養基[可溶性澱粉5％、Pharmamedia 0.8％、谷蛋白粉0.8％、酵母提取物0.5％、碳酸鈣0.1％，滅菌前pH6.8]100 L的200L罐中，在培養溫度28℃和攪拌數90轉/分鐘、通氣量1.0vvm、內壓20kPa的條件下通氣攪拌培養5天，獲得培養液。
將如此獲得的培養液的一部分(10L)使用10L 1-丁醇提取後，減壓乾燥丁醇層，獲得100g粗活性級分。將該粗活性級分添加至SephadexLH-20(Pharmacia Co.Ltd.生產，1500ml)，用四氫呋喃-甲醇(1∶1)的溶劑洗脫。將540ml至660ml的洗脫級分減壓下濃縮至幹，獲得殘渣(660mg)。接下來，將該殘渣溶解於乙酸乙酯和甲醇(9∶1；v/v)的混合液中，進行矽膠柱層析(WAKO GEL C-200、50g)。將該柱用正己烷和乙酸乙酯(1∶9；v/v)的混合液(2L)洗脫，收集468ml至1260ml的洗脫級分，減壓下濃縮，獲得粗活性級分25mg。
將獲得的粗活性級分在下述HPLC製備條件(A)進行製備型高效液相層析(HPLC)，收集保留時間34分鐘處所洗脫的級分，去除乙腈後，在下述HPLC製備條件(B)下將該級分通過HPLC進行脫鹽而獲得大環內酯類化合物11107B(保留時間37分鐘)6mg。
HPLC製備條件(A)柱YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM，φ20mm×250mm(YMC Co.生產)
溫度室溫流速10ml/分鐘檢測240nm洗脫液乙腈/0.15％磷酸二氫鉀(pH3.5)(2∶8～8∶2，v/v，0～50分鐘，線性梯度)HPLC製備條件(B)柱YMC-PACK ODS-AM SH-343-5AM，φ20mm×250mm(YMC Co.生產)溫度室溫流速10ml/分鐘檢測240nm洗脫液甲醇/水(2∶8～10∶0，v/v，0～40分鐘，線性梯度)。
實施例1確定鏈黴菌A-1544株(FERM BP-8446)來源的基因的鹼基序列(1)製備鏈黴菌A-1544株的染色體DNA向包含葡萄糖1％、麥芽汁0.4％、酵母提取物1％的培養基接種A-1544株，於28℃培養3天。將獲得的培養液3000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體。使用Blood Cell Culture kit(QIAGEN公司)自該菌體製備染色體DNA。
(2)克隆編碼具有大環內酯類化合物11107的16位羥化活性的蛋白質的DNA的部分序列參考推定的天藍色鏈黴菌(Streptmyces coelicolor)A3(2)細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列，設計並製備混合引物(5Dm-3F(序列編號4)和5Dm-3R(序列編號5))。
由於考慮密碼子的變動可提高反應性，使用了混合鹼基S(＝C+G)、Y(＝C+T)。
接下來，使用這2種引物(5Dm-3F和5Dm-3R)並以上述(1)獲得的A-1544株染色體DNA為模板進行PCR反應。PCR反應使用Takara LA Taq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、50℃退火2分鐘、68℃延伸30秒的3階段反應重複進行35次。結果擴增到約500bp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-A1)。該DNA片段-A1具有很高可能性為編碼具有羥化活性的蛋白質的DNA的一部分。PCR反應所擴增的DNA片段-A1通過SUPREC PCR(寶酒造社)自反應液回收。
接下來，為了獲得對產生的DNA片段-A1進行鹼基序列分析的足量DNA片段-A1，使用DNA Ligation kit ver.2(寶酒造社)將DNA片段-A1連接入質粒載體pT7Blue T(Novagen公司)，轉化大腸桿菌JM109株。然後，使用含有氨苄青黴素(50μg/mL)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；40μg/mL)、IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；100μM)的L-肉湯瓊脂培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂)選擇所轉化的大腸桿菌。將由此分離的轉化大腸桿菌的菌落用含有氨苄青黴素(50μg/mL)的L-肉湯液體培養基(1％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)培養。使用質粒純化試劑盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)自增殖的轉化大腸桿菌菌體分離純化質粒DNA，獲得一定量的DNA片段-A1。
(3)經克隆的DNA片段-A1的鹼基序列分析將前項(2)所獲得的DNA片段-A1的鹼基序列使用分析裝置(PEBiosystems 377XL)通過染料終止子循環測序法分析DNA鹼基序列。雖然通過電泳測定的PCR反應所擴增DNA片段-A1為約500bp，但鹼基序列分析的結果表明確切地為528bp(參見序列編號1的鹼基1775～鹼基2302)。由於在所克隆的上述528bp DNA序列的兩端發現有與進行上述PCR反應時使用的2種引物對應的DNA序列，因此明確了上述PCR反應中DNA片段-A1是由這2種引物(5Dm-3F和5Dm-3R)特異性擴增的。
(4)DNA片段-A1的鄰近區域的分析如上所述，由於確定了編碼來自A-1544株的、具有羥化活性的蛋白質的部分DNA序列，通過反向PCR法(細胞工學14卷，p.591-593，1995年)對延伸至克隆片段的上遊、下遊域的鄰近區域的鹼基序列進行擴增、克隆、序列分析。即，將A-1544株染色體DNA(參見(1))於H緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM-二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶PstI和SalI分別消化。將獲得的各限制酶切斷的DNA片段使用DNALigation Kit ver.2(寶酒造社)進行自身環化。
另一方面，自DNA片段-A1的鹼基序列設計並製備引物(6PIN-2F(序列編號6)和6PIN-2R(序列編號7))。
接下來，使用這2種引物(6PIN-2F和6PIN-2R)和作為模板的上述經自身環化的A-1544株染色體DNA進行PCR反應。PCR反應使用了Takara LATaq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、68℃退火和延伸5分鐘的2階段反應重複35次。
結果擴增了約3.5kbp大小的DNA片段(DNA片段-B1)和約2.8kbp大小的DNA片段(DNA片段-C1)，它們極有可能為編碼具有羥化活性的蛋白質的DNA以及具有包含其上遊和下遊區域的DNA序列的DNA。
通過SUPREC PCR(寶酒造社)自該PCR擴增反應液回收DNA片段-B1和DNA片段-C1。接下來，為了獲得足量用於鹼基序列分析的各DNA片段DNA片段-B1和DNA片段-C1，與上述(2)同樣，使用質粒載體pT7BlueT(Novagen公司)、DNA Ligation kit ver.2(寶酒造社)、大腸桿菌JM109株和質粒純化試劑盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)，獲得一定量的各DNA片段。
(5)DNA片段-B1(約3.5kbp大小)和DNA片段-C1(約2.8kbp大小)的鹼基序列分析將前項(4)所得的DNA片段-B1和DNA片段-C1的鹼基序列使用DNA鹼基序列分析裝置(PE Biosystems 377XL)，通過染料終止子循環測序法分析。進行這樣的鹼基序列分析了解到自DNA片段-B1和DNA片段-C1的序列得到序列編號1所示的3793bp的鹼基序列這一情報。
對該3793bp中的可讀框(ORF)進行檢索，確定了有2種蛋白質得到編碼。將這些蛋白質的胺基酸序列通過BLAST search檢索的結果為序列編號1的鹼基1322～鹼基2548中存在編碼包含與細胞色素P450具有高同源性的409個胺基酸的蛋白質的ORF(以下稱為psmA)。PsmA與推定為天藍色鏈黴菌A3(2)的細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列和推定為淺青紫鏈黴菌(Streptmyces lividans)的細胞色素P450(CYP105D4)的胺基酸序列具有最高的同源性(同源性72.6％)，與灰色鏈黴菌(Streptmyces griseus)的細胞色素P450soy(SoyC)也具有比較高的同源性(同源性69.4％)。由此認為psmA為編碼細胞色素P450類的羥化酶的基因的可能性高。
另外，在緊挨psmA的下遊(序列編號1的鹼基2564～鹼基2761)存在編碼與3Fe-4S類的鐵氧還蛋白具有高同源性的蛋白質的ORF(以下稱為psmB)。psmB編碼的蛋白質包含66個胺基酸，與緊挨推定為天藍色鏈黴菌A3(2)細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列下遊的推定為鐵氧還蛋白的胺基酸序列具有最高的同源性(83.3％)，而且與灰色鏈黴菌的鐵氧還蛋白soy(soyB)也具有比較高的同源性(同源性57.6％)。因此認為psmB用於電子轉移，編碼與psmA一同進行羥化的鐵氧還蛋白。
實施例2製備具有psmA和psmB的轉化體(1)製備含有A-1544株來源的psmA和psmB這兩者的DNA片段參考實施例1中分析的序列編號1的鹼基序列，設計並製備了在5』末端添加有NdeI位點的引物DM-NdeF(序列編號8)和5』末端添加有SpeI位點的引物DM-SpeR(序列編號9)。接下來，利用這2種引物(DM-NdeF和DM-SpeR)並以實施例1(1)所獲得的A-1544株染色體DNA為模板，進行PCR反應。PCR反應使用Takara LA Taq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、68℃退火和延伸2分鐘的2階段反應重複進行30次。
結果擴增到包含psmA和psmB的約1.5kbp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-D1)。自該PCR擴增反應液通過SUPREC PCR(寶酒造社)回收DNA片段-D1。
(2)質粒pTC-DM的構建將pT7NS-CamAB(參見WO03/087381)在H緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM-二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中通過限制酶NdeI和SpeI消化得到質粒消化物。同樣地，將前項(1)所得的DNA片段-D1使用限制酶NdeI和SpeI消化，將所得的DNA片段-D1的消化物與質粒消化物使用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)連接。由此，構建了內部含有psmA和psmB兩者的DNA片段-D1和質粒pT7NS-CamAB連接在一起的約9.5kbp大小的質粒(稱為質粒pTC-DM)。
(3)大腸桿菌轉化株BL21(DE3)/pTC-DM的製備使用前項(2)製備的質粒pTC-DM轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(Novagen公司)。由此獲得了經質粒pTC-DM轉化的大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-DM株。
實施例3通過具有psmA和psmB的大腸桿菌轉化體進行下式所示的ME-265向ME-282的轉化 (1)轉化體反應液的製備實施例2(3)得到的經轉化大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-DM株和BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的凍結種子接種於15mL容量試管中裝有的含氨苄青黴素50μg/mL的3mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，37℃振蕩培養20小時。將該種母培養液500μL接種於250mL容量的三角瓶中裝有的含氨苄青黴素50μg/mL的50mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，32℃振蕩培養3小時後，依次添加100mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙醯丙酸50μL，32℃振蕩培養6小時。離心分離(5000轉/分鐘、10分鐘)得到的培養液，收集菌體。將菌體懸浮於100mM磷酸緩衝液(pH6.1)1.75mL中，向其中添加80％甘油250μL、8mg/mL ME-26550μL。這樣得到的轉化反應液於28℃反應24小時。用乙腈1mL提取反應液200μL，通過HPLC測定ME-265和ME-282的量。測定結果如表3所示。
另外，HPLC的詳細條件如下所示。
分析裝置Shimadzu HPLC 10Avp柱CAPCELL PAK C18SG120(φ4.6mm×250mm)流動相45％乙腈(0～15分鐘)60％乙腈(15～30分鐘)45％乙腈(30～45分鐘)流速1ml/分鐘檢測UV240nm注射體積10μL柱溫度40℃分析時間45分鐘保留時間ME-26524.8分鐘ME-28212.7分鐘表3

(2)自轉化體反應液獲得ME-282向反應了24小時的反應液1.8mL中加入水4mL，使用乙酸乙酯8mL提取1次，4mL提取2次。合併乙酸乙酯層，使用無水硫酸鈉乾燥後，除去溶劑。將獲得的殘渣經薄層層析(MERCK Silicagel 60 F2540.25mm展開液；己烷∶乙酸乙酯＝1∶2)純化，得到ME-282 0.2mg。
1H-NMR譜(CD3OD，500MHz)δppm(積分，多重度，結合常數J(Hz))0.87(3H，d，J＝7.0Hz)，0.90(3H，d，J＝7.0Hz)，0.94(3H，t，J＝7.3Hz)，0.97(3H，d，J＝6.6Hz)，1.21-1.26(1H，m)，1.29-1.37(3H，m)，1.34(3H，s)，1.44-1.52(2H，m)，1.60-1.64(1H，m)，1.65(1H，dd，J＝6.2，13.9Hz)，1.77(3H，d，J＝1.1Hz)，1.86(1H，dd，J＝5.4，13.9Hz)，1.89-1.94(1H，m)，2.00(3H，s)，2.43(1H，dd，J＝5.5，13.9Hz)，2.50-2.60(1H，m)，2.56(1H，dd，J＝3.3，13.9Hz)，2.66(1H，dd，J＝2.2，7.7Hz)，2.89(1H，dt，J＝2.2，6.2Hz)，3.52(1H，dt，J＝4.8，8.4Hz)，3.75-3.80(1H，m)，4.90(1H，overlapped with D2O)，5.01(1H，d，J＝10.6Hz)，5.42(1H，dd，J＝9.2，15.0Hz)，6.13(1H，d，J＝10.6Hz)，6.52(1H，dd，J＝11.0，15.0Hz)。
結果，作為對照的大腸桿菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株沒有獲得認為是ME-282的峰，而含有psmA和psmB的BL21(DE3)/pTC-DM株幾乎消耗掉ME-265而獲得了認為是ME-282的峰。這暗示psmA和psmB參與自ME-265向ME-282的轉化。
實施例4通過攜帶psmA和psmB的大腸桿菌轉化體將大環內酯類化合物11107B轉化為大環內酯類化合物11107D(1)轉化體反應液的製備與實施例3同樣，以大環內酯類化合物11107B為底物進行試驗。實施例2(3)得到的轉化大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-DM株以及BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的凍結種子接種於15mL容量試管中含氨苄青黴素50μg/mL的3mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，30℃振蕩培養20小時。將該種母培養液500μL接種於250mL容量的三角瓶中含氨苄青黴素50μg/mL的50m L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，28℃振蕩培養5小時後，依次添加100mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙醯丙酸50μL，25℃振蕩培養20小時。離心分離(5000轉/分鐘、10分鐘)獲得的培養液，收集菌體。將菌體懸浮於100mM磷酸緩衝液(pH6.1)1.75mL中，向其添加80％甘油250μL、40mg/mL 11107B 50μL。由此得到的轉化反應液28℃反應24小時。用乙腈1mL提取反應液200μL，通過HPLC測定大環內酯類化合物11107B和11107D的量。該測定結果如表4所示。另外，HPLC的詳細條件如下所示。
分析裝置Shimadzu HPLC 10Avp柱CAPCELL PAK C18 SG120(φ4.6mm×250mm)流動相35％乙腈(0～10分鐘)35％～65％乙腈(10～12分鐘)65％乙腈(12～15分鐘)35％乙腈(15～20分鐘)流速1ml/分鐘檢測UV240hm注射體積10μL柱溫度40℃分析時間20分鐘保留時間11107B14.3分鐘11107D7.9分鐘表4

(2)自轉化體反應液獲得大環內酯類化合物11107D向反應了24小時的反應液1.8mL中加入水4mL，使用乙酸乙酯8mL提取1次，4mL提取2次。合併乙酸乙酯層，使用無水硫酸鈉乾燥後，除去溶劑。將獲得的殘渣經薄層層析(MERCK Silicagel 60 F254 0.25mm展開液；乙酸乙酯)純化，得到11107D 0.1mg。
1H-NMR譜(CD3OD，500MHz)δppm(積分，多重度，結合常數J(Hz))0.87(3H，d，J＝7.0Hz)，0.88(3H，d，J＝7.0Hz)，0.93(3H，t，J＝7.0Hz)，1.18(3H，s)，1.18-1.69(8H，m)，1.33(3H，s)，1.77(3H，d，J＝1.1Hz)，1.82-1.90(1H，m)，2.05(3H，s)，2.49-2.60(3H，m)，2.66(1H，dd，J＝2.2，8.2Hz)，2.89(1H，dt，J＝2.4，5.7Hz)，3.52(1H，dt，J＝4.8，8.3Hz)，3.73-3.82(1H，m)，5.04(1H，d，J＝9.8Hz)，5.05(1H，d，J＝10.6Hz)，5.56(1H，dd，J＝9.8，15.2Hz)，5.70(1H，dd，J＝9.8，15.2Hz)，5.86(1H，d，J＝15.2Hz)，6.3(1H，d，J＝10.8Hz)，6.52(1H，dd，J＝10.8，15.2Hz)。
結果，作為對照的大腸桿菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株沒有獲得認為是大環內酯類化合物11107D的峰，而含有psmA和psmB的BL21(DE3)/pTC-DM株，獲得了認為是大環內酯類化合物11107D的峰。這暗示psmA和psmB參與自大環內酯類化合物11107B向11107D轉化。
實施例5A-1544自身克隆株的轉化試驗(1)製備A-1544株來源的含有psmA和psmB這兩者的DNA片段(自身克隆用)參考實施例1中分析的序列編號1的鹼基序列，設計合成5』末端添加有BglII位點的引物DM-BglF(序列編號10)和5』末端添加有BglII位點的引物DM-BglR(序列編號11)。
然後，使用這2種引物(DM-BglF和DM-BglR)並以實施例1(1)所獲得的A-1544株染色體DNA作為模板進行PCR反應。PCR反應使用了Takara LATaq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、63℃退火30秒、68℃延伸4分鐘的3階段反應重複進行30次。
結果，擴增到含有psmA和psmB的約3.5kbp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-E1)。將該PCR擴增反應液通過瓊脂糖凝膠電泳分開。自瓊脂糖凝膠切下上述的約3.5kbp大小的DNA片段-E1，通過SUPREC 01(寶酒造社)回收。
(2)質粒pIJDMG的構建將pIJ702於H緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶BglII消化，獲得質粒消化物。同樣地將前項(1)所獲得的DNA片段-E1經限制酶BglII消化，所獲得的DNA片段-E1消化物與質粒消化物使用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)連接。由此構建了內部含有psmA和psmB這兩者的DNA片段-E1與質粒pIJ702連接的約8.5kbp大小的質粒(稱為質粒pIJDMG)。
(3)自身克隆株A-1544/pIJDMG株的製備使用前項(2)所製備的質粒pIJDMG，按照Genetic Manipulation ofStreptomycesA Laboratory Manual.John Innes Foundation，Norwich，1985所述的方法轉化A-1544株。由此獲得了經質粒pIJDMG轉化的A-1544/pIJDMG株。
實施例6通過自身克隆株自11107B向11107D轉化實施例5(3)所獲得的轉化體A-1544/pIJDMG株、A-1544/pIJ702株以及原始的A-1544株的凍結種子接種於250mL容量的三角瓶中含有硫鏈絲菌肽25μg/mL的50mL SMN培養基(stabilose 2％、葡萄糖2％、Esusan-meat 2％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.25％、CaCO3 0.32％ pH7.4)中，28℃振蕩培養48小時(種母培養，但對A-1544株不添加硫鏈絲菌肽)。將得到的種母培養液0.5mL接種於250mL容量的三角瓶中含有硫鏈絲菌肽25μg/mL的SMN培養基50mL中，28℃振蕩培養72小時(但對A-1544株不添加硫鏈絲菌肽)。將所得到的培養液分成2mL，向其添加1M磷酸緩衝液(pH6.5)100μL、40mg/mL 11107B 50μL。將由此獲得的轉化培養液於28℃反應12小時。用乙腈1mL提取反應液200μL，通過HPLC測定11107B和11107D的量。測定結果如表5所示。另外，HPLC的詳細條件如下所示。
分析裝置Shimadzu HPLC 10Avp柱CAPCELL PAK C18 SG120(φ4.6mm×250mm)流動相35％乙腈(0～10分)35％～65％乙腈(10～12分鐘)65％乙腈(12～15分鐘)35％乙腈(15～20分鐘)流速1ml/分鐘檢測UV240nm注射體積10μL
柱溫度40℃分析時間20分鐘保留時間11107B14.3分鐘11107D7.9分鐘表5

結果表明經含有psmA和psmB的質粒轉化的A-1544/pIJDMG株與原始的A-1544株相比較，經12小時反應轉化活性為約2.7倍。這暗示psmA和psmB的自身克隆可在自大環內酯類化合物11107B向11107D轉化中發揮作用。
實施例7確定鏈黴菌Mer-11107株(FERM BP-7812)來源的基因的鹼基序列(1)鏈黴菌Mer-11107株染色體DNA的製備向包含葡萄糖1％、麥芽汁0.4％、酵母提取物1％的培養基中接種Mer-11107株，於28℃培養3天。將獲得的培養液3000轉/分鐘離心10分鐘，收集菌體。使用Blood Cell Culture kit(QIAGEN公司)自該菌體製備染色體DNA。
(2)克隆編碼具有大環內酯類化合物11107的16位羥化活性的蛋白質的DNA的部分序列參考推定為天藍色鏈黴菌A3(2)細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列，設計並製備混合引物(5Dm-3F(序列編號4)和5D-1R(序列編號12))。
為了提高反應性，考慮了密碼子的變動，使用混合鹼基S(＝C+G)、Y(＝C+T)。
接下來，使用這2種引物(5Dm-3F和5D-1R)並以前項(1)所得到的Mer-11107株染色體DNA為模板進行PCR反應。PCR反應使用Takara LATaq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、50℃退火2分鐘、68℃延伸30秒的3階段反應重複進行35次。結果擴增到約300bp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-A2)。該DNA片段-A2很可能是編碼具有羥化活性的蛋白質的DNA的一部分。PCR反應擴增的DNA片段-A2通過SUPREC PCR(寶酒造社)自反應液回收。
接下來，為了獲得用於分析DNA片段-A2的鹼基序列的足量DNA片段-A2，使用DNA Ligation kit ver.2(寶酒造社)連接質粒載體pT7BlueT(Novagen公司)和DNA片段-A2，轉化大腸桿菌JM109株。然後，使用含有氨苄青黴素(50μg/mL)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；40μg/mL)、IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；100μM)的L-肉湯瓊脂培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂)選擇經轉化的大腸桿菌。由此分離的轉化大腸桿菌菌落使用含有氨苄青黴素(50μg/mL)的L-肉湯液體培養基(1％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)培養。使用質粒純化試劑盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)自增殖的轉化大腸桿菌菌體分離純化質粒DNA，獲得一定量的DNA片段-A2。
(3)分析克隆的DNA片段-A2的鹼基序列將前項(2)所獲得的DNA片段-A2的鹼基序列使用分析裝置(PEBiosystems 377XL)通過染料終止子循環測序法分析DNA鹼基序列。雖然通過電泳測定的PCR反應所擴增DNA片段-A2為約300bp，但鹼基序列分析的結果表明確切地為325bp(參見序列編號2的鹼基837～鹼基1161)。由於在所克隆的上述325bp DNA序列的兩端發現有與進行上述PCR反應時使用的2種引物對應的DNA序列，因此明確了上述PCR反應中DNA片段-A2是由這2種引物(5Dm-3F和5D-1R)特異性擴增的。
(4)DNA片段-A2鄰近區域的分析如上所述，確定了Mer-11107株來源的編碼具有羥化活性的蛋白質的部分DNA序列，通過反向PCR法(細胞工學14卷，p.591-593，1995年)擴增位於克隆片段上遊、下遊區域的鄰近區域鹼基序列，並克隆、序列分析。即，將Mer-11107株染色體DNA(參見(1))於K緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM KCl)中使用限制酶BamHI、於H緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶SalI分別消化。獲得的各限制酶切斷的DNA片段使用DNALigation Kit ver.2(寶酒造社)使自身環化。
另外，通過DNA片段-A2的鹼基序列，設計並製備引物(7PIN-2F(序列編號13)和6PIN-2R(序列編號7))。
接下來，使用這2種引物(7PIN-2F和6PIN-2R)，以上述自身環化的Mer-11107株染色體DNA為模板，進行PCR反應。PCR反應使用Takara LATaq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、68℃退火和延伸5分鐘的2階段反應重複35次。
結果擴增到約1.3kbp大小的DNA片段(DNA片段-B2)和約1.4kbp大小的DNA片段(DNA片段-C2)，它們很可能是具有這樣DNA序列的DNA，所述DNA序列包含編碼具有羥化活性的蛋白質的DNA以及其上遊和下遊區域。
通過SUPREC PCR(寶酒造社)自該PCR擴增反應液回收DNA片段-B2和DNA片段-C2。接下來，對所獲得的DNA片段-B2和DNA片段-C2，為了獲得足量的用於鹼基序列分析的各DNA片段，與上述(2)同樣地使用質粒載體pT7Blue T(Novagen公司)、DNA Ligation kit ver.2(寶酒造社)、大腸桿菌JM109株和質粒純化試劑盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)，獲得一定量的各DNA片段。
(5)DNA片段-B2(約1.3kbp大小)和DNA片段-C2(約1.4kbp大小)的鹼基序列分析將前項(4)所獲得的DNA片段-B2和DNA片段-C2的鹼基序列使用DNA鹼基序列分析裝置(PE Biosystems 377XL)通過染料終止子循環測序法分析。通過如此進行鹼基序列的分析，自DNA片段-B2和DNA片段-C2序列獲得了序列編號2所示的2329bp鹼基序列的情報。
對該2329bp中的可讀框(ORF)進行檢索，確定了有2種蛋白質得到編碼。將這些蛋白質的胺基酸序列通過BLAST search檢索的結果為序列編號2的鹼基420～鹼基1604中存在編碼包含與細胞色素P450具有高同源性的395個胺基酸的蛋白質的ORF(以下稱為bpmA)。由此，bpmA與自A-1544株分離的psmA的胺基酸序列具有最高的同源性(同源性67.4％)，與灰色鏈黴菌的細胞色素P450soy(SoyC)具有比較高的同源性(同源性64.8％)。由此認為bpmA為編碼細胞色素P450類羥化酶的可能性高。
另外，在緊挨bpmA的下遊(序列編號2的鹼基1643～鹼基1834)存在編碼與3Fe-4S類的鐵氧還蛋白具有高同源性的蛋白質的ORF(以下稱為bpmB)。bpmB編碼的蛋白質包含64個胺基酸，與自A-1544株分離的psmB胺基酸序列具有最高的同源性(同源性81.0％)，而且與推定為天藍色鏈黴菌A3(2)細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列的緊下遊推定為鐵氧還蛋白的胺基酸序列具有比較高的同源性(76.2％)。因此認為bpmB用於電子轉移，與bpmA一起實施羥化。
實施例8製備具有bpmA和bpmB的轉化體(1)製備含有Mer-11107株來源的bpmA和bpmB這兩者的DNA片段參考實施例7中分析的序列編號2的鹼基序列，設計並製備5』末端添加有NdeI位點的引物07-NdeF(序列編號14)和5』末端添加有SpeI位點的引物07-SpeR(序列編號15)。接下來，使用這2種引物(07-NdeF和07-SpeR)，以實施例7(1)獲得的Mer-11107株染色體DNA為模板，進行PCR反應。PCR反應使用Takara LA Taq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、68℃退火和延伸2分鐘的2階段反應重複進行30次。
結果擴增了含bpmA和bpmB的約1.5kbp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-D2)。通過SUPREC PCR(寶酒造社)自該PCR擴增反應液回收DNA片段-D2。
(2)質粒pTC-D07的構建將pT7NS-CamAB(參見WO03/087381)於H緩衝液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶NdeI和SpeI消化，獲得質粒消化物。同樣地，將前項(1)所獲得的DNA片段-D2使用限制酶NdeI和SpeI消化，並使用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)連接所獲得的DNA片段-D2的消化物和質粒消化物。由此，構建了內部含有bpmA和bpmB兩者的DNA片段-D2和質粒pT7NS-CamAB連接在一起的約9.5kbp大小的質粒(稱為質粒pTC-D07)。
(3)大腸桿菌轉化株BL21(DE3)/pTC-D07的製備使用前項(2)製備的質粒pTC-D07轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(Novagen公司)。由此獲得了經質粒pTC-D07轉化的大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-D07株。
實施例9通過具有bpmA和bpmB的大腸桿菌轉化體自大環內酯類化合物11107B向11107D轉化實施例8(3)得到的經轉化大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-D07株和BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的凍結種子接種於15mL容量試管中裝有的含氨苄青黴素50μg/mL的3mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，37℃振蕩培養20小時。將該種母培養液500μL接種於250mL容量的三角瓶中裝有的含氨苄青黴素50μg/mL的50mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，32℃振蕩培養4小時後，依次添加100mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙醯丙酸50μL，32℃振蕩培養5小時。離心分離(5000轉/分鐘、10分鐘)得到的培養液，收集菌體。將菌體懸浮於100mM磷酸緩衝液(pH6.1)1.75mL中，向其中添加80％甘油250μL、40mg/mL大環內酯類化合物11107B 12.5μL。這樣得到的轉化反應液於28℃反應24小時。用甲醇600μL提取反應液400μL，通過HPLC測定大環內酯類化合物11107B和11107D的量。測定結果示於表6。另外，HPLC的詳細條件如下所示。
分析裝置Shimadzu HPLC 10Avp柱Develosil ODS UG-3(φ4.6mm×250mm 3μm)流動相45％～55％ 甲醇(0～5分鐘)
55％甲醇(5～13分鐘)55％～70％甲醇(13～17分鐘)70％甲醇(17～21分鐘)45％甲醇(21～25分鐘)流速1.2ml/分鐘檢測UV240nm注射體積5μL柱溫度40℃分析時間25分鐘保留時間11107B12.2分鐘11107D4.2分鐘表6

結果，作為對照的大腸桿菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株沒有獲得大環內酯類化合物11107D的峰，而含有bpmA和bpmB的BL21(DE3)/pTC-D07株獲得了大環內酯類化合物11107D的峰。這暗示bpmA和bpmB參與自大環內酯類化合物11107B向11107D轉化。
實施例10確定自A-1560株(FERM BP-10102)來源的基因的鹼基序列(1)製備A-1560株的染色體DNA向包含葡萄糖1％、麥芽汁0.4％、酵母提取物1％的培養基接種A-1560株，於28℃培養3天。將獲得的培養液3000轉/分鐘離心10分鐘收集菌體。使用Blood Cell Culture kit(QIAGEN公司)自該菌體製備染色體DNA。
(2)克隆編碼具有大環內酯類化合物11107的16位羥化活性的蛋白質的DNA的部分序列參考推定的天藍色鏈黴菌A3(2)細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列，設計並製備混合引物(5Dm-3F(序列編號4)和5Dm-2R(序列編號16)。
由於考慮密碼子的變動可提高反應性，使用了混合鹼基S(＝C+G)、Y(＝C+T)。
接下來，使用這2種引物(5Dm-3F和5Dm-2R)並以上述(1)獲得的A-1560株染色體DNA為模板進行PCR反應。PCR反應使用Takara LA Taq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、50℃退火2分鐘、68℃延伸30秒的3階段反應重複進行35次。結果擴增到約750bp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-A3)。該DNA片段-A3具有很高可能性為編碼具有羥化活性的蛋白質的DNA的一部分。PCR反應所擴增的DNA片段-A3通過SUPREC PCR(寶酒造社)自反應液回收。
接下來，為了獲得對產生的DNA片段-A3進行鹼基序列分析的足量DNA片段-A3，使用DNA Ligation kit ver.2(寶酒造社)將DNA片段-A3連接入質粒載體pT7Blue T(Novagen公司)，轉化大腸桿菌JM109株。然後，使用含有氨苄青黴素(50μg/mL)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷；40μg/mL)、IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；100μM)的L-肉湯瓊脂培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂)選擇所轉化的大腸桿菌。將由此分離的轉化大腸桿菌的菌落用含有氨苄青黴素(50μg/mL)的L-肉湯液體培養基(1％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)培養。使用質粒純化試劑盒(QIAfilter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)自增殖的轉化大腸桿菌菌體分離純化質粒DNA，獲得一定量的DNA片段-A3。
(3)經克隆的DNA片段-A3的鹼基序列分析將前項(2)所獲得的DNA片段-A3的鹼基序列使用分析裝置(PEBiosystems 377XL)通過染料終止子循環測序法分析DNA鹼基序列。雖然通過電泳測定的PCR反應所擴增DNA片段-A3為約750bp，但鹼基序列分析的結果表明確切地為741bp(參見序列編號3的鹼基616～鹼基1356)。由於在所克隆的上述741bp DNA序列的兩端發現有與進行上述PCR反應時使用的2種引物對應的DNA序列，因此明確了上述PCR反應中DNA片段-A3是由這2種引物(5Dm-3F和5Dm-2R)特異性擴增的。
(4)DNA片段-A3的鄰近區域的分析如上所述，由於確定了編碼來自A-1560株的、具有羥化活性的蛋白質的部分DNA序列，通過反向PCR法(細胞工學14卷，p.591-593，1995年)對延伸至克隆片段的上遊、下遊域的鄰近區域的鹼基序列進行擴增、克隆、序列分析。即，將A-1560株染色體DNA(參見(1))於K緩衝液(50mMTris-HCl，pH8.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM KCl)中使用限制酶BamHI、於L緩衝液(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇)中使用限制酶KpnI、於H緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中使用限制酶SalI分別消化。將獲得的各限制酶切斷的DNA片段使用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造社)進行自身環化。
另一方面，自DNA片段-A3的鹼基序列設計並製備引物(5PIN-2F(序列編號17)和6PIN-2R(序列編號7))。
接下來，使用這2種引物(5PIN-2F和6PIN-2R)並以上述經自身環化的A-1560株染色體DNA作為模板進行PCR反應。PCR反應使用了Takara LATaq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、68℃退火和延伸5分鐘的2階段反應重複35次。
結果擴增了約4.5kbp大小的DNA片段(DNA片段-B3)、約3.0kbp大小的DNA片段(DNA片段-C3)和約1.7kbp大小的DNA片段(DNA片段-D3)，它們極有可能為編碼具有羥化活性的蛋白質的DNA以及具有包含其上遊和下遊區域的DNA序列的DNA。
通過SUPREC PCR(寶酒造社)自該PCR擴增反應液回收DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3。接下來，為了獲得足量用於鹼基序列分析的各DNA片段DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3，與上述(2)同樣，使用質粒載體pT7Blue T(Novagen公司)、DNA Ligation kitver.2(寶酒造社)、大腸桿菌JM109株和質粒純化試劑盒(QIAfilter PlasmidMidi Kit，QIAGEN公司)，獲得一定量的各DNA片段。
(5)DNA片段-B3(約4.5kbp大小)、DNA片段-C3(約3.0kbp大小)和DNA片段-D3(約1.7kbp大小)的鹼基序列分析將前項(4)所得的DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3的鹼基序列使用DNA鹼基序列分析裝置(PE Biosystems 377XL)，通過染料終止子循環測序法分析。進行這樣的鹼基序列分析了解到自DNA片段-B3、DNA片段-C3和DNA片段-D3的序列中得到序列編號3所示的1860bp的鹼基序列這一情報。
對該1860bp中的可讀框(ORF)進行檢索，確定了有2種蛋白質得到編碼。將這些蛋白質的胺基酸序列通過BLAST search檢索的結果為序列編號3的鹼基172～鹼基1383中存在編碼包含與細胞色素P450具有高同源性的404個胺基酸的蛋白質的ORF(以下稱為tpmA)。TpmA與推定為天藍色鏈黴菌A3(2)的細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列具有最高的同源性(同源性77.4％)、與自A-1544株分離的psmA的胺基酸序列也具有高的同源性(同源性76.6％)。由此認為tpmA為編碼細胞色素P450類的羥化酶的基因的可能性高。
另外，在緊挨tpmA的下遊(序列編號3的鹼基1399～鹼基1593)存在編碼與3Fe-4S類的鐵氧還蛋白具有高同源性的蛋白質的ORF(以下稱為tpmB)。tpmB編碼的蛋白質包含65個胺基酸，與自A-1544株分離的psmB的胺基酸序列具有最高的同源性(同源性81.0％)，與緊挨推定為天藍色鏈黴菌A3(2)細胞色素P450(CYP105D5)的胺基酸序列下遊的推定為鐵氧還蛋白的胺基酸序列也具有高同源性(82.5％)。因此認為tpmB用於電子轉移，編碼與tpmA一同進行羥化的鐵氧還蛋白。
實施例11製備具有tpmA和tpmB的轉化體(1)製備含有A-1560株來源的tpmA和tpmB這兩者的DNA片段參考實施例10中分析的序列編號3的鹼基序列，設計並製備了在5』末端添加有NdeI位點的引物tpm-NdeF(序列編號18)和5』末端添加有SpeI位點的引物tpm-SpeR(序列編號19)。接下來，利用這2種引物(tpm-NdeF和tpm-SpeR)並以實施例10(1)所獲得的A-1560株染色體DNA為模板，進行PCR反應。PCR反應使用Takara LA Taq(寶酒造社)和PCR擴增裝置(Biometra社T Gradient)，將98℃變性20秒、68℃退火和延伸2分鐘的2階段反應重複進行30次。
結果擴增到包含tpmA和tpmB的約1.5kbp大小的DNA片段(以下稱為DNA片段-E3)。自該PCR擴增反應液通過SUPREC PCR(寶酒造社)回收DNA片段-E3。
(2)質粒pTC-tpmAB的構建將pT7NS-CamAB(參見WO03/087381)在H緩衝液(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，100mM NaCl)中通過限制酶NdeI和SpeI消化得到質粒消化物。同樣地，將前項(1)所得的DNA片段-E3的消化物和質粒消化物使用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)連接。由此，構建了內部含有tpmA和tpmB這兩者的DNA片段-E3和質粒pT7NS-CamAB連接的約9.5kbp大小的質粒(稱為質粒pTC-tpmAB)。
(3)大腸桿菌轉化株BL21(DE3)/pTC-tpmAB的製備使用實施例11(2)製備的質粒pTC-tpmAB轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(Novagen公司)。由此獲得了經質粒pTC-tpmAB轉化的大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-tpmAB株。
實施例12通過具有tpmA和tpmB的大腸桿菌轉化體進行11107B向11107D的轉化前項(3)得到的經轉化大腸桿菌BL21(DE3)/pTC-tpmAB株、以及BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株的凍結種子接種於15mL容量試管中裝有的含氨苄青黴素50μg/mL的3mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，37℃振蕩培養20小時。將該種母培養液500μL接種於250mL容量的三角瓶中裝有的含氨苄青黴素50μg/mL的50mL L-肉湯培養基(1.0％細菌用胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)中，32℃振蕩培養4小時後，依次添加100mM IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)50μL、80mg/mL 5-氨基乙醯丙酸50μL，32℃振蕩培養5小時。離心分離(5000轉/分鐘、10分鐘)得到的培養液，收集菌體。將菌體懸浮於100mM磷酸緩衝液(pH6.1)1.75mL中，向其中添加80％甘油250μL、40mg/mL 11107B12.5μL。這樣得到的轉化反應液於28℃反應24小時。用甲醇600μL提取反應液400μL，通過HPLC測定11107B和11107D的量。測定結果如表7所示。另外，HPLC的詳細條件如下所示。
分析裝置Shimadzu HPLC 10Avp柱Develosil ODS UG-3(φ4.6mm×250mm 3μm)流動相45％～55％甲醇(0～5分鐘)55％甲醇(5～13分鐘)55％～70％甲醇(13～17分鐘)70％甲醇(17～21分鐘)45％甲醇(21～25分鐘)流速1.2ml/分鐘檢測UV240nm注射體積5μL柱溫度40℃分析時間25分鐘保留時間11107B12.2分鐘11107D4.2分鐘表7

結果表明，作為對照的大腸桿菌BL21(DE3)/pT7NS-CamAB株未獲得11107D的峰，與之相反，含有tpmA和tpmB的BL21(DE3)/pTC-tpmAB株可獲得11107D的峰。這暗示tpmA和tpmB參與自11107B向11107D的轉化。
實施例13通過自身克隆株進行下式表示的自11107H向11107CB的轉化
(1)轉化體反應液的製備製備包含stabilose 2.0％、葡萄糖2.0％、大豆粉(Honen Soypro)2.0％、酵母提取物0.5％、CaCO30.32％的pH 7.4的培養基，向250mL三角瓶中加入25mL培養基，121℃20分鐘加熱滅菌。向該培養基添加硫鏈絲菌肽，使其終濃度為25mg/L後，按1％接種A-1544/pIJDMG株凍結種子，28℃、220轉/分鐘進行種母培養3天。將該種母培養液以1％添加至同樣組成的培養基，28℃、220轉/分鐘進行2天培養。該培養結束後，自培養液通過離心分離菌體而集菌，並懸浮於pH 6.5的磷酸緩衝液20mL中。向該菌體懸浮液添加底物11107H(100g/L DMSO溶液)至終濃度2000mg/L，於28℃、220轉/分鐘進行16小時的轉化反應。
(2)自轉化體反應液獲得大環內酯類化合物11107CB自實施同樣操作的轉化反應液(6個燒瓶)離心分離菌體，使用等量的乙酸乙酯提取離心上清2次。濃縮提取液後，通過薄層層析(MERCKSilicagel 60 F254』0.5mm展開液；甲苯∶丙酮＝1∶1)純化，得到11107CB119.5mg。
ESI-MS m/z 573(M+Na)+1H-NMR譜(CD3OD，500MHz)δppm(積分，多重度，結合常數J(Hz))0.81(3H，d，J＝6.7Hz)，0.89(3H，d，J＝7.0)，0.94(3H，t，J＝7.4Hz)，1.25(3H，s)，1.30-1.20(1H，m)，1.33(3H，s)，1.55-1.40(2H，m)，1.65(1H，dd，J＝6.3，14.0Hz)，1.75(3H，s)，1.88(1H，dd，J＝5.4，14.0Hz)，2.07(3H，s)，2.68-2.40(4H，m)，2.89(1H，m)，3.51(1H，m)，4.51(1H，m)，4.97(1H，d，J＝8.6Hz)，4.99(1H，d，J＝9.3Hz)，5.30(1H，dd，J＝9.7，15.2Hz)，5.52(1H，dd，J＝9.4，15.2Hz)，5.58(1H，dd，J＝1.9，15.5Hz)，5.78(1H，dd，J＝2.8，15.5Hz)，5.85(1H，d，J＝15.3Hz)，6.07(1H，d，J＝11.0Hz)，6.51(1H，dd，J＝11.0，15.3Hz)實施例14通過自身克隆株進行下式表示的自11107L向11107CG的轉化 (1)轉化體反應液の製備製備包含stabilose 2.0％、葡萄糖2.0％、大豆粉(Honen Soypro).0％、酵母提取物0.5％、CaCO30.32％的pH 7.4的培養基，向250mL三角瓶中加入25mL培養基，121℃ 20分鐘加熱滅菌。向該培養基添加硫鏈絲菌肽，使其終濃度為25mg/L後，按1％接種A-1544/pIJDMG株凍結種子，28℃、220轉/分鐘進行種母培養3天。將該種母培養液以1％添加至同樣組成的培養基，28℃、220轉/分鐘進行2天培養。該培養結束後，自培養液通過離心分離菌體而集菌，並懸浮於pH 6.5的磷酸緩衝液20mL中。向該菌體懸浮液添加底物11107L(100g/L DMSO溶液)至終濃度1600mg/L，於28℃、220轉/分鐘進行16小時的轉化反應。
(2)自轉化體反應液獲得大環內酯類化合物11107CG自該轉化反應液離心分離菌體，使用等量的乙酸乙酯提取離心上清2次。濃縮提取液後，通過薄層層析(MERCK Silicagel 60 F254』0.25mm展開液；甲苯∶丙酮＝1∶1)純化，得到11107CG 25mg。
ESI-MS m/z 633(M+Na)+1H-NMR譜(CD3OD，500MHz)δppm(積分，多重度，結合常數J(Hz))0.88(3H，d，J＝6.7Hz)，0.90(3H，d，J＝7.0Hz)，0.94(3H，d，J＝7.4Hz)，1.18(3H，s)，1.30-1.20(1H，m)，1.34，(3H，s)，1.56-1.40(2H，m)，1.66(1H，dd，J＝6.2，14.0Hz)，1.79-.169(2H，m)，1.81(3H，d，J＝1.0Hz)，1.86(1H，dd，J＝5.4，14.0Hz)，2.05(3H，s)，2.08(3H，s)，2.52(1H，dd，J＝4.2，15.2Hz)，2.64-2.55(1H，m)，2.67(1H，dd，J＝2.2，7.9Hz)，2.78(1H，dd，J＝3.0，15.2Hz)，2.90(1H，dt，J＝2.2，5.6Hz)，3.52(1H，dt，J＝4.4，8.8Hz)，3.75(1H，m)，4.98(1H，dd，J＝2.8，11.3Hz)，5.08(1H，d，J＝9.7Hz)，5.13(1H，d，J＝9.6Hz)，5.61(1H，dd，J＝9.9，15.2Hz)，5.75(1H，dd，J＝9.7，15.2Hz)，5.88(1H，d，J＝15.3Hz)，6.13(1H，d，J＝11.0Hz)，6.54(1H，dd，J＝11.0，15.3Hz)產業上的可利用性通過使用攜帶本發明DNA的質粒轉化的轉化體，可以高效產生具有極好抗腫瘤活性的、在水溶液中穩定性也極好的16位帶羥基的12元環大環內酯化合物。
序列表110美露香株式會社110衛材株式會社120參與大環內酯類化合物的羥化作用的DNA13004063PCT150JP 2003-3968281512003-11-271601921012113793212DNA213鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)220
221CDS222(1322)..(2548)220
221CDS222(2564)..(2761)4001ctgcagctcg acgtgcgggt cggacttcac gttgaagtac cagaccggat gcttgggcgc 60accgcccagc gaggcgaccg ccgcgtaact cccctcgtgc tcgacccgca tcagcggcgt120cttgcggatc tttccgctgc gcgcgccccg ggtggtgagc acgatgaccg gcagcccggt180gtcccgcagc gtggtgccct tggtgccccc ggaactctcg tacagctcga cctgctcgcg240cacccactgc gtcgggctgg gctcgtactc gccctcaagt ggcaagggat ccgtctcctt300cgtcggtccg gcggatggtg ctccggacgg tcccaactcc cgcggccgcc cggatcatcc360gtaccgcatg ccccttcgcc cgagcgggtg atcaccgttc cggccatccg gtcgtccgca420ccgcgagcac caggatcacg gcgctggaga gcagggccgt gaccagccgc ccccggtggc480ccgtcagggc gcgacccagc agcgcgcccc cgcccgccag cagtagctgc cagctcgcgg540acgcggcgaa ggccgccgcg gcgaacaccg cccgtttcag cggccgtgcc gcaccggcgg600cgccgctgcc gagcaccagc gccacgaagt agaccaccgt catgggattg agcagggtga660tcccgagaag gccgagataa gcccctgccg cgcctggaac cggccgttcc gggcgggtgg720tgagccgatg ggcgcggtac tgccgcaggg cgagcagcgc cgcccgcagc gcgagcaccg780cgaggaccag cgccgaggcc cagcgcagcg ggtccagcac cggccgcagc tgtgccgcga840gggcggcgcc gcccacggtc gcgagcagcg cgtacagccc gtcggccgtg gcgacgccga900gcgccgccga ggcgccggtg cgcagcgagg tgcgggcggt gagggagacc agataggtcc960cgaccgcgcc gacgggcacc gcgatgccgt acccggcgag caggcccgcg agcagcgcgc 1020ccgtcacggg cgtgcgggac tggttcctcc ggggacggcg gggctgctgt cggcccggca 1080
ccgcgggggc ggtggcagcg ggcgtcggca ggagggaggc tgtaggaggc atgggccgat1140cctggggccg ccgcgcccgc accggcaaat gaattacggc gcgttccagc ccccggccgg1200ctcgctcttc ggccacttca ccgcgtacgg cgatctggcc gaacttgctg tcgccccata1260ggtgcctcgg gcatctaatg aagatcggca cgacgcacct cttcgtctgc gaggtctttc1320c atg acg gaa ctg acg gac atc acc ggc ccg ggg acc ccg gcc gaa1366Met Thr Glu Leu Thr Asp Ile Thr Gly Pro Gly Thr Pro Ala Glu1 5 10 15ccc gtc gca ttc ccc cag gac cgc acc tgc ccc tac cac ccc ccc acc 1414Pro Val Ala Phe Pro Gln Asp Arg Thr Cys Pro Tyr His Pro Pro Thr20 25 30gga tac ggc ccg ctg cgc gac ggg cgc agc ctg tcc cgc gtc acc ctc 1462Gly Tyr Gly Pro Leu Arg Asp Gly Arg Ser Leu Ser Arg Val Thr Leu35 40 45ttc gac ggc cgc gag gtc tgg atg gtc acg ggc cac gcc acc gcc cgc 1510Phe Asp Gly Arg Glu Val Trp Met Val Thr Gly His Ala Thr Ala Arg50 55 60gcg ctg ctc gcg gac ccc cgg ctg tcc acc gac cgc acc ctc ccg ggc 1558Ala Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg Thr Leu Pro Gly65 70 75ttc ccc gtg ccc acg gcc cgc ttc gcg gcc gtc cgc gac cgg cgg gtg 1606Phe Pro Val Pro Thr Ala Arg Phe Ala Ala Val Arg Asp Arg Arg Val80 85 90 95gcg ctg ctc ggc gtg gac gac ccg gtc cac cag acc cag cgg cgg atg 1654Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Val His Gln Thr Gln Arg Arg Met100 105 110atg atc ccg tcg ttc acc ctc aag cgc gcg gcc ggg ctg cgg ccc acc 1702Met Ile Pro Ser Phe Thr Leu Lys Arg Ala Ala Gly Leu Arg Pro Thr115 120 125atc cag cgg acc gtc gac ggg ctg ctg gac gcg atg atc gag aag ggg 1750Ile Gln Arg Thr Val Asp Gly Leu Leu Asp Ala Met Ile Glu Lys Gly130 135 140ccg ccg gcc gag ctg gtc tcc gcc ttc gcc ctg ccc gtg ccc tcg gtg 1798Pro Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Val145 150 155gtc atc tgc ggc ctg ctc ggc gtg ccg tac gcc gac cac gag ttc ttc 1846Val Ile Cys Gly Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe160 165 170 175gag gaa cag tcc cgc acg ctg ctg cgc ggt ccc acg gcc gcc gac tcg 1894Glu Glu Gln Ser Arg Thr Leu Leu Arg Gly Pro Thr Ala Ala Asp Ser180 185 190caa ggg gcg cgc gag cgg ctc gag gag tac ctc ggc ggg ctg atc gac 1942Gln Gly Ala Arg Glu Arg Leu Glu Glu Tyr Leu Gly Gly Leu Ile Asp195 200 205gac aag gag cgg cag gcc gaa ccc ggc gac ggc gtc ctg gac gac ctc 1990Asp Lys Glu Arg Gln Ala Glu Pro Gly Asp Gly Val Leu Asp Asp Leu210 215 220
gtc cac cag cgg ctg cgc acc ggc gag ctg gac cgg cgc gac gtg gtg 2038Val His Gln Arg Leu Arg Thr Gly Glu Leu Asp Arg Arg Asp Val Val225 230 235gcg ctg gcc gtc atc ctg ctc gtg gcc ggg cac gag acg acc gcc aac 2086Ala Leu Ala Val Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn240 245 250 255atg atc tcc ctc ggc acc tac acg ctg ctg cgg cac ccc ggc cgg ctg 2134Met Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Arg His Pro Gly Arg Leu260 265 270gcc gag ctg cgc gcc gac ccg gcg ctg ctg ccc gcc gcc gtg gag gag 2182Ala Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu Glu275 280 285ctg atg cgg atg ctc tcg atc gcg gac ggg ctg ctg cgc ctg gcc ctg 2230Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Leu Ala Leu290 295 300gag gac atc gag atc gcc ggc gcc acg atc cgg gcc ggc gag ggc gtc 2278Glu Asp Ile Glu Ile Ala Gly Ala Thr Ile Arg Ala Gly Glu Gly Val305 310 315ctg ttc tcc acc tcg ctg atc aac cgc gac gag tcc gtg ttc gac gac 2326Leu Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Glu Ser Val Phe Asp Asp320 325 330 335ccc gac acc ctg gac ttc cac cgc tcc acc cgc cac cac gtg gcc ttc 2374Pro Asp Thr Leu Asp Phe His Arg Ser Thr Arg His His Val Ala Phe340 345 350ggt ttc ggc atc cac cag tgc ctg ggc cag aac ctg gcc cgc gcc gag 2422Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala Glu355 360 365ctg gag atc gcc ctg ggc acg ctc ctg gag cgg ctc ccc ggc ctc cgg 2470Leu Glu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Glu Arg Leu Pro Gly Leu Arg370 375 380ctg gcc gcg ccc gcc gag gag atc ccg ttc aaa ccc ggc gac acg atc 2518Leu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ile Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile385 390 395cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtg acc tgg taa gaggctctgg tc atg cac2569Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val Thr Trp Met His400 405 410atc gac atc gac aag gac cgc tgc atc ggc gcc ggc cag tgc gcg ctg 2617Ile Asp Ile Asp Lys Asp Arg Cys Ile Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu415 420 425gcc gcc ccg ggc gtg ttc acc cag gac gac gac ggc tac agc acc ctg 2665Ala Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln Asp Asp Asp Gly Tyr Ser Thr Leu430 435 440ctc ccc ggc cgc gag gac ggc ggg ggc gac ccg atg gtc cgg gag gcg 2713Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Gly Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala445 450 455gcc cgc gcc tgc ccg gtg agc gcc atc cgg gtg acc gaa ccg gcc ggc 2761
Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala Ile Arg Val Thr Glu Pro Ala Gly460 465 470 475tga ggcggggccc ggcggccgcg gcccgctgcc gggaccgccg ttcccagttc agtagg2820gtcgtgcgat gacctcacag gccgggaagc ccttcctcta cgtcgtcgtc tgcgcggccg2880ggaccgccgc cggagtcacc acgctgatcg gcgccgccca ggcgcggggc tgggaggtgg2940gggtcctggc cacgccggtg gcgatgggcg ggttcttcga cacggctgcg gtcgaggaga3000tgacgggccg gcccatccgc tcggcctggc gctcgccggc cgatccgcgc ccgttcccgc3060cgccgggcgc cgtggtggtg gcgcccgcca ccttcaacac cgtcaacaag tgggcggccg3120gtctcgccga cacgctcgcc gtcggcacgc tctgcgaggc ggcgggcctc ggcgtgccga3180tcgccgtcct gccctgcgtg gcggacgcgc tggccgccca ccccgcgtac cgggagggcc3240ttctccggct gcgtgggatg ggcgtccgct tcggcgagcc gtacgccggc ccgccggggg3300aggacggcga ggcggacggc gcacggcccg ggttcgcctg ggagaacgcc ctggacctgc3360tggagcgggc ctgaacccgc tccccgaccc gtagggcctg tctgacactg tcagacaggc3420cctaacggca ggtcagcgcc ggcccggcca gcatgccgcc ggtgtagagg tcctggcccc3480gcggcagcca gtagcccagc ctggagacca ccgtggagca gtcaggcccg acggtgacgc3540ggaccttcac cgtctcggga cggccgggct gcagcgcggt cagcgcgcag tccagggagt3600acgcgagccg ggtcttcgag gtaccggccg accagcgggt tgacgcagcg ggcgtcgtcc3660gtggcgatcc gcaccccggt gcccgccccg ccgatgagtc cgagccgggc gctgccgtcg3720ccctcgtcgc tgtcccggcg gaccgtgtag gtcagcgtgg tggtggcgtc gcgccgcagg3780gtgtccggtc gac 379321022112329212DNA213鏈黴菌屬220
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221CDS222(1643)..(1834)4002ggatccacgg gtggccgccg cgctcgcccg ggtgaccgac cggcgtatcg gctatgtcgc 60cgcgctcttc gcggcgctgg gcttccccga gggcgaggcg cgggaccgcg gcctgctggc120gtacaccgcc tacctcggcc acacccagct cggacatgcc gtccgacaga gcctgccggc180cgaggcggca cacgaccgct atctggatgg cgtgatcgac accctcgtac ggccgcggga240cggaggcgat gaagccgaac atgtcacaat ctgaacgagg ttggcggaac tgcgcgcaga300acatgcccgg tatccgcggc atgaggtgag atcggcgcgg cgaaacacgg tgcgccacag360cgttgccatc tcacacacga gcaactcgag ccacttgaga ctcgtacggg aggaaattc 419
gtg acc gaa gcc atc ccc tac ttt cag aac cgc acc tgt ccc tac cac 467Val Thr Glu Ala Ile Pro Tyr Phe Gln Asn Arg Thr Cys Pro Tyr His1 5 10 15ccg ccc gcc gcc tat cag cca ctg cgc ggg gcc ggc ccg ctg agc cat 515Pro Pro Ala Ala Tyr Gln Pro Leu Arg Gly Ala Gly Pro Leu Ser His20 25 30gtc acg ttc tac gac ggc cgg aag gtg tgg gcg gtc acc ggc cac ccc 563Val Thr Phe Tyr Asp Gly Arg Lys Val Trp A1a Val Thr Gly His Pro35 40 45gag gca cgg gcg ctg ctg acc gac cag cga ctc tcc gcc gac cgg cag 611Glu Ala Arg Ala Leu Leu Thr Asp Gln Arg Leu Ser Ala Asp Arg Gln50 55 60aac ccg gcc ttc ccg gtc ccc ttc gaa cgc ttc gcg gcc atc cgc cgg 659Asn Pro Ala Phe Pro Val Pro Phe Glu Arg Phe Ala Ala Ile Arg Arg65 70 75 80gtc cgg acg ccg ctg atc ggg gtc gac gac ccg gag cac aac acc cag 707Val Arg Thr Pro Leu Ile Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr Gln85 90 95cgc cgg atg ctg atc ccc agc ttc agc ctc aag cgg acc gcc gca ctg 755Arg Arg Met Leu Ile Pro Ser Phe Ser Leu Lys Arg Thr Ala Ala Leu100 105 110cgg ccg gag atc cag cgg atc gtc gac ggg ctg ctc gac cgg atg ctg 803Arg Pro Glu Ile Gln Arg Ile Val Asp Gly Leu Leu Asp Arg Met Leu115 120 125gat cag ggc ccg ccc acc gag ctg gtc tcc gcg ttc gcc ctg ccg gtc 851Asp Gln Gly Pro Pro Thr Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro Val130 135 140ccg tcg atg gtg atc tgc gca ctg ctc gga gtc tca tac gcc gac cat 899Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Ser Tyr Ala Asp His145 150 155 160gag ttc ttc gag gag gag tcc cgc cgc atc ctg cgc ggc cgg tcg gcc 947Glu Phe Phe Glu Glu Glu Ser Arg Arg Ile Leu Arg Gly Arg Ser Ala165 170 175gag gag gcg gag gac gcc cgg ctg aag ctg gag gag tac ttc acc ggg 995Glu Glu Ala Glu Asp Ala Arg Leu Lys Leu Glu Glu Tyr Phe Thr Gly180 185 190ctg atc gcc gcc aag gag aag aac ccg ggc gac ggg ctg ctg gac gag 1043Leu Ile Ala Ala Lys Glu Lys Asn Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu195 200 205ctg atc gag gac cgg ctg cgg acc ggc gcg ctc acc cgc gac gag ctg 1091Leu Ile Glu Asp Arg Leu Arg Thr Gly Ala Leu Thr Arg Asp Glu Leu210 215 220gtc cgg ctc gcc atg atc ctg ctg gtg gcc ggc cat gag acc acc gcc 1139Val Arg Leu Ala Met Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala225 230 235 240aac atg atc tcg ctc ggc acc ttc acc ctg ctg gac cac ccc gag cag 1187
Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Asp His Pro Glu Gln245 250 255ctg gcg cag ctc aag gcc gac gag ggc ctg atg ccg gcc gcc atc gag 1235Leu Ala Gln Leu Lys Ala Asp Glu Gly Leu Met Pro Ala Ala Ile Glu260 265 270gag ctg ctg cga ttc ctg tcc atc gcg gac ggc ctg ctg cgg gtg gcg 1283Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala275 280 285acg gag gac atc gag atc ggc ggt cag gtg atc cgg gcc gac gac gcg 1331Thr Glu Asp Ile Glu Ile Gly Gly Gln Val Ile Arg Ala Asp Asp Ala290 295 300gtc ctg ttc ccc gcc tca ctg atc aac cgg gac gag gcc gcc tat ccg 1379Val Leu Phe Pro Ala Ser Leu Ile Asn Arg Asp Glu Ala Ala Tyr Pro305 310 315 320gca ccc gac gag ctg gac ctc ggc cgt tcg gcc cgc cat cac gtg gcg 1427Ala Pro Asp Glu Leu Asp Leu Gly Arg Ser Ala Arg His His Val Ala325 330 335tcc ggc ttc ggg atc cac cag tgc ctg ggg cag aac ctc gcc cgc gcg 1475Ser Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg Ala340 345 350gag atg gag atc gcg ctg cgc tca ctg ttc acc agg atc ccg cag ctg 1523Glu Met Glu Ile Ala Leu Arg Ser Leu Phe Thr Arg Ile Pro Gln Leu355 360 365cgg ctc gcc gtg ccg gcc gcc gag att ccg ttc aag gac gga gac acc 1571Arg Leu Ala Val Pro Ala Ala Glu Ile Pro Phe Lys Asp Gly Asp Thr370 375 380ctg caa ggc atg atc gaa ctg ccg ctg gcc tgg tag cagccaggac ggcaga1623Leu Gln Gly Met Ile Glu Leu Pro Leu Ala Trp385 390 395ccaaagaaag gggtccgga atg cgg atc gcg atc gac acc gac cgc tgt atc 1675Met Arg Ile Ala Ile Asp Thr Asp Arg Cys Ile400 405ggc gcc ggc cag tgt gcc ctg acc gcg ccc ggg ggt ttc acc cag gat 1723Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Gly Gly Phe Thr Gln Asp410 415 420gac gac ggt ttc agt gca ctg ctg ccc ggc cgg gag gac ggc gcc ggc 1771Asp Asp Gly Phe Ser Ala Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala Gly425 430 435gac ccg ctg gtg cgg gaa gcc gcc cgc gcc tgc ccc gtg cag gcc att 1819Asp Pro Leu Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Gln Ala Ile440 445 450gcg gtc acc gac gat tag cagcaccccc gcggacgacc cggcagacgc gcgcggcc1875Ala Val Thr Asp Asp455ccggctgaca cccggcgccc gaggcgcgcc cgagccgtcc gcccctccac ttgtccctac1935ggcatccacc ccatccgcta ccgcaacacc ccttgggtga cgggcagttt cgaggacccc1995
ggtgtgcccg gggcgtactg gtgaccgtca ccggcttcac gccgcgattg cccacatagg2055cgtcgtcgct cgcggcgatc acgaagcgcg gtcggtgccc cggctcgtaa cggtgcacga2115tgcccggcag ttccacggtg aaccgccggg ccacatcggg cacccgggcc ggggccacca2175acaggtgcac cagcgtcttc ctgccgttcg gcgcgacatc gtagagcttg gcgaacagca2235ccagcttgtc cgccgcatcc gcggaccgct gcgcccgccc ggcctgcggc gaggcaacct2295tcagcgtcac cctcggcgcg cccaccacgt cgac232921032111860212DNA213未知220
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gac ccc aag cac cgc acc cag cgg tgg atg atg atc ccg agc ttc acc 513Asp Pro Lys His Arg Thr Gln Arg Trp Met Met Ile Pro Ser Phe Thr100 105 110ctc agg cgc gcc acc gag ctc agg ccg cgc atc cag gag atc gtc gac 561Leu Arg Arg Ala Thr Glu Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Ile Val Asp115 120 125 130gaa ctg ctg gac gtg atg atc gcc cag gga ccc ccg gcc gac ctg gtg 609Glu Leu Leu Asp Val Met Ile Ala Gln Gly Pro Pro Ala Asp Leu Val135 140 145cgt tcc ttc gcg ctg ccg gtg ccg tcc atg gtg atc tgc gcc ctg ctc 657Arg Ser Phe Ala Leu Pro Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu150 155 160ggc gtg ccc tac gcc gac cac gag ttc ttc gag gac cag tcc agg cgg 705Gly Val Pro Tyr Ala Asp His Glu Phe Phe Glu Asp Gln Ser Arg Arg165 170 175ctg ctg cgc gga ccg gcg gcc gag gac acg cag gac gcc cgg gac cgg 753Leu Leu Arg Gly Pro Ala Ala Glu Asp Thr Gln Asp Ala Arg Asp Arg180 185 190ctc gcc gcg tac ctg gag gac ctg atc gac gag aag cgg cgc cgg ccc 801Leu Ala Ala Tyr Leu Glu Asp Leu Ile Asp Glu Lys Arg Arg Arg Pro195 200 205 210ggt gac ggc ctg ctg gac gaa ctc gtc cag cag cgt ctg aac gaa ggc 849Gly Asp Gly Leu Leu Asp Glu Leu Val Gln Gln Arg Leu Asn Glu Gly215 220 225gag ctc gac cgg gag gaa ctg acc gcg ctg gcg atg atc ctg ctg gtc 897Glu Leu Asp Arg Glu Glu Leu Thr Ala Leu Ala Met Ile Leu Leu Val230 235 240gcg ggc cac gag acc acc gcc aac atg atc tcc ctg ggc acc tac acg 945Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Tyr Thr245 250 255ctc ctg ctg cac ccc gaa cgg ctg acc gag ctg cgc gcc gac ccc gcg 993Leu Leu Leu His Pro Glu Arg Leu Thr Glu Leu Arg Ala Asp Pro Ala260 265 270ctg ctg ccg gcc gcc gtc gag gaa ctg atg cgg atg ctg tcc atc gcg 1041Leu Leu Pro Ala Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Met Leu Ser Ile Ala275 280 285 290gac gga ctg ctg cgg cag gcc acc gag gac atc gag atc gcc ggg acc 1089Asp Gly Leu Leu Arg Gln Ala Thr Glu Asp Ile Glu Ile Ala Gly Thr295 300 305acc atc agg gcc ggg gac ggc gtg gtc ttc tcc acc tct gtc atc aac 1137Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Val Phe Ser Thr Ser Val Ile Asn310 315 320cgc gac gag gac gtc tac ccg gcc ccc gac acc ctc gac ttc cac cgc 1185Arg Asp Glu Asp Val Tyr Pro Ala Pro Asp Thr Leu Asp Phe His Arg325 330 335tcg acc cgc cac cac gtc gcc ttc ggt ttc gga atc cac cag tgc ctc 1233
Ser Thr Arg His His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile His Gln Cys Leu340 345 350ggc cag aac ctc gcc cgc acc gaa ctg gag atc gcc ctg cgc acg ctc 1281Gly Gln Ash Leu Ala Arg Thr Glu Leu Glu Ile Ala Leu Arg Thr Leu355 360 365 370ctc gaa cgg ctg ccc acg ctc cgg ctc gcc gcc cca ccg gag gaa atc 1329Leu Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Leu Ala Ala Pro Pro Glu Glu Ile375 380 385ccc ttc aaa ccc ggc gac acc atc cag ggg atg ctg gaa ctc ccc gtc 1377Pro Phe Lys Pro Gly Asp Thr Ile Gln Gly Met Leu Glu Leu Pro Val390 395 400agc tgg taa gaggctgccg tc atg cat atc gag atc gac aag gac cgc tgc1428Ser Trp Met His Ile Glu Ile Asp Lys Asp Arg Cys405 410atc ggc gcc gga cag tgc gcc ctg acc gcc ccg ggt gtg ttc acc cag 1476Ile Gly Ala Gly Gln Cys Ala Leu Thr Ala Pro Gly Val Phe Thr Gln420 425 430gac gac gac ggc ttc agt gac ctg ttg ccc ggc cgg gag gac ggc gcc 1524Asp Asp Asp Gly Phe Ser Asp Leu Leu Pro Gly Arg Glu Asp Gly Ala415 435 440 445ggc gac ccg atg gtc cgg gag gcc gcc agg gcc tgc ccc gtg agt gcc 1572Gly Asp Pro Met Val Arg Glu Ala Ala Arg Ala Cys Pro Val Ser Ala450 455 460atc acg ctg tcc gag gac ggg tag ggggccgagc cgcgccgccc gccggtccgc 1626Ile Thr Leu Ser Glu Asp Gly465tgccgcggcg ccgtgccgac gcggcggccg gccggcccgt ccggtgcccg tcgcgtcgcc1686ccgtggcccc ggcggcggct gattgactag ggttcccggg tgagcgaaca ggcccagaag1746ccctccgggg cgccgcccgc gaaagacacc gggacggcgc ccgggaaacc ccttcctcta1806cgtcgtcgtc tgcgccgccg gcatcgccga aggcgtcagc aagctgatca ccgc 1860210421129212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述5Dm-3F引物
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223拓撲結構線性220
223人工序列的描述5Dm-3R引物4005gttgatsays gasgtsgaga a21210621130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述6PIN-2F引物4006gctgcgcctg gccctggagg acatcgagat 30210721130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述6PIN-2R引物4007ctgttcctcg aagaactcgt ggtcggcgta 30210821130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述DM-NdeF引物4008gcccccatat gacggaactg acggacatca 30210921130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述DM-SpeR引物4009gggccactag tcagccggcc ggttcggtca 30
2101021130212DNA213人工序列220
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223拓撲結構線性220
223人工序列的描述DM-BglF引物40010cgcatagatc ttcacccgag cgggtgatca 302101121130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述DM-BglR引物40011tcccgagatc ttgaaggtcc gcgtcaccgt 302101221122212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈
220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述5D-1R引物40012aggtgcccag cgagatcatg tt 222101321130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述7PIN-2F引物40013ccatgatcct gctggtggcc ggccatgaga 302101421130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述07-NdeF引物40014gccccatatg accgaagcca tcccctactt 30
2101521130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述07-SpeR引物40015gccactagtg ctaatcgtcg gtgaccgcaa 302101621121212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述5Dm-2R引物40016ctggatsgtg tcsccsggyt t212101721130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性
220
223人工序列的描述5PIN-2F引物40017cggaatccac cagtgcctcg gccagaacct 302101821130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述tpm-NdeF引物40018ggccccatat gacagacacg acagacctga 302101921130212DNA213人工序列220
223鏈形式單鏈220
223拓撲結構線性220
223人工序列的描述tpm-SpeR引物40019gcgcgactag tccccctacc cgtcctcgga 30
權利要求
1.經分離的純DNA，其為參與將式(I) 所示的大環內酯類化合物(以下稱為大環內酯類化合物11107B)生物學轉化為式(II) 所示的16位羥化大環內酯類化合物的DNA，包含編碼部分或全長的具有16位羥化酶活性的蛋白質或鐵氧還蛋白的DNA或其變體。
2.下述(a)、(b)或(c)所示的權利要求1所述的DNA(a)編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質的DNA，所述DNA選自由序列編號1的鹼基1322位至鹼基2548位的連續鹼基序列、序列編號2的鹼基420位至鹼基1604位的連續鹼基序列和序列編號3的鹼基172位至鹼基1383位的連續鹼基序列組成的組，(b)上述(a)所示DNA的變體，為這樣的DNA(i)與上述(a)所示的DNA在嚴格的條件下雜交，且(ii)編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質，(c)這樣的DNA，由於基因密碼子的簡併性，與上述(a)所示的DNA在嚴格的條件下不雜交，但所編碼的蛋白質與自上述(a)或(b)所示的DNA編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列。
3.自權利要求2所述的DNA編碼的蛋白質。
4.攜帶權利要求2所述的DNA的自我複製型或整合複製型重組質粒。
5.經權利要求4所述的重組質粒轉化的轉化體。
6.編碼具有大環內酯類化合物11107B的16位羥化酶活性的蛋白質的DNA的分離方法，其特徵在於以包含權利要求2所述的DNA或其部分的DNA作為探針或引物使用。
7.下述(d)、(e)或(f)所示的權利要求1所述DNA(d)編碼鐵氧還蛋白的DNA，所述DNA選自由序列編號1的鹼基2564位至鹼基2761位的連續鹼基序列、序列編號2的鹼基1643位至鹼基1834位的連續鹼基序列和序列編號3的鹼基1399位至鹼基1593位的連續鹼基序列組成的組，(e)上述(d)所示DNA的變體，為這樣的DNA(i)與上述(d)所示的DNA在嚴格的條件下雜交，且(ii)編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質，(f)這樣的DNA，由於基因密碼子的簡併性，與上述(d)所示的DNA在嚴格的條件下不雜交，但所編碼的蛋白質與自上述(d)或(e)所示的DNA編碼的蛋白質具有相同的胺基酸序列。
8.自權利要求7所述的DNA編碼的蛋白質。
9.攜帶權利要求7所述的DNA的自我複製型或整合複製型重組質粒。
10.經權利要求9所述的重組質粒轉化的轉化體。
11.編碼具有鐵氧還蛋白功能的蛋白質的DNA的分離方法，其特徵在於以包含權利要求7所述的DNA或其部分的DNA作為探針或引物使用。
12.16位羥化的大環內酯類化合物的產生方法，其特徵在於使用培養基培養權利要求5或權利要求10所述的轉化體，在培養中或培養後，將經增殖的轉化體與式(III) 〔式中， R12、R16b、R17a、R17b、R18、R20a、R20b、R21a和R21b相同或不同，表示(1)氫原子，(2)可具有取代基的C1-22烷基，(3)-OR(式中R表示1)氫原子，可以有取代基的2)C1-22烷基，3)C7-22芳烷基，4)5元環至14元環的雜芳氧基烷基，5)C2-22烷醯基，6)C7-15芳醯基，7)C3-23不飽和烷醯基，8)-CORco(式中Rco可以有取代基，表示8-1)5元環至14元環的雜芳基，8-2)C1-22烷氧基，8-3)不飽和C2-22烷氧基，8-4)C6-14芳氧基，8-5)5元環至14元環的雜芳氧基，或8-6)3元環至14元環的含氮非芳族雜環)，9)C1-22烷基磺醯基，10)C6-14芳基磺醯基，或11)-SiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2和Rs3相同或不同，表示C1-6烷基或C6-14芳基))，(4)滷素原子或(5)-RM-NRN1RN2{式中RM表示單鍵或-O-CO-；RN1和RN21)相同或不同，表示1-1)氫原子或1-2)可以有取代基的(i)C1-22烷基，(ii)不飽和C2-22烷基，(iii)C2-22烷醯基，(iv)C7-15芳醯基，(v)不飽和C3-23烷醯基，(vi)C6-14芳基，(vii)5元環至14元環的雜芳基，(viii)C7-22芳烷基，(ix)C1-22烷基磺醯基或(x)C6-14芳基磺醯基；或2)RN1和RN2與結合的氮原子一起形成可具有取代基的3元環至14元環含氮非芳族雜環}；但是，R21a和R21b一起可形成(i)酮結構(＝O)或(ii)肟結構{＝NORox(式中Rox表示可具有取代基的C1-22烷基、不飽和C2-22烷基、C6-14芳基、5元環至14元環的雜芳基或C7-22芳烷基)}；R16a表示氫原子；R21c表示(1)氫原子或(2) (式中R22a、R22b和R22c相同或不同，表示1)氫原子，2)C1-6烷基，3)-OR(式中R具有上述的含義)，4)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN1和RN2具有上述的含義)或5)滷素原子；或R21a和R21b中的任一方與R22a和R22b中的任一方一起可形成部分結構 Gm表示(1)式(GM-I)所示的基團 {式中R2和R10相同或不同，表示氫原子或C1-22烷基；R3a、R3b、R5a、R5b、R6a和R6b相同或不同，表示1)氫原子，2)羥基，3)可具有取代基的3-1)C1-22烷基，3-2)C1-22烷氧基，3-3)C6-14芳氧基，3-4)5元環至14元環的雜芳氧基，3-5)C2-22烷醯氧基，3-6)C7-15芳醯氧基，3-7)C3-23不飽和烷醯氧基，3-8)-OCORco(式中Rco具有上述的含義)，3-9)C1-22烷基磺醯氧基，3-10)C6-14芳基磺醯氧基，或3-11)-OSiRs1Rs2Rs3(式中Rs1、Rs2和Rs3具有上述的含義)，4)滷素原子，或5)-RM-NRN1RN2(式中RM、RN和RN2具有上述的含義)；或者R5a和R5b可一起形成酮結構(＝O)；或者R6a和R6b可一起形成螺環氧乙烷基或環外亞甲基；或者，R7a和R7b相同或不同，表示氫原子或-ORH(式中RH表示氫原子、C1-22烷基或C2-22烷醯基)}、(2)式(GM-II)所示的基團 (式中R2、R3a、R3b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10與式(GM-I)的定義相同)，(3)式(GM-III)所示的基團 (式中R2、R5a、R5b、R6a、R6b、R7a、R7b和R10與式(GM-I)的定義相同)，(4)式(GM-IV)所示的基團 (式中R2、R6a、R7a、R7b和R10與式(GM-I)的定義相同)；或(5)式(GM-V)所示的基團 (式中R2、R3a、R6a、R6b和R10與式(GM-I)的定義相同)〕所示的大環內酯類化合物接觸，轉化為式(IV) (式中W、R12、R16b、R17a、R17b、R20a、R20b、R21a、R21b、R21c和Gm表示與式(III)的定義相同)所示的16位羥化的大環內酯類化合物，收集如此轉化的16位羥化的大環內酯類化合物。
13.權利要求12所述的產生方法，其中轉化體為權利要求5所述的轉化體，且為具有編碼鐵氧還蛋白的DNA的轉化體。
14.權利要求12所述的產生方法，其特徵在於將式(III-a) (式中54表示雙鍵或單鍵、W』表示雙鍵或 R5』表示氫原子或乙醯氧基，R6』表示氫原子或羥基，R7』表示氫原子或乙醯基)所示的化合物轉化為式(IV-a) (式中54、W』、R5』、R6』和R7』與式(III-a)的定義相同)所示的化合物。
15.權利要求14所述的產生方法，向式(IV-a)的化合物轉化中的式(III-a)的化合物選自由以下化合物組成的組中(1)54是單鍵、W』是 R5』、R6』和R7』是氫原子的化合物，(2)54是單鍵、W』是 R5』和R6』是氫原子，R7』是乙醯基的化合物，(3)54是單鍵、W』是 R5』和R7』是氫原子，R6』是羥基的化合物，(4)54是單鍵、W』是 R5』是氫原子，R6』是羥基，R7』是乙醯基的化合物，(5)54是單鍵、W』是雙鍵，R5』、R6』和R7』是氫原子的化合物，(6)54是單鍵、W』是雙鍵，R5』和R6』是氫原子，R7』是乙醯基的化合物，(7)54是單鍵、W』是雙鍵，R5』和R7』是氫原子，R6』是羥基的化合物，(8)54是單鍵、W』是雙鍵、R5』是氫原子、R6』是羥基、R7』是乙醯基的化合物、(9)54是雙鍵、W』是 R5』和R7』是氫原子，R6』是羥基的化合物，(10)54是雙鍵、W』是 R5』是氫原子，R6』是羥基，R7』是乙醯基的化合物，(11)54是單鍵、W』是 R5』是乙醯氧基，R6』是羥基，R7』是氫原子的化合物，和(12)54是單鍵、W』是 R5』是乙醯氧基，R6』是羥基，R7』是乙醯基的化合物。
16.權利要求5或權利要求10所述的轉化體的用途，用於產生16位羥化的大環內酯類化合物。
全文摘要
本發明提供了參與大環內酯類化合物11107B的羥化作用的DNA、以及大環內酯類化合物11107D的新產生方法。詳細地說，本發明涉及參與式(I)所示的大環內酯類化合物11107B生物學轉化為式(II)所示的16位羥化大環內酯類化合物11107D的DNA，其為編碼具有16位羥化酶活性的蛋白質或鐵氧還蛋白的DNA、其分離方法、自該DNA編碼的蛋白質、攜帶該DNA的質粒、經該質粒轉化的轉化體和使用該轉化體產生16位羥化大環內酯類化合物的方法。
文檔編號C12P17/08GK1886505SQ20048003505
公開日2006年12月27日 申請日期2004年11月25日 優先權日2003年11月27日
發明者町田和弘, 中島崇, 有德保秀, 土田外志夫 申請人:美露香株式會社, 衛材株式會社