用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的納米和微流體的設備和方法

2023-04-24 13:12:26

專利名稱：用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的納米和微流體的設備和方法
技術領域：
本發明涉及一種用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備。更精確而言，本發明涉及通過進行選擇性的空間過濾和/或離子過濾而對從至少一個微通道中分流至至少一個納米通道中的流體中存在的顆粒的分離和濃縮。在本文中特定的本發明的範圍內，微通道(微米通道，microchannel)是指高度在微米範圍內的流體通道，即典型地，通道的高度，或換言之通道的深度是幾十個Pm (微米)的數量級。同樣，典型地，微通道的寬度為約50至約100個μπι (微米)的數量級。也在本文中特定的本發明的範圍內，納米通道(毫微通道，nanochannel)是指流體通道的高度或換言之深度在納米的範圍內，即典型地，通道的高度小於或等於IOOnm (納米)。在本發明特定的範圍內，顆粒是指納米粒子和微米粒子。根據IS0TS/27687標準，納米粒子通常(但不是僅僅)是指個體平均直徑小於約IOOnm的球形顆粒。有利地，意在通過根據本發明的設備分離和濃縮的顆粒的尺寸可以是幾十至約一百個納米，典型的在50至120nm之間。同樣的尺寸實際上代表某些生物微粒如病毒、DNA以及某些用於醫學成象應用而開發的顆粒。
背景技術：
為了濃縮和分離存在於流體中的顆粒，已知利用空間效應在理論上是可能的，從而因此使流體通過其製造是已知的納米通道。但是也指出，對於微米和納米流體等級的液體流量控制可能是困難的。從而，由於納米通道的尺寸低於約一百個納米，因此認為流體阻力是很高的。從而，如果嘗試直接通過流體動力注入(水動力進樣，hydrodynamicinjection)使流體從微通道通過至納米通道，應當提供非常高的壓力來實現流速Q1，流速Ql總是保持非常低，約為每分鐘幾個納升(nanolitre) (nl/min)。在本文中特定的通過流體動力注入是指在本發明的範圍內，只通過施加在管路的入口和出口之間的壓力差(超壓(過壓，overpressure)、抽吸或重力),將流體注入到流體管路中。特定的通過電動注入(電動進樣,electrokinetic injection)是指通過施加電壓將流體注入到流體管路中，以使存在於管路中的帶電物質在電場的作用下移動，從而使移動速度是它們的電荷的函數。可以使用電滲或電泳技術。從而，在流體動力注入模式下，通過幾毫升(ml)體積需要非常長的時間。在圖1中示意性地示出這種構造:對於將流體從入口微通道I通過納米通道3注入至出口微通道2而言，在入口微通道I中施加比出口微通道2的壓力P2高很多的壓力Pl是必要的。此夕卜，氣泡可能被截留，堵塞納米通道3，甚至使其更加困難。最後，存在於流體中的顆粒可能在納米通道3的入口累積，隨之開始阻塞納米通道3。
為了克服這些困難，通常將系統設計成「旁通」(旁路，by-pass)設備，在已經提出的文獻中這是經常可以找到的。在圖2中示出這樣一種旁通設備:它由彼此平行的並通過一個或多個納米通道3連接的兩個微通道1、2構成，每個微通道1、2連接到流體入口 10、20和出口 11、21上。換言之，流體分別在給定的壓力Pl或P3下，從微通道的入口 10或20，通過每一個微通道I或2，分別在P2或P4的壓力下流動至微通道的出口 11或21，伴隨每分鐘幾個微升(μ 1/min)量級的流速Q。流體也通過從微通道I至微通道2的旁路，以幾個nl/min量級的流速Q1流動通過一個或幾個納米通道3。這些已知的旁通設備的優點在於，它能夠經由微通道1、2並以較高的流速(Q為幾個μ 1/min的量級)控制較大量的液體體積。從而納米通道可以更容易地填充，並且在不用施加巨大壓力的情況下，可以更容易地清除可能的氣泡。另一方面，這種旁通設備也有很多缺點，可以概括如下:-納米通道3的高度是固定的並且是在工藝製造步驟期間確定的。-很小的滲漏就足以使系統不穩定(失穩，destabilize)。從而，例如，如果通過在微通道之一 I的兩端部10和11施加同樣的壓力(P1=P2)以在納米通道3中引起所期望的穩定的流速Q1，那麼兩端都是入口，如在圖3中用符號表示的，從而僅一處洩漏就可能產生壓力的波動(Pl幸P2)，進而可能使通過納米通道3的流速Q1不穩定。在美國專利申請2011/0198225中，已知由彼此之間經由一個或多個納米通道連接的微通道構成的另一種旁通設備。在被稱為樣品微通道的微通道的兩端部施加電勢差，流體通過樣品微通道以抽取樣品，而被稱為緩衝微通道的微通道，與樣品微通道平行並通過納米通道與樣品微通道連接，且其中存在緩衝液的緩衝微通道是接地的。從而在樣品微通道上出現獨特的排空區(depletion area),對於任何類型的帶電物質起到電荷屏障的作用。所利用的物理現象稱為離子濃度極化(ICP)。在本文中將根據圖4至圖6D描述該物理現象。在這些圖中特定的帶負電的離子種類用負號表示，而那些帶正電的用正號表示。首先想到的是基板附近的稱為德拜雙層的疊加原理。如在圖4中所顯示的，在圖4中，其中存在正離子和負離子的二氧化矽緩衝溶液S來到基板30的壁上(物質Si0_)，根據德拜雙層Cl、C2的總厚度指示為入d。具有對於存在於表面處的離子種類的極性(相反)的第一反極性(在該實例中為正的)的第一離子層Cl，設置在所述表面的附近。形成包含可移動的離子種類的第二層C2。包含所述第一極性離子的第二層C2遷移到第一層Cl的附近。它還包含相反(負的)極性的離子以平衡電荷。第一層Cl用於屏蔽表面電勢(此處為負的)，該屏蔽通過第二層C2完成。該被稱為德拜雙層的雙層的厚度為λ d,其作為溶液鹽度的函數而變化。取決於所考慮的緩衝液體S，德拜雙層的厚度範圍從Inm至約一百個納米。實際上，緩衝液體的鹽度越低，德拜雙層的厚度越大。從而，如果流體通道的至少一個尺寸具有德拜雙層尺寸的量級，那麼通道的雙層可以疊加，取決於所考慮的材料的表面電荷，該通道對一種類型的離子(陰離子或陽離子)具有選擇性。實際上，在這些條件下，表面電荷是普遍的，然後將排斥具有相同電荷的離子，吸引具有相反電荷的離子。從而，本文中所強調的是稱為「離子透過選擇性」(「ion perm-selectivity」)離子選擇透過性的靜電現象。通過降低流體的通道的高度至達到德拜雙層厚度或者降低緩衝液的鹽度以使德拜雙層厚度可以達到通道的高度，從而可以獲得離子選擇透過性現象。在圖5A至5C中，其中用符號表示了通道高度或在表面帶負電的基板30之間形成的通道40中(即在陽離子滲透通道中)鹽度的三種情況:從圖5A至圖5C通道3的高度是降低的(hAhphd。緩衝液體鹽度的情況也如此。在圖5C的情況下，達到了離子選擇透過性，因為通道3的高度h3等於2* λ d，即兩個彼此疊加的德拜雙層的厚度。典型地，對於受限於兩個二氧化矽基板30的並且與去離子水緩衝液體接觸的通道3而言，該通道的一個尺寸(高度h3)應當小於或等於約lOOnm。現將根據圖6A至6D描述對於在一個或多個納米通道3和兩個微通道1、2之間的去離子水的ICP現象，其中離子選擇透過性可以在納米通道3中獲得。從而該納米通道的高度h3是IOOnm量級的。具體地，通道3和微通道1、2在二氧化矽基板上製成:沒有施加電場。圖6A表示陽離子可滲透的納米通道，該微通道的上遊和下遊分別與兩個微通道連接。當在該納米通道的入口和出口之間施加電場時(圖6B)，陽離子通過該納米通道朝著陰極的方向移動。逐漸在端部Zn附近，破壞了局部的電中性(圖6C)。為了恢復電中性，在陽極一側形成一個離子排空區或多個排空區Zd，而在陰極出現離子富集區。因此，阻止了任何另外的電荷傳輸以保持排空區Zd的電中性。換言之，排空區是一個靜電能壘。顯然，如果通道表面是帶正電荷的表面，則納米通道3將選擇陰離子，剛剛描述的現象在位置上將會逆轉，排空區和富集區將會分別位於陰極和陽極側。對於任何帶電粒子，排空區可以起濃縮器的作用。從而，回到上述的美國申請2011/0198225，通過所定義的電荷屏障增強液體的泵送，控制液體流量並去除海水鹽分。在本專利申請中還提供了分離存在於用鹽水稀釋的人類血液中的白細胞。再一次，如在圖2和3中示出的旁通設備，納米通道的高度是固定的並且是在製造工藝步驟期間確定的。出版物[I]也描述了一種旁通設備，能夠過濾、分離並立體濃縮聚苯乙烯納米粒子以及血液病毒(皰疹和B型肝炎)，其粒度範圍從30至120nm。在圖7A和7B中再現了如在該出版物中給出的設備圖。在該出版物[I]中披露的設備由兩個彼此平行的微通道1、2構成，並且微通道1、2彼此之間通過約一百個量級的互相平行的大量納米通道3連接。每一個納米通道3限制為側斜面:從而，納米通道3的高度從高度Ii1轉換至高度h3 (其他尺寸在圖7A中另外指明)。從而，將如存在於緩衝液體中的納米粒子的分析物引入微通道I的入口 10，使分析物捕獲在通過側斜面限定的捕集區Zp中，另一方面將緩衝液體從出口微通道2的出口 20排出或蒸發。如果用螢光物質標記該分析物，那麼當分析物濃縮於捕集區Zp時它可以發出螢光信號F，如在圖7B中用箭頭F表示的。換言之，捕集區Zp可以形成完整的檢測區。根據閱讀出版物[I]，整個設備是根據犧牲層工藝(sacrificial layer)製成的。可以列出這種旁通設備的如下缺點:-很可能阻塞它們的限制Zp的納米通道3；-微通道1、2處的死體積可能使待檢測的分析物產生巨大損失；-通過在該出版物中指明的毛細管現象填充通道，不可避免地限制填充流動速率;
-製造方法複雜。由出版物[2]知道一種旁通設備，其包含具有內部錐體形狀的納米通道3，具有從約IOnm量級的hQ,經由IOOnm的h3,至500nm量級的Ii1的連續梯度的高度。圖8中所顯示的設備使得取決於聚苯乙烯納米粒子的尺寸，沿著納米通道高度梯度進行位阻分離。該設備使所述納米粒子的計量學能夠進行。它也通過熵降低作用引起該高度梯度納米通道中的DNA分子能夠逐漸加長,被加長的DNA分子的容納區(containment area)位於納米通道的最低高度處(在圖8中Iitl和h3之間)。可以列出這種旁通設備的如下缺點:-光刻製造方法是複雜的，並且留下尺寸約為15nm的粗糙度，即成為一個不得不考慮的可以產生吸附現象的尺寸以及對於有效的納米通道高度的不確定性。-該設備的操作只能根據電動注入模式得以確保，因為根據流體動力注入模式，施加在納米通道中的壓力將會過高。從而，本發明的目的是提供一種用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的新設備，其部分或全部克服了上述的現有技術的缺點。本發明的一個獨特的目的是提供一種用於分離和濃縮生物樣品顆粒(如病毒、DNA或合成分子)的新設備，特別用來用於醫學成象應用。本發明的另一個獨特的目的是提供一種用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的新設備，當待檢測顆粒用螢光物質標記時，其還能夠實現比根據現有技術的設備(特別是在出版物[I]中披露的設備)更好的光學檢測。

發明內容
為實現此目的，本發明的對象是一種用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，包括:.第一微通道，具有至少一個第一開孔；.至少一個第二微通道，具有至少一個第二開孔、和端部；.所述第一微通道環繞至少部分的在所述端部的所述第二微通道；.所述第一微通道和所述第二微通道在所述端部通過至少一個納米通道連接，所述納米通道在所述第一微通道和所述第二微通道之間形成一限制(限制件)，其幾何形狀在預定的時間期限固定；.蓋，在所述端部結合所述第一微通道、所述第二微通道和所述納米通道。所述第一微通道和所述第二微通道製作在第一基板中，所述第一開孔和所述第二開孔開在該基板的同一面內，或者在同一側面上。尤其，該構造使得設備的製造更容易。進一步優選地，微通道的幾何形狀在預定的時間期限內固定。根據一個實施方式，第一微通道和第二微通道製作在第一基板中，而蓋製作在與第一基板裝配的第二基板中，納米通道由在第一基板和第二基板之間的間隔物限定。第一微通道可以具有兩個第一開孔。第二微通道可以具有單一的第二開孔。因而，根據本發明的設備可以製作成具有許多個三流體入口/出口。根據一個實施方式，在第一和第二微通道之間的限制(限制件)根據閉合的環狀或多邊形的幾何形狀而空間分布的，在第一和第二微通道之間的連接(連接件)由一個或多個根據該幾何形狀分布的納米通道製成的。
根據一個實施方式，該設備接著可以進一步包括多個均勻地間隔在該限制內部而分布的形成額外高度的塊，該塊具有至多等於該限制(限制件)高度的高度h3，兩個相鄰的塊限定納米通道。該塊可以具有基本上等於由納米通道形成的該限制(限制件)高度的高度h3，並且被密封至所述蓋，從而製成密封塊。可替代地，該塊可以具有低於由納米通道形成的該限制(限制件)高度的高度h3，並且未被密封至所述蓋。有利地，所述蓋適於在致動器的動作下能夠被撓曲應變，同時在確定的時間期限內保持固定。致動器可以是至少一個附接在所述蓋的上面以使其撓曲應變的機電致動器。機電致動器進而優選是壓電元件。其也可以是流體自身，其通過在微通道之一中降壓(負壓，depression)或過壓(超壓，overpressure),有可能用以撓曲應變所述蓋。根據一個有利的實施方式，該設備可以包括至少兩個由一個或多個具有閉合的環狀或多邊形形狀的納米通道或其部分形成的限制(限制件)，納米通道的部分或其全部可以例如圍繞單一的第二微通道一個相對於另一個相互同心設置。由一個或多個納米通道形成的兩個限制之一的高度h3可以與由一個或多個納米通道形成的兩個限制(限制件)的另一個的高度h4不同。根據一個實施方式，該設備可以包括至少兩個第二微通道和至少兩個由一個或多個具有閉合的環狀或多邊形形狀的納米通道或其部分形成的限制，每一納米通道的部分或
全部圍繞單一的第二微通道設置。有利地，第二微通道在端部的部分與和納米通道相鄰的所述蓋的部分通過配體的存在官能化以使其表面通過甲矽烷化官能團固定(secured)，以便在所述部分捕獲經濃縮的顆粒。因而,用於分離和濃縮 顆粒的設備根據結構學(architecture)而設計,顯然與根據以上提到的現有技術的旁通類型(旁路類型，by-pass type)的設備明顯不同。與現有技術說明的這些旁路設備相比較，根據本發明的設備具有以下的顯著優
佔-
^ \\\.
-設備的緊湊性；-以流體動力或電動注入方式迅速和方便地填充；-更小的在設備中存在有害氣泡的風險；對於可能的壓力脈動的更小的敏感性；-因為發生在位於每一個由納米通道的矩形橫截面限定的離散區域處的環形連續區域，因此改善了顆粒濃縮效應；-提高了突光物質負載(fluorescent substance-laden)顆粒的光學檢測閾值,尤其對於生物來源的可以以及作為結果的更高的疾病診斷快速性；-對於分離和濃縮具有初始多分散性的適合尺寸顆粒(insizeparticles)的可能性；-根據本發明的納米通道的高度作為液體溶液鹽度的函數的適應性。根據本發明，納米通道的幾何形狀在預定的時間期限內是固定的或恆定的，該預定的時間期限是對於該設備的操作期間，其是該設備濃縮和分離過程的期間，或者甚至是通過顆粒螢光進行實際檢測的期間。如本文以下所描述的，納米通道的高度可以被改變，當納米通道被試圖用以執行初始設備填充時，其能夠使開放時間(專用時間，dedicatedtime)降低,或者當其需要分離和濃縮具有在不同範圍內的粒度(unit size)的顆粒時。換言之，在本發明的範圍內，目的根本不在於製作其高度在操作過程中如在微流體泵中而改變的一個或多個納米通道。本發明還涉及一種用於操作用於分離和濃縮存在於所描述的流體中的顆粒的設備的方法，根據所述方法實施以下步驟:a/通過第一和第二微通道之一開始注入緩衝液體溶液；b/—旦所述緩衝液體溶液已到達納米通道、或者從納米通道溢流，從第一和第二微通道的另一個注入該液體溶液。根據一個可替代方案，步驟a/由第二微通道實施，而步驟b/由第一微通道實施。當緩衝液體溶液的注入被製成流體動力注入方式時，其中該溶液根據步驟a/開始注入的第一或第二微通道的壓力優選分別高於第二或第一微通道的壓力。可以將壓力施加於第一或第二微通道之一，並將低壓(負壓，depression)分別進一步施加於所述第二或第一微通道的另一個。一旦實施步驟b/並且納米通道充滿所述緩衝液體溶液，優選實施步驟c/的注入含有顆粒的液體以從所述第一或第二微通道之一中分離和濃縮，該顆粒具有低於通過所述納米通道的最小高度h3的尺寸以便分別通過第二或第一微通道的另一個回收，與之相反具有高於所述納米通道的最小高度匕的尺寸的顆粒至少部分在所述第一或第二微通道的外周部分通過其中根據步驟c/已經進行的注入進行濃縮。根據步驟c/，具有高於所述納米通道的最小高度匕的尺寸的所述顆粒的至少一部分的濃縮在兩個同心的納米通道之間實施。根據一個有利的實施方式，步驟d/可以根據其中電位差施加於所述第一和第二微通道之間處而實施，接著實施步驟c/的從第一微通道注入用螢光物質負載的顆粒。在步驟c/中注入的所述液體優選是去離子水，而所述螢光物質是螢光素。根據該實施方式，所述蓋可以有利地作為在步驟c/中的所述液體注入的鹽分的函數(或由於在步驟c/中的所述液體注入的鹽分的作用)而應變。最後，可以以流體動力注入方式或電動注入方式實施步驟c/的含有顆粒的液體注入。


在閱讀了參考以下附圖所作的詳細描述之後，本發明的進一步優勢和特徵將變得明了，其中:-圖1是根據現有技術的流體設備的截面剖視示意圖，包括在兩個微米通道之間的連接處的納米通道；-圖2是根據現有技術的旁路(by-pass)型流體設備的俯視示意圖，包括連接兩個微通道之間的多個納米通道；-圖3是根據現有技術的旁路型流體設備的另一個俯視示意圖，包括連接在兩個微通道之間的多個納米通道；-圖4是示出在電荷壁附近包含帶電荷物質的緩衝溶液德拜雙層的疊加的物理現象的不意-圖5A至圖5C示出了德拜雙層疊加或未疊加至流體納米通道中的三個不同位置；-圖6A至圖6D示出了在根據圖1的流體設備中進行ICP現象的不同階段的截面首丨J視圖;-圖7A至圖7B分別是在出版物[I]中披露的旁路流體設備的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖8是在出版物[2]中披露的旁路流體設備的納米通道的透視示意圖；-圖9和圖9A分別是根據本發明的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的第一種實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖9A至圖9C是不出根據圖9的設備的兩個初始填充步驟的橫截面剖視圖；-圖10和圖1OA分別是根據圖9和圖9A的設備的第一種可替換實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖11和圖1lA分別是根據本發明的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的第二種實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖12和圖12A分別是根據本發明的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的第三種實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖13和圖13A分別是根據圖9和圖9A的設備的第二種可替換實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖13B示出了根據圖13和圖13A的蓋的應變狀態；-圖14和圖14A至圖14B分別不出了根據圖9和圖9A的設備的第三種可替換實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖15和圖15A分別是根據本發明的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的第四種實施方式的俯視示意圖和橫截面剖視示意圖；-圖16A至圖16C是根據圖15和圖15A的設備在不同操作時間下的拍攝複製圖；-圖17至圖17J是示出製造根據本發明的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的不同步驟的橫截面剖視圖。
具體實施例方式參考現有技術，上文已討論了圖1至圖8。因此，在下文中將不再進一步詳細討論它們。在隨後的描述中，參照在根據本發明的用於分離和濃縮顆粒的設備中包含顆粒的流體(液體)的方向，使用了術語「進口」、「出口 」、「上遊」、「下遊」。此外，參照根據本發明的設備的垂直物理方向，使用了術語「上(upper)」、「下(l0Wer)」、「頂部(top)」、「底部(bottem)」。在此處說明，為了使附圖清楚，沒有考慮相對尺寸和比例。還需說明，除非明確說明，否則根據本發明的設備的填充是以流體動力注入模式描述的。但是在下文中詳細描述的根據本發明的所有設備也可以以電動注入模式填充，例如通過電滲透或電泳。還需說明，在所有示出的實施方式中，示出的微通道1、5、5.1,5.2、5.3在其臨近納米通道3、3.1、3.2、3.3的部分剖面放大。事實上，優選這种放大是為了技術原因，與參照圖17-圖17J更好地描述製造相關。此外，這种放大有利地使得能夠限定空腔(chamber)，即增加的流體填充或顆粒濃縮體積。為了清楚，在下文中不再詳細描述它們。通過實施例，可以對根據本發明的微通道和納米通道給出在圖中表示的以下尺寸:-納米通道高度h3、h4、h5、h6 (h3#h4#h5#h6):1 至幾百納米；-納米通道寬度Wl:50至ΙΟΟμπι ;-納米通道寬度W2:100 μ m至Imm ;-微通道的空腔部分的高度H:50至500 μ m ;-蓋厚度El:幾百微米。在圖9和圖9A中已示出了根據本發明的設備的第一種實施方式。示出的分離和濃縮設備包括安裝有用厚度為El的玻璃蓋13密封的矽基板8 (矽襯底8)。它們使得流體連通(fluidic communication)的高度為H的中心微通道5與其端部通常形成高度h3和寬度wl的環狀限制(annular restriction)的單個納米通道3結合在一起。通過微通道5的端部，意圖使該微通道的區域接近蓋13。納米通道3也通過其外周與具有設置在設備周圍的高度也為H的兩個開孔10、12的微通道I流體連通。在本發明的範圍內，微通道I也可以僅具有單獨的開孔10或12:在這種替代方式中，微通道5不再是中心通道，因為事實上，微通道I在微通道5的任何側面都沒有延伸。由於描述的設備使得隨後的顆粒能夠分離和濃縮，該設備首先由緩衝流體溶液填充。為了這個目的，將該設備置於流體工作檯(fluidic bench)上，其使得該設備連接至液壓發生器(hydraulic pressure generator)0因此，使得通過中心微通道5的液體(流體)注入可達(至多至)壓力P5，周圍微通道I的壓力保持為零(圖9A)。逐漸通過相關壓力步驟進行該溶液的注入以最大限度地防止中心微通道5中形成氣泡。一旦液體到達納米通道3或從其中溢流，在完全填充設備內部從而清除可能的氣泡的某一壓力下，通過其開孔10或12中的一個或兩個由微通道I進行相同緩衝液體的注入(在圖9B中在壓力Pl下從周圍微通道I的開孔10進行注入，周圍微通道的另一個開孔12中壓力P2為零)。現在描述根據本發明的用於分離和濃縮一定尺寸(in size)的顆粒(例如微米顆粒或納米顆粒)的設備的操作。考慮的顆粒可以是生物(DNA、病毒、細菌、細胞、脂質顆粒，等)或合成來源的，並且可以是標記有螢光團的，其允許光學檢測，如結合圖15-圖16A的實施方式更好描述的。考慮的顆粒可以是帶電荷的或電中性的。如上文描述的,在完全填充設備內部之後,直接從中心微通道(mechanical) 5的單個開口 50注入包含比納米通道3的高度大(Ng)和小(Np)的粒度(unit size)的液體溶液。在該分離/濃縮操作期間，納米通道3的尺寸保持固定。換言之，它們是受控制的。在某一注入時間結束時，具有比納米通道3大的粒度(Ng)的顆粒在可以檢測(特別是光學檢測)它們的微通道5的端部51的空腔部分的位置濃縮。實際上，由於由環狀納米通道3形成的限制，所以在它們堆積(build up)的微通道5中捕獲了這些顆粒。在整個注入期間，具有較小粒度(Np)的顆粒通過納米通道3，並且可以在微通道I的開孔10或開孔12的出口處回收(圖9C)。如在圖9C中表明的，包含將通過中心微通道5分離和濃縮的在(Ng，Np)尺寸範圍內的顆粒的液體溶液的注入模式可以是流體動力的(hydrodynami c ) (PI, P2 )。根據該流體動力注入模式，如果僅實施超壓(過壓)，必須在中心微通道5和周圍微通道I之間施加壓力梯度(P5>P1=P2)。在周圍微通道I中也可以實施負壓(expression) (P1=P2〈0)以加快該過程。通過設計，該設備的中心微通道5比根據現有技術，更具體地在圖2和圖3中描述的那些旁路設備更不容易壓力脈動。因此，根據本發明，由於能夠在中心微通道5的空腔部濃縮顆粒Ng，因而可以實現更穩定的濃縮效應，獲得的效果對於該設備的進口或出口可能的壓力脈動依賴性很小。作為替代方式，也可以通過周圍微通道I的開孔10或12中的一個進行顆粒注入，而不是通過中心微通道5進行。根據該替代方式，具有小於納米通道3的高度h3的粒度的顆粒Np在中心微通道5中回收，而具有大於高度h3的粒度的顆粒Ng在納米通道3的外周處濃縮。在圖10和圖1OA中示出了剛才描述的設備的可替代實施方式，根據該實施方式，設置具有與限制(限制件)相等的高度h3的塊，其均勻地間隔在該限制(限制件)中，並且被密封至蓋13上，以便更好地固定納米通道3的高度。此處，兩個相鄰的塊33與納米通道3結合。這樣的替代是有利的，因為無論施加在蓋上的壓力如何，其都固定納米通道的高度。換言之，無論施加至蓋13上的壓力如何，納米通道3的高度h3都確保保持恆定。根據第二種實施方式，根據本發明的設備可以形成圍繞中心微通道5相對於另一個相互同心設置的多個環狀納米通道3.1,3.2。納米通道3.1,3.2的高度h3、比可以彼此不同，以有利地使得具有不同粒度的顆粒能夠分離(圖11和圖11A)。在第三種實施方式中，根據本發明的設備可以形成彼此液壓串聯(hydraulicseries)的環狀納米通道3.1,3.2,3.3，各納米通道3.1,3.2、3.3環繞中心微通道5.1,5.2、
5.3而設置。納米通道3.1、3.2、3.3的高度h3、h4、h5可以不同於彼此，因而使得具有不同尺寸範圍的納米顆粒能夠分離(圖12和圖12A)。該實施方式是有利的，因為通過液壓串聯設置多個納米通道，因此以這種方式製備顆粒分離基質(matrix)，這允許以較大規模分離(圖12 和圖 12A)。根據第二種可替代實施方式，根據本發明的設備可以形成減小的蓋13的厚度E1，而增加微通道5和微通道I之間形成的微通道(3)的寬度W2。這使得蓋13能夠當在致動器的動作下，向蓋施加壓力時被撓曲應變(圖13和圖13A)。因此，通過蓋13被撓曲應變可以產生納米通道3的高度梯度。可以有利地利用該高度梯度(h3』至h3」)以分離具有不同粒度的顆粒(圖13B)。因此，使用取決於施加在中心微通道5中或多或少的高壓的可撓曲應變的蓋13，蓋13或多或少地應變，並且產生或多或少的高度梯度(在圖13B中梯度從h3」降低至h3』)。這樣的替代是有利的，因為在相同的操作期間，具有不同粒度的顆粒可以通過簡單地調節施加至蓋的壓力來分離。因此設備(one)可以具有粗糙度在幾埃數量級的低厚度El的可應變玻璃蓋。值得注意的是，根據該第二種替代方式，依賴於致動器使得能夠控制蓋的應變，以便將微通道I與微通道5分隔的納米通道(3)的幾何形狀在預定的時間期限固定。在第三種替代實施方式中，根據本發明的設備可以形成可應變的蓋13以及具有小於環狀限制(限制件)3的高度的高度h3的塊34。此處，兩個相鄰的塊34形成納米通道3，各納米通道將微通道5與微通道I分隔。結合圖17-圖17J更好地描述了在製造期間製成的這些塊34，這些塊未被密封至蓋13。當將應力施加至蓋13時，這些塊34作為控制納米通道3的高度的止擋件(stop)(圖14A和圖14B)。因此，在分離/濃縮操作相應的時間期限期間，通道的高度保持固定和恆定。該應力可以是蓋13上的機械應力或者例如在中心微通道5中的負壓(depression)。由於蓋13的該應變，有利的是具有低厚度的玻璃，因而該設備開始可以更容易地從中心微通道5填充，因此可以清除可捕獲在中心微通道5處的氣泡。進行開始填充後，可以施加負壓在中心微通道5中。因而實現了具有小於納米通道高度的尺寸的納米顆粒Np的分離，這些納米通道由於塊34保持固定和恆定，這些顆粒通過納米通道3，以及具有較大粒度Ng的顆粒在納米通道3的外周處的濃縮。在圖13和圖14B的替代方案中，蓋13的可撓曲應變性使得根據本發明的設備在填充和待分離的顆粒的尺寸範圍方面能夠具有較大的操作靈活性。實際上，在這些替代方式中，納米通道形成的環狀限制的高度可以在空間和時間上是可變的。如已說明的，使得蓋13的可撓曲應變性能夠實現的致動器可以是附接至前者的致動器，如壓電元件，或者也可以是設備內的流體本身，例如微通道5中的減壓流體或微通道I中的超壓流體。在圖15至15A的第四種實施方式中，在根據本發明的設備中實施ICP物理原理。在本申請的前述部分中已給出了具有不同表示法(notation)的該原理。在本文中使用的根據圖10和IOA的設備:使用密封至玻璃蓋13的矽塊33，形成環狀幾何形狀的限制(件)的納米通道3的高度h3，因而保持固定和恆定。在該實施方式中，例如，通過中心微通道5注入在去離子水中稀釋的螢光素(螢光黃)溶液。當溶液填充納米通道3並溢流在周圍的微通道I中時，經由後者的微通道I填充整個設備。然後，使用電壓發生器，在中心微通道5和周圍微通道I之間施加電勢差，觀測負載突光素的貧乏區Zp (depletion areas Zp)和濃縮區Zc (富集區，concentration areaZc)。然後由周圍微通道I施加漸進的壓力(逐漸變化的壓力)(圖15A)。更確切地,使用epilf Iuorescent光學顯微鏡,通過ICP現象已觀測到突光素的濃縮效應,結合圖15A、15B、16A-16C。首先，通過施加數值可達(最高)大約I巴(bar)的壓力，通過中心微通道5注入在去離子水中稀釋的螢光素溶液。逐漸注入使得能夠在設備內部具有儘量少的氣泡。此時，微通道I和5的所有電勢Vp V2、V3都是零(圖16A)。然後，施加適宜的電勢以產生貧乏區。典型地，在周圍微通道I中的電勢是零(在開孔10和12中的電勢=V1=V2=OV),而中心微通道5中的電勢設置為V3 = -50V。由於螢光素是帶負電的，隨著在納米通道3的外周處貧乏區擴大而被排斥。在圖16B中看到的在納米通道3處的黑色區域相當於開始延伸的離子貧乏區。然後向周圍微通道I的去離子水施加幾毫巴的漸變壓力。在由低壓區(負壓區)Zd產生的靜電屏障處觀測到螢光的增加，這顯示了濃縮效應(圖16C)。
如上文已表明的，在相同設備中的時間和空間上改變納米通道3的高度是可能的。這提供了較大的操作靈活性，特別是與注入的液體溶液的鹽分以獲得ICP物理現象相關。實際上，如果溶液基本不含鹽，允許約IOOnm的納米通道3的高度h3，因為在這種情況下，在一個或多個納米通道3中的德拜雙層的厚度基本上是相同數量級的。因而可以產生納米通道(多個納米通道)的疊加以獲得如圖5C顯示的離子選擇透過性，從而獲得ICP現象。另一方面，對於鹽分高的溶液，優選使蓋13應變使得由納米通道3形成的限制(件)的高度h3較小，並且更容易產生ICP現象。因此，在ICP現象的持續時間內，通道高度應當保持恆定。為了根據需要使蓋13撓曲應變，諸如壓電元件的電機致動器可以有利地附接至蓋13的上面。因而這可以實時和根據需要振動(oscillate)，在希望獲得ICP現象的實施方式中，低壓區Zp可以在一定時間內振動。在圖17-圖17J中已示出了製造根據本發明的(更準確地，在圖9和圖9A中示出的那種)用於分離和濃縮顆粒的設備的方法的不同步驟。首先，形成第一基板(襯底)8，例如，由光滑的矽基板。典型地，其為直徑D等於IOOmm以及厚度E為500 μ m量級的矽「晶片」(圖17)。然後,進行第一光刻(photolithography)步驟:首先,使低厚度的正性光刻膠層9沉積在第一基板8的上面80上，然後暴露至光輻射下以限定最終產生的納米通道3的基本環形圖案800 (圖17A)。然後，進行第一基板8的第一反應性離子蝕刻(reactive ion etching) (RIE)步驟，在期望的高度h2下持續約10秒的時間以構造納米通道3，其中該高度h2可以是50至500nm (圖 17B)。然後，在第一基板8上進行第一熱氧化步驟，典型地在800° C至1200° C之間的溫度下，獲得了硬矽掩膜81 (圖17C)。然後，進行第二光刻步驟:首先，使低厚度的正性光刻膠層9』沉積在第一基板8的上面80上，然後暴露至光輻射下以限定覆蓋最終產生的納米通道3的環形圖案800和第一基板8的上面的外周的圖案(圖17A)。然後，進行第二 RIE蝕刻步驟，以構造對於蝕刻最終產生的微通道所需的硬矽掩膜81。換言之，未被樹脂9 』覆蓋的硬掩膜81的部分通過該第二 RIE蝕刻步驟去除(圖17E )。然後，進行第三光刻步驟，首先，使低厚度的正性光刻膠層9』沉積在第一基板8的上面80上，然後暴露至光輻射下以限定流體開孔(圖17F)。然後，進行深度反應性離子蝕刻(deep reactive-1on etching)(DRIE),在第一基板8上產生微通道的開孔。換言之，在第一基板8的厚度中產生盲孔(blind hole)l」、5」(圖 17G)。然後，進行第二和最終DRIE幹蝕刻步驟以最終蝕刻微通道1、5，並使它們開口至第一基板8的任一側(圖17H)。然後，對第一基板8進行第二和最終熱氧化步驟，以限定覆蓋第一基板8整個面的硬的矽氧化層82，從而確保所有流體通道(納米通道3和微通道1、5)的電絕緣(圖171)。然後通過分子密封技術，用形成第二蓋的低厚度玻璃基板13密封根據本發明的設備的上面(圖17J)。典型地，玻璃蓋13具有IOOmm的直徑Dl以及500 μ m級別的厚度El。蓋13的厚度El可以甚至小於200 μ m以便是可撓曲應變的，從而使得上文所述的通過臨時「增大(broadening)」的納米通道3能夠較快地填充流體通道,或在一定時間內能夠改變納米通道3的高度以在一定時間內獲得差異化的ICP現象。理所當然地，當期望根據本發明的設備具有的形成額外高度的塊僅充當密封至蓋13的間隔物33 (圖10A)，或者充當未密封至蓋13以確保蓋13應變(彎曲)的鄰接(abutment)的止擋件34時，因此應安排進行剛剛描述的製造步驟。在不背離本發明的範圍的情況下，可以預期其他實施方式或替換方式。因此，如果以描述的第一矽基板8用於製造根據本發明的設備，其也可以是玻璃基板、塑料基板。此外，如果已描述的第二玻璃基板13用於製造根據本發明的設備，其可以是聚二甲基矽氧烷(PDMS)蓋。此外，即使在詳細說明中沒有描述，環狀部分可以在中心微通道5的端部51與和納米通道3相鄰的蓋的部分通過配體的存在官能化，通過甲矽烷化官能團在它們的表面固定，以便在所述部分捕獲經濃縮的顆粒。換言之，在根據本發明的設備內部，可以通過官能化部位如抗體實施顆粒捕獲區。優選地，有些適宜向根據本發明的設備提供DNA晶片官能團的甲矽烷化官能團，是在以本申請人名義的專利申請W02008/006871中描述的那些。雖然詳細描述的案例描述了包括具有多個流體進口 10、12的微通道1，但是該微通道可以僅有單個進口，其具有引起較高失壓(pressure loss)的缺點，因為所有引入至微通道中的流體必須通過納米通道。參考文獻[ I ]: Mar k N.Hamb Iin e t al, Department of Electrical andComputerEngineering, Brigham Young University,USA: 「Selectivetrapping andconcentration of nanoparticles and viruses in dual-heightnanofluidicchanneI；[2]: SamueI M.Stavis et al, National Institute of StandardsandTechnology—Semiconductor Electronics Division, USA: 「Nanofluidicstructureswith complex three-dimensional surfaces，，。
權利要求
1.用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，包括: 第一微通道，具有至少一個第一開孔； 至少一個第二微通道，具有至少一個第二開孔、和端部； 所述第一微通道環繞至少部分的在所述端部的所述第二微通道； 所述第一微通道和所述第二微通道在所述端部通過至少一個納米通道連接，所述納米通道在所述第一微通道和所述第二微通道之間形成一限制，其幾何形狀在預定的時間期限內固定； 蓋，在所述端部結合所述第一微通道、所述第二微通道和所述納米通道，所述第一微通道和所述第二微通道製作在第一基板中，所述第一開孔和所述第二開孔開在該基板的同一面內。
2.根據權利要求1所述的設備，其中所述蓋製作在與所述第一基板裝配的第二基板中，所述納米通道由在所述第一基板和所述第二基板之間的間隔物限定。
3.根據權利要求1所述的設備，其中所述第一微通道具有兩個第一開孔。
4.根據權利要求3所述的設備，其中所述第二微通道具有單一的第二開孔。
5.根據權利要求1所述的設備，其中在所述第一和第二微通道之間的限制根據閉合的環狀或多邊形的幾何形狀而空間分布的，在所述第一和第二微通道之間的所述連接由一個或多個根據該幾何形狀分布的納米通道製成的。
6.根據權利要求5所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，進一步包括多個均勻地間隔在所述限制內部而分布`的形成額外高度的塊，所述塊具有至多等於所述限制的高度的高度h3，兩個相鄰的塊限定納米通道。
7.根據權利要求6所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中所述塊具有基本上等於由所述納米通道形成的所述限制的高度的高度h3，並且被密封至所述蓋，從而製成密封塊。
8.根據權利要求6所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中所述塊具有低於由所述納米通道形成的所述限制的高度的高度h3，並且未被密封至所述蓋。
9.根據權利要求1所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中所述蓋適於在致動器的動作下能夠被撓曲應變，同時在確定的時間期限內保持固定。
10.根據權利要求9所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中至少一個機電致動器附接在所述蓋的上面以使其撓曲應變。
11.根據權利要求10所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中所述機電致動器是壓電元件。
12.根據權利要求1所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，包括至少兩個由一個或多個具有閉合的環狀或多邊形形狀的納米通道形成的限制，圍繞單一的第二微通道一個相對於另一個相互同心設置。
13.根據權利要求12所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中由一個或多個納米通道形成的兩個限制之一的所述高度匕與由一個或多個納米通道形成的兩個限制的另一個的所述高度h4不同。
14.根據權利要求1所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，包括至少兩個第二微通道和至少兩個由一個或多個具有閉合的環狀或多邊形形狀的納米通道或其部分形成的限制，每一納米通道的部分或全部圍繞單一的第二微通道設置。
15.根據權利要求14所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中兩個納米通道之一的所述高度h3、h4或h5與兩個納米通道的另一個的所述高度h3、h4或h5不同。
16.根據前述權利要求任一項所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備，其中所述第二微通道在所述端部的部分與和所述納米通道相鄰的所述蓋的部分通過配體的存在官能化以使其表面通過甲矽烷化官能團固定，以便在所述部分捕獲經濃縮的顆粒。
17.用於操作根據權利要求1所述的用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，根據所述方法實施以下步驟: a/通過所述第一和第二微通道之一開始注入緩衝液體溶液； b/ 一旦所述緩衝液體溶液已到達所述納米通道、或者從所述納米通道溢流，從所述第一和第二微通道的另一個注入所述液體溶液。
18.根據權利要求17所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中步驟a/由所述第二微通道實施，而步驟b/由所述第一微通道實施。
19.根據權利要求17所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中緩衝液體溶液的所述注入被製成水動力注入模式，其中所述溶液根據步驟a/開始注入的所述第一或第二微通道的壓力分別高於所述第二或第一微通道的壓力。
20.根據權利要求17所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中將壓力施加於所述第一或第二微通道之一，並將低壓分別進一步施加於所述第二或第一微通道的另一個。
21.根據權利要求1 7所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中一旦實施步驟b/並且所述納米通道充滿所述緩衝液體溶液，實施步驟c/的注入含有顆粒的液體以從所述第一或第二微通道之一中分離和濃縮，所述顆粒具有低於通過所述納米通道的最小高度匕的尺寸以便分別通過所述第二或第一微通道的另一個回收，與之相反具有高於所述納米通道的最小高度h3的尺寸的所述顆粒至少部分在所述第一或第二微通道的外周部分通過其中根據步驟c/已經進行的注入進行濃縮。
22.根據權利要求21所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中根據步驟c/，具有高於所述納米通道的最小高度h3的尺寸的所述顆粒的至少一部分的濃縮在兩個同心的納米通道之間實施。
23.根據權利要求21所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中步驟d/實施於其中電位差施加於所述第一和第二微通道之間處，接著實施所述步驟c/的從所述第一微通道注入用螢光物質負載的顆粒。
24.根據權利要求23所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中在步驟c/中注入的所述液體是去離子水，而所述螢光物質是螢光素。
25.根據權利要求23所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中所述蓋作為在步驟c/中的所述液體注入的所述鹽分的函數而應變。
26.根據權利要求21所述的用於操作用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的設備的方法，其中以流體動力注入方式或電動注入方式實施步驟c/的含有顆粒的液體注入。
全文摘要
本發明涉及一種用於分離和濃縮存在於流體中的顆粒的納米和微流體的設備和方法。該設備，包括第一微通道，具有至少一個第一開孔；至少一個第二微通道，具有至少一個第二開孔、和端部；所述第一微通道環繞至少部分的在所述端部的所述第二微通道；所述第一微通道和所述第二微通道在所述端部通過至少一個納米通道連接，所述納米通道在所述第一微通道和所述第二微通道之間形成一限制，其幾何形狀在預定的時間期限固定；蓋，在所述端部結合所述第一微通道、所述第二微通道和所述納米通道，所述第一微通道和所述第二微通道製作在第一基板中，所述第一開孔和所述第二開孔開在該基板的同一面內。用於分離和濃縮生物樣品，如病毒、DNA或合成分子的應用。
文檔編號G01N1/40GK103185679SQ20121058148
公開日2013年7月3日 申請日期2012年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者科斯拉·艾策爾, 伊夫·富耶 申請人:法國原子能及替代能源委員會