具有人類主要組織相容性複合物(mhc)表型的轉基因小鼠、其實驗性使用及用途的製作方法

2023-04-24 13:33:56 1

專利名稱：具有人類主要組織相容性複合物(mhc)表型的轉基因小鼠、其實驗性使用及用途的製作方法
具有人類主要組織相容性複合物(MHC)表型的轉基因小鼠、其實驗性使用及用途本申請是申請日為2004年7月5日，申請號為200480028550. 9，發明名稱為「具有人類主要組織相容性複合物(MHC)表型的轉基因小鼠、其實驗性使用及用途」的中國專利申請的分案申請。相關申請相互參考本申請基於2003年7月30日遞交的美國臨時申請60/490，945 (代理人案卷號03495. 6093)並要求其優先權，在此通過引用將該申請的全部內容併入本申請。
背景技術：
目前人們正在研製許多用於人類癌症免疫療法及用於治療傳染性疾病(如痕疾、愛滋病、C肝病毒以及嚴重急性呼吸道綜合症(SARS))的疫苗。考慮到新興病原體可能出現的迅速程度，對可用於快速、可靠地評估疫苗策略和不同抗原表位的保護能力的動物模型進行改進非常重要。而且，體內研究已經被要求用於評估不易或無法通過體外試驗進行評價或測量的疫苗行為的重要變量，如疫苗免疫原性、疫苗組成、給藥途徑、組織分布以及其中初級和次級淋巴器官的參與。由於其簡單性和靈活性，至少在初期疫苗研製中，小動物(如小鼠)是一種很具吸引力的對麻煩並且昂貴的模型系統(如非人類靈長類動物)的替代物。在數例疫苗(這些疫苗已在野生動物研究中證明具有保護作用)的臨床試驗中觀察到的中度有效性(McMichael, A. J. &Hanke, T. Nat Med9，874-880 (2003))，也許可以部分通過由於動物MHC和人類HLA的最佳抗原表位不同而造成的人類和動物MHC對免疫應答結果的不同影響進行解釋(Rotzschke, 0. et al. Nature 348, 252-254 (1990)) 因此，除開一些缺陷，具有人類HLA表達的轉基因小鼠比野生小鼠更適於作為一種測試候選疫苗、評估疫苗可能誘導自身免疫性疾病的潛在風險，以及設計更好的基於人類限制性元件的治療方案的臨床前模型。細胞毒T淋巴細胞細胞毒T淋巴細胞(CTL)在消除傳染性疾病和某些癌症方面具有很關鍵的作用(P. Aichele, H. Hengartner, R. M. Zinkernagel and M. Schulz, J Exp Med 171(1990),p. 1815 ；L.BenMohamed, H. Gras-Masse, A. Tartar, P. Daubersies, K Brahimi, M. Bossus,
A.Thomas and P.DruhiIe, Eur J TmmunoI 27(1997), p. 1242 ；D.J.Diamond, J.York,J. Sun, C. L. Wright and S. J. Forman, Blood 90 (1997), p. 1751)。重組蛋白疫苗不能可靠地誘導 CTL 應答(Habeshaw JA, Dalgleish AG, Bountiff L, Newell AL, Wilks, D,Walker LC, Manca F. 1990 Nov ；11(11) :418-25 ；Miller SB, Tse H，Rosenspire AJ, KingSR. Virology. 1992Dec ; 191 (2) :973-7)。在一些重要疾病的治療中，其它一些含有減毒病原體的免疫疫苗的在人體內的使用由於安全方面的顧慮而受到阻礙。在過去幾年中，基於抗原表位的方法已被提出作為一種研製新的預防和免疫治療疫苗的可能性策略(MeliefCJ,Offringa R,Toes RE,Kast WM. Curr Opin Tmmuno1. 19960ct,8(5) :651-7 ；Chesnut Rff,Design testing of peptide based cytotoxic T—cell mediated imrnunotherapeutic totreat infiction disease, cancer, in PpowelI, MF, Newman, MJ(eds. )Vaccine Design 、The Subunit，Adjuvant Approach,Plenum Press，New_Yorkl995，847)。這種方法具有一些優點，如可選擇自然處理的抗原表位，使得免疫系統關注於病原體的高度保守和免疫顯性表位(R. G. van der Most,A. Sette,C. Oseroff,J. Alexander, K. Murali~Krishna, L. L. Lau,S，Southwood，J. Sidney, R. W. Chesnut，M. Matioubian and R. Ahmed, Jimmune) 157 (1996)，p. 5543)以及誘導多表位應答以阻止如在HIV、B肝病毒(HBV)和C肝病毒(HCV)感染中觀察到的突變逃逸。它還可以在需要THl應答時，除去可能優先引起TH2應答的抑制性T細胞決定族，相反亦然(Pfeiffer C，Murray J ，Madri J，Bottomly K. Immunol Rev. 1991Oct ；123 :65-84 ；P Chaturvedi，Q Yu, S Southwood, A Sette，and B Singh Int Immunol19968 :745-755) 0最後，它還提供了除去抗原中的可能誘導不良自身免疫性疾病的自身免疫T細胞決定簇的可能。使用CTL抗原表位肽以獲得保護性抗病毒或抗腫瘤免疫已在一些實驗性模型中得到實現(D. J. Diamond, J. York, J. Sun, C. L. Wright and S. J. Forman, Blood901997，p. 1751 ；J. E. J. Blaney, E. Nobusawa，M. A. Brehm, R. H. Bonneau, L. M. Mylin, T. M. Fu,Y. Kawaoka and S. S. Tevethia, J Virol 72 (1998)，p. 9567)。基於人類淋巴細胞應用的CTL抗原表位定義可能會由於導致不完全結果的環境和遺傳異質性以及分離CTL克隆的技術困難而形成誤導。目前所述的HLA I類或II類轉基因小鼠已被證明是一種能夠克服這些缺陷的很有價值的工具，這些帶有新CTL和T輔助細胞表位的動物模型(Hill AV. Annu Rev Immunol. 1998 ；16 :593-617 ；Carmon L,EI-ShamiKM,Paz A. ,Pascolo S,Tzehoval E,Tirosb B,Koren R,Feldman M,Fridkin M，LemonnierFA,Eisenbach L Int J Cancer, 2000Feb I ；85(3) :391-7)。這些小鼠還被用於證明i)肽HLA 親和力與免疫原性間的良好關聯(Lustgarten J，Theobald M，Labadie C，LaFace D，Peterson P，Disis ML, Cheaver MA, Sherman LA. Hum Immunol. 1997Feb ；52 (2) :109-18 ；Bakker AB，van der Burg SH, Huijbens RJ, DRijfhout JW, Melief CJ，Adema GJ, FigdorCG. Int JCancer. 1997Jan 27 ；70(3) :302-9), ii)鼠類和人類 CTL 系統在抗原處理(產生相同抗原表位)水平方面的顯著重疊，以及，iii)比較針對HLA轉基因小鼠和人類中的CTL 組成的大多數抗原的免疫動員(Wentworth, P. A.，A.Vifiello，J. Sidney, E. Keogh,P，W. Chesnut, H. Grey, A. Sette. 1996. Eur. J. Immunol. 26 :97 ;Alexander，J.，C. Oserof，J. Sidney, P. Wentworth, E. Keogh, G. Hermanson, F. V Chisari R. T，Kubo, H. M，Grey, A，Sette, 1997. J. Immunol. 159 :4753)。迄今為止，已研製出合成肽基CTL抗原表位疫苗，用於多種人類疾病的免疫治療。但是，在數例臨床試驗中僅觀察到了中度的療效(21)。這可能部分是因為這些疫苗不能引起足夠強的CTL應答。實際上，近期的報告提示需要CD4+T輔助細胞，以獲得最大的CTL應答(A. J. Zajac, K. Murali-Krishna, J. N. Blattman and R. Ahmed, Curr Opin Immunol10(1998)，p. 444 ；Firat H，Garcia-Pons F，Tourdot S，Pascolo S，Scardino A，GarciaZ，Michel ML，Jack RW, Jung 0，Kosmatopoulos K，Mateo L，SuhrbierA, Lemonnier FA,Langlade-Dernoyen PEur J Irmnunol 29，3112，1999)0CTL是針對病毒感染的保護性免疫的關鍵因素，但體內激活CTL的條件還沒有被完全認識。現在，Th細胞通常是利用合成肽激活CTL的基礎的觀點已經得到接受。對於合成CTL抗原表位肽，一些研究指出T輔助淋巴細胞剌激是引起最大的CTL應答所必需的(C.Fayolle, E. Deriaudand C. Leclerc, J Immunol 147(1991)，p,4069 ；C. Widmann,P. Romero, J. L. Maryanski, G. Corradin and D. Valmori, J Immunol Meth 155(1992),p. 95 ；M. Shirai, C. D. Pendkton, J. Ahlers, T. Takeshita, M. Newman and J. A. Berzofsky, JImmunol 152(1994), p. 549 ；J. P. Sauet, H. Gras-Masse, J. G. Guillet and E.Gomard, IntImmunol 8 (1996). p. 457)。一些該類研究表明激活⑶8+細胞需要⑶4+T輔助細胞和⑶8+T細胞間同時發生的相互作用依靠同樣的抗原呈遞細胞呈遞它們的同源表位(Ridge JP,DiRosa F,Matzinger P. Nature. 1998Jun 4 ；393(6684) :474-8)。激活 CTL所需的這三種細胞相互作用的關聯性在病毒抗原表位和動物模型的研究中得到了確認，因為體內當CTL和Th抗原表位完全連接，而非僅僅以相互分開的混合物存在時，CTL的誘導最為有效(Shirai M，Pendleton CD, Ahlers J, Takeshita T, Newman M, Berzohky JA. J Immunol. 1994Jan 15 ；152(2) :549-56 ;Oseroff C,Sette A,Wentworth P,Celis E,Maewal A,Dahlberg C,FikesJ，Kubo RT,Chesnut Rff, Grey BX Alexander J. Vaccine. 1998May ；16(8) :823-33)。CTL 和Th抗原肽有效誘導CTL應答的能力已在實驗模型(C. Fayolle,E. Deriaud and C. Lec I ere,J Immunol 147(1991), p,4069 ；C. ffidmann, P. Romero, J.L. Maryanski, G.Corradin andD. Valmori，JImmunol Meth 155 (1992)，p. 95)和人身上得到證明。而且，有效的Th應答不僅在最大化地引起CTL應答中，而且在維持CTL記憶方面都起著重要的作用(E. A. Walter, P. D. Greenberg, M. J. Gilbert, R. J. Finch, K-S. Watanabe, E. D. Tbomas and S. R. Riddell,N Engt J Med 333(1995)，p.1038 ；Riddell SR, Greenberg PD, In Thomas ED, Blume KG,Forman SJ(eds) Hematopoietic Cell Transplantation,2nd edn. Malden,MA BlackwellSciencelnc.，1999)。最後，早已有文獻表明⑶4+T 「輔助」細胞對協調針對外源性抗原的分子和體液免疫應答很關鍵。最近，一種同時表達有HLA-A*0201 I類和HLA-DRl II類分子的轉基因(Tg)小鼠模型被建立起來(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J,Diamond DJ, Hum, Immunol. 2000Aug ；61 (8) :764-79)。該作者報導說HLA-A*0201 和HLA-DRl轉基因在體內均有效，MHC I類和II類分子都被用作限制性元件，HLA-DRl轉基因的產物增強了 HLA-A*0201限制性的抗原特異性CTL應答(BenMohamed L，KrishnanR, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum, Immunol. 2000Aug ；61 (8) 764-79)。值得注意的是這些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠表達了自身的MHCH-2I類和II類分子。因為具有內源性小鼠MHC I類基因表達的HLA I類轉基因小鼠優先並通常專門會引起 H-2 限制性 CTL 應答(C Barra, HGournier, Z Garcia, PN Marche, E Jouvin-Marche,P Briand, P Fillip, and FALemonnier J Immunol 1993150 :3681-3689 ；Epstein H,Hardy F. , May JS, Johnson MH, Holmes N. Eur J Immunol. 1989Sep ；19(9) 1575-83 ；LeAX ；EJ Bernhard, MJHolterman, S Strub, PParham, E Lacy, and VH Engelhard JTmmunoI1989142 1366-1371 ；Vitiello A, Marchesini D, Furze J, Sherman LA, Chesnut Rff. , JExp Med. 1991 Apr I ；173(4) :100715)，而具有內源性小鼠MCH II類基因表達的HLA II類轉基因小鼠不能誘導可靠的HLA II類限制性抗原特異性應答(Nishimura Y, Iwanaga T,Inamitsu T, Yanagawa Y, Yasunami M, Kimura A, Hirokawa K, Sasazuki T., J TmmunoI1990Jut I ；145(1) :353-60)，這些HLA-A*0201/DR1 Tg小鼠對評估對抗原的人類特異性應答的作用有限。
然而，在HLA I類轉基因而H-2I類基因敲除小鼠，或HLA II類轉基因而H-2II類基因敲除小鼠中，只出現了 HLA限制性CTL免疫應答(Pascolo S，Bervas N，UreJM,Smith AG,Lemonnier FA,Perarnau,B. ,J Exp Med. 1997Jun 16 ;185(12) 2043-51 ；MadsenL, Labrecque N, Engberg J, Dierich A, SVejgaard A, Benoist C, Mathis D, FuggerL.,Proc Natl Acad SciUSA_1999Aug 31 ;96 (18) :10338-43)。事實上，與仍具內源性鼠H-2I類分子的HLA-A2. I轉基因小鼠相比，HLA-A2. I轉基因而H-2類基因敲除(KO)小鼠表現出了達到增強HLA-A2. I限制性應答的能力。(Pascolo，S. etal. J Exp Med 185，2043-2051 (1997) ；Ureta-Vidal, A. , Firat, H. , Perarnau, B. &Lemonnier, F. A. J Immunol163,2555-2560(1999) ；Firat, H. etal. , Int Immunol 14,925-934(2002) ；Rohrlich,P. S. etal. ,Int Immunol 15，765-772 (2003))。根據小鼠 是否缺乏H-2II類分子，本發明人對HLA-DRl轉基因小鼠進行了類似的觀察(八.？&」於，數據尚未發表)。另外，在缺乏鼠MHC分子競爭的情況下，HLA-A2. I轉基因而H-2類/-KO小鼠或HLA-DRl轉基因而H-2I類/-KO小鼠只發生了 HLA 限制性免疫應答(Pascolo, S. et al. J Exp Medl85，2043-2051 (1997))(A. Pajot，數據尚未發表)，促進了對HLA限制性⑶8+和⑶4+T細胞應答的監控。但是，針對病原體的保護性免疫應答通常需要T輔助細胞和細胞毒性CD8+T細胞的協調合作，因而不能在單獨的HLA類或HLA II類轉基因小鼠身上進行研究，因為不可能在同一隻小鼠身上同時進行HLA I類和II類人類免疫應答的評估。相應地，還需要有一種方便的動物模型系統用來對包含人類CTL抗原表位的候選人體疫苗的免疫原性進行測試，而且，在一些情況下，還需要高效⑶4+Th(輔助T淋巴細胞)抗原表位來支持抗病毒和抗腫瘤CD8+T細胞活性(A. J.Zajac，K. Murali-Krishna，J. N. Blattman and R. Ahmed,Curr Opin Immunol 10(1998), p. 444 ；Firat H,Garcia-Pons
F,Tourdot S, Pascolo S, Scardino A, Garcia Z, Michel ML, Jack Rff, Jung 0,Kosmatopoulos K, Mateo L, Suhrbier A, Lemonnier FA, Langlade-DemoyenP, Eur JIrmnunol 29，3112，1999)。另外，還需要有一種能允許同時對CTL應答、TH應答(尤其是THl或TH2應答)和體液應答之間的相互協調進行評估的系統。發明概述本發明人已通過提供缺乏H-2 I類和II類分子，而具有HLA-A2. I和HLA-DRl分子的轉基因小鼠，滿足並超過了這種需要。具體地說，本發明提供了小鼠，其包含(I)突變的H-2 I類和II類分子；和(2)表達HLAI類轉基因分子，或表達HLA II類轉基因分子，或同時表達HLA I類轉基因分子和HLA II類轉基因分子。這些小鼠為構建對於人類具有最大體內免疫原性的疫苗的研製和優化提供了一種有用的模型。具體地說，這種小鼠使得在一種動物身上對免疫適應性應答的三大因素(抗體、輔助細胞和細胞毒淋巴細胞)的整體分析成為可能，也使得對疫苗針對抗原攻擊的保護作用的評估成為可能。本發明中的小鼠缺乏H-2 I類和II類分子，具有HLA I類轉基因分子和HLA II類轉基因分子表達，代表了一種完全人化的，可用於同時檢測抗原特異性抗體、抗原特異性HLA-DRl限制性T細胞應答和抗原特異性HLA-A2限制性T細胞應答的試驗小鼠。這些小鼠將有助於研究CTL應答、TH應答(尤其是THl或TH2應答)，以及，任選地，體液應答之間的相互協調是如何進行的。這些小鼠代表了一種基礎和應用疫苗學研究的最佳工具。本發明的第一種實施方式提供了一種包含斷裂的(disrUpted)H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因和功能性I類或II類轉基因的轉基因小鼠。本發明的第二種實施方式提供了一種包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因的轉基因小鼠。在一些實施方式中，HLA I類轉基因是HLA-A2轉基因，而HLA II類轉基因是HLA-DRl轉基因。在另一些實施方式中，HLA-A2轉基 因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發明的另一實施方式中還提供了缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因的轉基因小鼠。在一個實施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在一些實施方式中，HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發明的另一實施方式提供了一種可同時確定候選抗原或抗原組中存在一種或多種抗原表位的方法，其中所述一種或多種抗原表位可引起特異性體液應答、TH HLA-DRl限制性應答和/或CTRL HLA-A2限制性應答。該方法包括將候選抗原或抗原組施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLAII類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中；測定小鼠體內對抗原的特異性體液應答；測定小鼠體內對抗原的TH HLA-DRl限制性應答；並測定小鼠體內對抗原的CTRLHLA-A2限制性應答。如在小鼠體內觀察到對抗原的特異性體液反應，說明抗原內存在引起體液應答的抗原表位。如在小鼠體內觀察到對抗原的TH HLA-DRl限制性應答，說明抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性應答的抗原表位。如小鼠體內觀察到對抗原的CTRL HLA-A2限制性應答，說明抗原中存在引起CTRL HLA-A2限制性應答的抗原表位。在一些實施方式中，試驗方法包括對小鼠體內的對抗原的Thl-特異性應答和Th2-特異性應答進行測定。在這種情況下，如在小鼠體內觀察到對抗原的Thl-特異性應答，說明存在引起小鼠體內對抗原的Thl-特異性應答的抗原表位，而在小鼠體內觀察到對抗原的Th2-特異性應答，說明存在引起小鼠體內對抗原的Th2-特異性反應的抗原表位。本發明還提供一種確定在候選抗原或抗原組中存在HLA DRl-限制性T輔助細胞抗原表位的方法，該方法包括將候選抗原或抗原組施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠；並測定小鼠體內對抗原的THHLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答。如在小鼠體內觀察到針對抗原TH HLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答，說明抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答的抗原表位。另外，本發明提供了一種包含通過以上段落中的方法確定出的HLADRl-限制性T輔助細胞抗原表位的分離的抗原。在一些實施方式中，該分離的抗原還包括引起體液應答的抗原表位和/或引起CTRL HLA-A2限制性應答的抗原表位。在一些實施方式中，包含HLADRl-限制性T輔助細胞抗原表位的抗原包含多肽。在另一些實施方式中，包含HLA DRl-限制性T輔助細胞抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些實施方式中，包含HLADRl-限制性T輔助細胞抗原表位的抗原包含DNA、RNA,或DNA和RNA。
另外，本發明提供了一種確定候選抗原或抗原組中是否存在HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位的方法，該方法包括將候選抗原或抗原組施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II基因、功能性HLA-A2轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRH2m° IAP °基因型的小鼠中；並測定小鼠體內對該抗原或抗原組的HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。如在小鼠體內觀察到針對該抗原或抗原組的HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答，說明抗原或抗原組中存在引起HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答的抗原表位。本發明提供了一種包含通過以上段落中方法確定的HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位的分離的抗原。在一些實施方式中，抗原還包含引起體液應答的抗原表位和/或引起TH HLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答的抗原表位。在一些實施方式中，包含HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位的抗原包含多肽。在一些實施方式中，包含HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位的抗原包含多核苷酸。在另一些實施方式中，包含HLA-A2-限制性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位的抗原包含DNA、RNA、或DNA和RNA。該發明還提供了一種比較由兩種或兩種以上的疫苗引起的T-輔助細胞應答的方法。這種方法包括將第一種候選疫苗施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由該疫苗引起的T-輔助細胞應答；將第二種候選疫苗施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由第二種疫苗引起的T-輔助細胞應答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DR1+ P 2m° IA P °基因型的轉基因小鼠中，測量小鼠體內由該種疫苗引起的T-輔助細胞應答；通過比較每種疫苗所引起的T-輔助細胞應答，確定各種疫苗引起T-輔助細胞應答的能力。在一些實施方式中，T-輔助細胞應答為HLA-DRl限制性應答。另外，本發明提供了一種比較由兩種或兩種以上疫苗引起的細胞毒性T淋巴細胞應答的方法。該方法包括將第一種候選疫苗施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由第一種疫苗引起的細胞毒性T淋巴細胞應答；將第二種候選疫苗施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由第二種疫苗引起、的細胞毒性T淋巴細胞應答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA P °基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由該種疫苗引起的細胞毒性T淋巴細胞應答；通過比較各種疫苗所引起的T細胞毒性細胞應答確定各種疫苗引起細胞毒性T淋巴細胞應答的能力。在一些實施方式中，T細胞毒性細胞應答為HLA-A2限制性應答。另外，本發明提供了一種可同時比較由兩種或兩種以上疫苗引起的T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答的方法。該方法包括將第一種候選疫苗施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉 基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA@°基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由第一種疫苗引起的T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答；將第二種候選疫苗施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLAII類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，並測量小鼠體內由第二種疫苗引起的T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答；將每種需要比較的其他候選疫苗分別施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA
I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA@°基因型的轉基 因小鼠中，測量小鼠體內由該種疫苗引起的T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答；通過比較每種疫苗所引起的T-輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答確定各種候選疫苗引起T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答的能力。在一些實施方式中，T-輔助細胞應答為HLA-DRl限制性應答，而T細胞毒性細胞應答為HLA-A2限制性應答。本發明還提供了一種可同時確定在施用一種抗原或包含一種或多種抗原的疫苗後，小鼠體內的體液應答、T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答的方法。該方法包括將抗原或包含一種或多種抗原的疫苗施用於包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，測定小鼠體內對該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應答，測定小鼠體內對該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細胞應答，測定小鼠體內對該抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的細胞毒性T淋巴細胞應答。在一些實施方式中，T-輔助細胞應答為TH HLA-DRl限制性應答。在一些實施方式中，T細胞毒性細胞應答為CTRL HLA-A2限制性應答。基於預先選擇的標準，本發明還提供了一種優化兩種或兩種以上用於人類的候選疫苗組合的方法。該方法包括同時確定小鼠在施用兩種或兩種以上候選疫苗組合後的體液應答、T-輔助細胞應答和細胞毒性T淋巴細胞應答。通過向包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中施用抗原或包含一種或多種抗原的疫苗，測定小鼠體內對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的特異性體液應答，測定小鼠體內對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的T-輔助細胞應答，測定小鼠體內對抗原或包含一種或多種抗原的疫苗的細胞毒性T淋巴細胞應答，並按照預先選擇的標準根據測定結果選擇最優疫苗。在一些實施方式中，兩種或兩種以上候選疫苗的不同之處僅在於疫苗中的抗原與佐劑的比例不同。在一些實施方式中，兩種或兩種以上候選疫苗的不同之處僅在於疫苗中佐劑的類型不同。另一方面，本發明提供了一種確定疫苗在施用於人體後是否存在引起自身免疫疾病風險的方法。該方法包括將疫苗施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠，或缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因，並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IAP °基因型的轉基因小鼠中，並測定小鼠體內的自身免疫應答。 如觀察到小鼠體內出現自身免疫應答，表明疫苗在施用於人體後存在引起自身免疫疾病的 風險。本發明還提供了一種包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因和功能性HLAI類或II類轉基因的分離的轉基因小鼠細胞。另外，本發明提供了一種包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因的分離的轉基因小鼠細胞。在一些實施方式中，HLA I類轉基因為HLA-A2轉基因，而HLA II類轉基因為HLA-DRl轉基因。在另一些實施方式中，HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。另外，本發明提供了一種缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因的分離的轉基因小鼠細胞。在一些實施方式中，轉基因小鼠細胞具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在另一些實施方式中，HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。


本發明將結合以下圖示進行更詳細的描述圖I所示為轉基因分子在細胞表面表達的流式細胞檢測分析。(a)取自HLA-DRl-轉基因 H-2 II 類-KO (DR1+CII-，左側)、HLA_A2. 1-/HLA-DR1-轉基因 H-2 I 類-/II 類-K0(A2+DR1+CI-CII-，中)和 HLA-A2. I-轉基因 H-2 I 類/-KO(A2+CI-，右側)小鼠的脾細胞，使用FITC-標記W6/32 (抗-HLA-ABC，橫坐標)或生物素化的28-8-6S (抗_H_2Kb/Db，縱坐標)m. Ab染色，後者以PE-標記抗-小鼠Ig G顯色。(b)從同種小鼠身上取得的B220+脾B淋巴細胞，使用FITC-標記L243 (抗-HLA-DRl，上)和PE-標記AF6-120. I (抗H-2IAPb，下)m. Ab 染色。圖2顯示了具有指定基因型的小鼠體內⑶8+和⑶4+脾T細胞數量和BV片段的用途(基於免疫掃描分析)。(a)取自HLA-DRl-轉基因H-2II類-KO(DR1+CII-，左側)、HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因 H-2 I 類-/II 類-KO(A2+DR1+CI-CII-，中)和 HLA-A2. I-轉基因H-2類/-KO (A2+CI-,右側)小鼠的脾細胞，使用PE-標記CT-⑶4 (抗-小鼠⑶4，縱坐標)和FITC-標記53-6. 7(抗-小鼠⑶8，橫坐標)m. Ab染色。數字與⑶4+(左上部分)或CD8+(右下部分)T細胞在總的脾細胞中的百分比相對應。(b和c)用於BV片段家族(1-20)的提純脾⑶8+(b)和⑶4+(c) T細胞進行免疫掃描TR-PCR分析，採用正向BV家族(1_20)特異的和反向BC引物。有效重排的BV片段家族的典型圖像包括一系列相差3個核苷酸的帶高斯分布的波峰。該圖示說明了使用具有HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因H-2 I類-/II類-KO代表性小鼠的結果。圖3所示為HBs-特異性抗體、細胞溶解及增殖應答。對HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因H-2 I類/11類-KO小鼠進行HBs Ag-編碼質體-DNA肌肉注射免疫，並對進行和未進行免疫的小鼠分別進行測驗。(a)體液(上)，細胞溶解(中)和增殖(下)應答及對典型性HBsAg-DNA-免疫小鼠的特異性對照組。對含有中小HBV包膜蛋白的HBsAg分子及preS21(l9_134肽進行的抗體(IgG)滴度在ELISA分析中得到確定。使用相關(HBsAg348_357，HLA-A2. I-限制性 )或對照(HBsAg371.，H-2Kb-限制性 A ;和 MAGE_3271_279，HLA-A2. I-限制性d)肽脈衝的RMAS-HHD靶細胞對不同效應器與靶器官(E/T)比率下的細胞溶解活 動進行評估。使用相關(HBsAg180_195, HLA-DRl-限制性)或對照(HBsAg 8，H-2IAb-限制性和HIV I Gag263_278，HLA-DRl-限制性)肽對增殖應答進行測定。(b)將6隻(1_6)HBsAg-DNA-免疫小鼠進行的抗體(IgG，上)、細胞溶解(中)和增殖(下)應答與6隻初次接受試驗的小鼠的平均應答(0)比較進行了類似評估。在以HBsAg348_357，免疫顯性(填充條帶)或HBsAg335_343,亞顯性(subdominant)(灰色條帶)肽脈衝的RMAS-HHD祀細胞上檢測到E/T比率為30/1的細胞溶解活性。圖4顯示了保護分析的結果。使用編碼HBsAg的質粒DNA對HLA-A2. I-/HLA-DRl-轉基因H-2I類/11類-KO小鼠進行(對照組不進行)兩次免疫。最後一次免疫完成15天後，使用表達HBsAg或HBx蛋白的IO7PFU的rVV對小鼠進行腹膜內攻擊。4天後，對這些小鼠分別進行卵巢內病毒滴度測試。給出了 rVV-HBsAg(I，n = 10)攻擊的HBsAg-DNA-免疫小鼠，rVV-HBsAg(N, n = 6)攻擊的初次試驗的小鼠、rVV-HBx(Ix, n = 6)攻擊的HbsAg-免疫小鼠和rVV-HBx(Nx，n = 6)攻擊的初次試驗小鼠的結果(rVV PFU/卵巢，以log 10表不)。圖5 顯示了 pcmv S2/S 免疫後的 HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠的 AC 抗-pre S2 應答。圖6顯示了 pcmv S2-S免疫後的HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠對HLA-A2限制性抗原表位的T CD4增殖應答。圖7 顯示了 pcmvS2/S 免疫後的 HLA-A2+DR1+CI-CII-小鼠對 HLA-A2 限制性HBS (348-357)抗原表位的CD8T細胞的細胞毒性應答。序列SEQ ID NO :1包含以下部分核苷酸1-1205包含HLA-A2啟動子；核苷酸1206-1265 HLA-A2引導序列；核苷酸1266-1565為人P2微球蛋白cDNA ;核苷酸1566-1610 (Gly4Ser) 3接頭；核苷酸2441-4547，為含有HLA-A2外顯子2和部分內含子3的節段；核苷酸2441-4547，為含有部分內含子3、外顯子4_8和部分H2Db基因3'非編碼區域的節段。SEQ ID NO 2是DRA*0101基因的核苷酸序列。核苷酸1-15279是定位於HLA-DRalpha基因5』的啟動子，核苷酸15280-15425是外顯子1，核苷酸15344-15346是ATG起始密碼字，核苷酸17838-18083是外顯子2，核苷酸18575-18866是外顯子3，核苷酸19146-19311是外顯子4，核苷酸20008-20340是外顯子5。SEQ ID N0:3是DRB1*010101基因的核苷酸序列。核苷酸7391-7552是外顯子I，核苷酸7453-7455是ATG起始密碼子，核苷酸15809-16079是外顯子2，核苷酸19536-19817是外顯子3，核苷酸20515-20624是外顯子4，核苷酸21097-21121是外顯子5，核苷酸21750-22085 是外顯子 6。 發明詳述除非特別說明，本發明的實踐將採取細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的傳統技術。這些技術在以下文獻中進行了詳細的解釋。例如Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2nd Ed. , ed. By Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press :1989) ；DNA Cloning,Volumes I and II (D.N. Glover ed. , 1985) ；01igonucleotide Synthesis(M. J. Gaited. ,1984) ；Mullis etal. U. S.Pat.No. 4,683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S. J. Higgins eds. 1984) !Transcription And Translation (B.D. Hames&S.J. Higgins eds. 1984) ；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.,1987) !Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B.Perbal,APractical GuideTo Molecular Cloning (1984) ；the series, Methods In ENZYM0L0GY(J. Abelson andM. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc. , New York), specifically, Vols.154and155(ffu et al. eds. ) and Vol. 185, " Gene Expression Technology " (D. Goeddel,ed. ) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M. P. Caloseds. ,1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker, eds. ,Academic Press,London,1987) ；HandbookOf Experimental Immunology,Volumes V(D. M. Weir and C. C. Blackwell,eds. ,1986) ；andManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N. Y.，1986)。本發明提供了包含⑴突變型H-2 I類和II類分子和⑵表達HLAI類轉基因分子、或HLA II類轉基因分子、或HLA I類轉基因分子和HLAII類轉基因分子的小鼠。本發明中的缺乏H-2 I類和II類分子，並具有HLA I類和II類轉基因分子表達的小鼠代表了一種完全人化的實驗性小鼠，可用於同時檢測是否存在抗原-特異性抗體、抗原-特異性HLA-DRI限制性T細胞應答及抗原-特異性HLA-A2限制性T細胞應答。這些小鼠有助於研究CTL應答、TH應答(尤其是THl或TH2應答)和，任選地，體液應答之間的相互協調是如何進行的。這些小鼠為基礎以及應用疫苗學研究提供了最佳工具。本發明提供了一種包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因和功能性HLA I類或II類轉基因的小鼠。在一些實施方式中，轉基因小鼠包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因。這種小鼠可以說是一種完全人化的試驗小鼠，因為它可被用於同時檢測抗原-特異性抗體，抗原-特異性HLA-DRI限制性T細胞應答和抗原-特異性HLA-A2限制性T細胞應答是否存在。部分如此處提供的實施例所示，並且每個專業人士通常都能從本發明中清楚看到的是HLA-A2. 1-/HLA-DRI-轉基因H2-I/II類-KO小鼠具有通過DNA免疫產生HBsAg-特異性抗體、CD4+輔助細胞和CD8+溶細胞T細胞應答的能力。這些在每個單獨受試小鼠身上觀察到的應答指向的是和人類應答一樣的免疫顯性表位，並且表現為免疫動物對HBsAg重組體疫苗病毒的特異性保護。T輔助細胞對於抗體應答的完全成熟(Katz, D. H. &Benacerraf, B. , AdvImmunol 15，1-94 (1972))，細胞毒性T淋巴細胞(CTL)激發的針對很多表位的應答(von Boehmer, H.&Haas, ff. , J Exp Med 150,1134-1142 (1979) ；Keene, J. A. &Forman,J.，J ExpMed 155,768-782(1982)),以及 CTL 長期維護都很至關重要(Matloubian, M.，Concepcion, R. J. Mhmed, R.，JVirol 68,8056-8063 (1994))。兩種抗體(Lefrancois, L.，JVirol 51,208-214(1984))以及 CTL(Zinkernagel，R.M.&Welsh，R.M.，J Immunol 117，1495-1502(1976))都是抵抗病毒感染的保護性免疫的關鍵成分。實際中，有效的HBsAg-特異性抗體和CTL應答在HLA-A2. 1/HLA-DR1-雙轉基因、H-2 I類/11類-KO小鼠身上觀察到，而並沒有在HLA-A2. I-單轉基因H-2I/II = KO小鼠身上觀察到。因此，HBsAg-特 異⑶4+T輔助細胞對於產生有效的HBsAg-特異性CTL和抗體應答很重要。這些結果與在HBsAg-免疫小鼠(Milich, D. R.，Semin LiverDis 11,93-112(1991))及 HBsAg-接種的人上(Celis, E. , Kung, P. C. &Chang, T. ff. , J Immunol 132，1511-1516 (1984))進行的研究相符，提示抗-HBs抗體應答的產生取決於CD4+T細胞。表達HLA-A2. I I類和HLA-DR1 II類分子的轉基因小鼠已經產生(BenMohamed，L.et al. Hum Immunol 61，764-779 (2000))。作者提出 HLA-A2. I 和 HLA-DR1 分子都是體內功能性限制性元件，HLA-DRl轉基因的產物能增強HLA-A2. I限制性抗原-特異性CTL應答。但是，發生在小鼠上的這些免疫應答，其於人類的關聯性被以下事實削弱了 這些小鼠仍然表達出它們自身的H-2 I類和II類分子，通常這些被優先並常常是專門作為對抗原的限制性兀件使用(Ureta-Vidal,A. ,Firat,H. ,Perarnau, B. &Lemonnier,F. A. , J Immunol 163,2555-2560(1999) ；Rohrlich,P. S. etal. , Int Immunol 15，765-772 (2003)) (A. Pajot，數據尚未發表)。此處描述的發明通過提供HLA-A2. 1/HLA-DR1-轉基因、H-2 I類/11類-KO小鼠克服了該限制。在一些實施方式中，HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H_2 I類/11類-KO小鼠在^ 2m-K0背景下表達HLA-A2. I單鏈，其中的人類P 2m通過肽鍵與HLA-A2. I重鏈通過共價鍵相連。^從^^基因失活，使得它們還缺乏在細胞表面傳統表達的H-2 IA和IE II類分子，因為在H-2b單倍體中H-2IEa是假基因。此處提供的結果說明這種小鼠不具有H-2 I類和II類分子的細胞表面表達。但是，在一例報告中指出，自由I類重鏈，尤其是H-2Db，可能存在於P2m-K0小鼠細胞表面，並可能引起同種異體反應性應答。即便如此，由於這種小鼠缺乏多肽，它們不會干擾抗原-特異性免疫應答(Bix，M. &Raulet, D.，J Exp Med 176，829-834(1992))。這一點在 Allen et al 的報告中得到了支持(Alien，H.，Fraser, J.，Flyer, D. , Calvin, S. &Flavell, R. , ProcNatl Acad Sci U S A 83，7447-7451 (1986))，該報告確認即使細胞內不呈現P 2m表達，細胞表面也存在H-2Db表達，但這種Db抗原不會被Db-異種特異性或Db-限制性細胞毒性T淋巴細胞識別。另外，Db抗原不能被大多數天然Db的單克隆抗體識別。儘管如此，在HLA-DR a單轉基因小鼠中，非傳統HLA-DR a/H_2IE P b雜交複合體可某種程度地在細胞表面進行表達，至少在缺乏HLA-DRP鏈時(Lawrance，S. K. etal.，Cell 58,583-594(1989))。除開這些發現，即使使用會同這些雜交分子發生反應的mAb(17-3-3S)，採用血清學的方法也未在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I類-/II類-KO小鼠的細胞表面測出這些非傳統分子(0zato,K. ,Mayer,N. &Sachs,D. H. , J Immunol124，533-540(1980))(圖la和數據未被顯示)。另外，對這些小鼠的HBsAg-特異性和HIV I-Gag-特異性T細胞應答的研究結果均表明HLA-A2. I和HLA-DRl分子作為限制性元件的專門用途。這說明非傳統HLA-DR a /H-21E P b雜交分子不如傳統HLA-DR a /HLA-DRP分子穩定，而且它們可能只存在於缺少HLA-DRP鏈的情況中。採用整個(H-2IA^\ IA a \ IE@b)H-2II類基因區域以及H-2Db基因被刪除的小鼠菌株進行分析，以完全排除此可能性。對取自第一種動物的脾細胞的初步分析顯示出與在HLA-DRl-轉基因H-2II類-K0(la ^bo)小鼠身上所觀察到的類似的⑶4+T細胞池再生，提示這些小鼠的HLA-DRl-限制性 CD4+T 細胞應答與 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I 類-/II 類-KO 小
鼠的等同。與親代HLA-A2. I-轉基因H_2 I類-KO小鼠相比，HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因，H-2 I類-/II類-KO小鼠的外周⑶8+T淋巴細胞從數量和質量上都與完全多樣化類似，至少在T細胞受體(TCR)BV基因片段的利用方面。與野生動物相比，部分恢復，尤其是CD8+T細胞池的部分恢復，一直是對具有嵌合(原小鼠的0 3結構域)111^42.1分子表達的單HLA-轉基因小鼠的一個觀察對象。不管a 3結構域的置換，小鼠的⑶8與HLA-A2. 2分子之間也具有次最優的相互作用，因為Co-晶體分析表明人類⑶8也與HLA-A2. I重鏈a 2結構域相互接觸(Gao, G.F. etal.，Nature 387，630-634(1997))。次最優的協同作用還可能在內質網中發生，在內質網中，許多分子(TAP，tapasine，ERp 57)參與MHC I類分子的生物合成。但是，在這個階段，文獻唯一報導的這些小鼠和人類內質網分子的功能性差異(即人類的有效轉運，而不是羧基末端帶有正電荷的小鼠細胞溶質肽TAP) (Momburg,F. ,Neef jes,J. J. &Hammerling, G. J.，Curr Opin Immunol 6, 32-37 (1994))與通過疏水的 C-末端結合肽的HLA-A2. I分子無關，既然這些肽被小鼠和人類TAP有效地轉運。儘管⑶8+T淋巴細胞的數目在單HLA-A2. I轉基因，H-2類/-KO小鼠和HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因H-2 I類-/II類-KO小鼠中較低，然而它們在抗HBsAg方面起著有效的作用，並且，重要的是，後一種小鼠可產生與人類類似的抗體、輔助細胞和細胞溶解等淋巴細胞應答。妨礙基於T抗原表位的針對T淋巴細胞的疫苗設計的困難之一是HLA I類/11類分子多態性。HLA-A2. I和HLA-DRl分子在人類個體中具有顯著比例的表達(HLA-A2. I 30-50%, HLA-DRl 6-18% )。儘管已知HLAI類分子超家族中功能簇是基於呈遞的肽34組的顯著重複，但對由各種HLAI類同型或等位變體引起的應答的個體分析中，確定其最佳抗原表型仍然是迫切期望的。這對於設計新的監控免疫應答的試劑，例如四聚體fHLA-I類或HLA-II類)尤其重要。由於同樣的原因，獲取具有HLA-A2. I和其它HLA II類分子共同表達的小鼠菌株很有幫助，即使肽與HLA II類分子的連接比與I類分子的連接限制少。基於此處的結論，更多的HLAI類/11類轉基因H-2 I類-/II類-KO小鼠可被設計作為這些以及其它目的。儘管HLA-轉基因H-2-K0小鼠使得進行可很好的可移置於人的抗原肽的免疫原性的詳細分析和優化成為可能(Rohrlich, P. S. et al.，Int Immunol 15，765-772 (2003)；Loirat, D. , Lemonnier, F.A.&Michel, M. L. , JTmmunoI 165,4748-4755 (2000) ；Scardino,A.etal.，Eur J Immunol 31，3261-3270 (2001))，但這對於疫苗佐劑組成的研究的作用並不明顯。這可能是由於兩種物種之間在抗原激發的反應早期多種啟動的效應器的不同引起的。將來，不斷增加對先天免疫方面的基礎知識的認識，可能有助於更加完善小鼠免疫系統的人類化。總之，本發明描述了一種優化的、人類化轉基因小鼠模型，小鼠中的H-2I類(小鼠@ 2m)和II類(H-2 IA ^b)基因被刪除並被相應的人類基因HHD(HLA-A*0201)，HLA-DRA*0101 和 HLA_DRB1*0101 替代。HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因 H-2I 類-/II 類-KO 小鼠的細胞免疫完全由人類HLA分子所限制，完全不具備鼠MHC分子所限制的免疫應答。缺少鼠類MHC和人類(轉基因)HLA免疫應答之間的競爭使得可以用這種小鼠來確定人類疫苗的表位，人類疫苗需要HLA-限制性CD4+T輔助細胞和HLA-限制性CD8+T溶細胞性細胞之間的合作。「HLA」是人類MHC複合物，而「H_2」是小鼠MHC複合物。人類複合物包括三種I類a -鏈基因，HLA-A、HLA-B 和 HLA-C，和三對 MHC II 類 a-和 0 鏈基因HLA_DR、_DP 和-DQ。在許多單倍體中，HLA-DR簇包含一種額外的P鏈基因，其產物可與DRa鏈配對，因此這三組基因可生成四種MHC II類分子。在小鼠中，這三種I類a-鏈基因為H-2-L、H-2-D和H-2-K。小鼠 MHC II 類基因為 H-2-A 和 H-2-E。已知，作為多態性HLA抗原和不同HLA等位基因的結果，不同個體的HLA基因之間存在遺傳差異。相應地，本發明所述的實施方式中的多態性HLA抗原或HLA等位基因可能會從一種換為另一種。HLA多態現象和等位基因的例子可在以下地方找到例如http://www. anthonynolan. org. uk/HIG/data. Html、http://www. ebi. ac. uk/imgt/hla、Geneticdiversity of HLA !Functional and Medical Implication,Dominique Charon(Ed. ),EDKMedical and Scientific International Publisher, and The HLA FactsBook, Steven
G.E. Marsh, Peter Parham and Linda Barber, AP Academic Press,2000。「斷裂的(disrupted) 」基因是一種通過同源重組或其它已知方法進行突變的基因。斷裂的基因可能是基因的下效等位基因或基因的無效等位基因。專業人員將發現將要使用的等位基因的類型，並根據任何特定的環境進行選擇。在本發明的許多實施方式中，優選的是無效等位基因。「同源重組」是一種通用的對預先選中的、需要的細胞基因序列進行靶向突變，以得到轉基因動物的方法(Mansour, S. L. et al.，Nature 336 :348-352(1988) ；Capecchi,M. R. , Trends Genet. 5 :70-76(1989) ；Capecchi, M. R. , Science 244 1288-1292(1989)；Capecchi, M. R. etal. , In Current Communications in Molecular Biology, Capecchi,M.R. (ed.)，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp.45-52 ；Frohman, M. A. etal.，Cell56 :145-147 (1989))。現在，想要改變小鼠的任何基因都是可行的(Capecchi, M. R. , Trends Genet. 5 70-76(1989) ；Frohman, M. A. etal.，Cell 56 :145-147 (1989))。基因打靶涉及到標準 DNA重組技術的使用，以將所需的突變引入到選中的基因座中的克隆DNA序列。隨後，這種突變再通過同源重組傳入多能胚胎源性幹細胞(ES)的基因組中。改變後的幹細胞通過顯微注射進入小鼠胚泡中並成為發育中的小鼠胚胎的一部分，最終形成嵌合體動物。在有的情況下，該嵌合體動物的生殖譜系細胞將從遺傳改變的ES細胞分化而來，於是突變的基因型可、以通過生育來進行傳遞。基因打靶已被用於培育將nptll基因嵌入￠2-微球蛋白基因座的嵌合體和轉基因小鼠(Koller, B. H. etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 86 =8932-8935 (1989)；Zijistra, M. et al. , Nature 342 :435-438(1989) ；Zijfstra, M. et al. , Nature 344 742-746(1989) ；DeChiaba etal. ,Nature 345 :78-80 (1990))。類似的試驗可用於培育包含被嵌入nptll基因破壞的ac-abl基因的嵌合體和轉基因動物(Schwartzberg,P. L. etal.,Science 246 :799-803 (1989))。這種技術被用於培育en_2基因被嵌入的nptll基因打斷的嵌合體小鼠(Joyner, A. L. etal.，Nature 338 :153-155 (1989))。採用「基因打靶」方法，必須對興趣基因預先進行克隆，並確定內含子及外顯子邊界。這種方法的結果是將標誌基因(如nptll基因)嵌入感興趣的特定基因的轉譯區。這、樣，使用基因打靶方法就造成了對感興趣的基因的破壞。使用基因打靶來改變細胞的基因顯著地引起了該基因序列結構的變化。基因打靶的效果取決於一系列的可變因素，並且根據結構不同而不同。本發明中的嵌合體或轉基因動物細胞通過向細胞(可能是前體多能細胞，如ES細胞，或者同等細胞)中引入一種或多種DNA分子製備的(Robertson, E. J. , In CurrentCommunications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp. 39-44)。「前體」只是表明多能細胞是所需要的(轉染的)多能細胞的前體，是按照本發明的指導來培育的。多能(前體或轉換後的)細胞可以按照已知的方法(Evans,M. J. etal. , Nature 292 :154-156(1981))在體內進行培育以形成嵌合體或轉基因動物。任何ES細胞都可以按照本發明的指導使用。但是，優先選擇ES細胞的原代分離株。這種初期分離細胞可直接從胚胎中獲得，如CCE細胞株(Robertson, E. J. , In CurrentCommunications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)，pp. 39-44)，或從 CCE 細胞株中的 ES 細胞克隆分離株中得來(Schwartzberg, P. A. etal.，Science 246 :799-803 (1989),將該文通過引用併入本文)。這種克隆分離株可根據E. J. Robertson的方法(In Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells A Practical Approach, (E.J. Robertson, Ed.), IRL Press,Oxford, 1987)來實現，該參考和方法均在此引用作為參考。這種克隆繁殖的目的是為了獲得能夠高效分化形成動物的ES細胞。同源選擇的ES細胞形成轉基因動物的效率是CCE祖細胞株的約10倍。對於本發明中重組方法的目的，克隆選擇不具有優勢。從胚胎中克隆獲得的ES細胞株的一個例子是ES細胞株，ABl(hprt+)或AB2. I (hprt-)。ES細胞最好是在基質細胞(如STO細胞(尤其是SNC4ST0細胞)和/或原代胚胎成纖維細胞)上進行培育。如E. J. Robertson所描述的那樣(In Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells A Practical Approach, (E.J. Robertson, Ed. , IRL Press,Oxford, 1987, pp 71-112)，在此引用作為參考。嵌合小鼠的培育和分析方法在Bradley，A的文獻中進行了介紹(In Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells A PracticalApproach, (E. J. Robertson, Ed. ), IRL Press, Oxford, 1987, pp 113-151),在此引用作為參考。基質(和/或成纖維)細胞的作用是消滅異常ES細胞的克隆性生長。最好是在存在白細胞抑制因子("Iif")的環境中培育細胞(Gough，N.M. etal.，Reprod. FertiI.Dev. I :281-288(1989) ；Yamamori, Y. et al.，Science 246 :1412-1416 (1989)，在此引用作為參考)。既然基因編碼Iif已被克隆(Gough, N. M. et al. , Reprod. Fertig. Dev. I 281-288 (1989))，特別建議根據已知的方法，用這種基因來轉化基質細胞，然後在轉化後的可分泌Iif入培養基的基質細胞上培育ES細胞。本處使用的「轉基因」指的是部分或完全異源的核酸序列，S卩，與它所引入的轉基因動物或細胞完全異質，或與被引入的轉基因動物或細胞的內源基因同源，但將被或已被嵌入動物基因組以改變被嵌入細胞的基因組的核酸序列(如被嵌入與自然基因不同的部位或其嵌入造成基因缺失)。轉基因可以通過操作與一種或多種轉錄調節序列和任何其它能最佳表達所選核酸而所需的核酸(如內含子)相連。本發明的示範轉基因編碼含有H-2多肽。其它示範轉基因被用於通過與HLA基因的基因組序列同源重組來破壞一種或多種HLA基因。「功能性轉基因」是產生mRNA轉錄物，這種轉錄物又能在包含轉基因的小鼠的至少一個細胞中生成適當處理的蛋白質的基因。專業人員將發現到各種已知轉錄調節元件和指導轉錄後處理的序列提供了很多指導宿主小鼠表達轉基因的選擇。在本發明的許多實施方 式中，在H-2基因調節元件控制下進行HLA轉基因表達可被優先考慮。在一些實施方式中，HLA I類轉基因是HLA-A2轉基因，而HLA II類轉基因是HLA-DRl轉基因。HLA-A2轉基因的一個例子是一種包含序列表中提供的HLA-A2序列的基因。HLA-DRl轉基因的一個例子是一種包含序列表中提供的HLA-DRl序列的基因。在一個實施方式中，本發明提供了一種缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因的轉基因小鼠。在一些實施方式中，小鼠具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在其它實施方式中，HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發明還提供了分離的轉基因小鼠細胞。在有的情況中的細胞包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因和功能性HLA I或II類轉基因。在另一些情況中，細胞包含斷裂的H2 I類基因，斷裂的H2 II類基因、功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因。HLA I類轉基因可以是HLA-A2轉基因，而HLA II類轉基因可以是HLA-DRl轉基因。在一些情況中，HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。在一個實施方式中，本發明提供了一種缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因的分離的轉基因小鼠細胞。這種分離的轉基因小鼠細胞包含HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。HLA-A2轉基因可包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因可包含序列表中提供的HLA-DRl序列。本發明中的分離的轉基因小鼠細胞可具有本發明中的任何小鼠的基因型。但是，本發明中的分離的小鼠細胞的基因型和本發明中小鼠的基因型不需要完全重疊。本發明中的分離的小鼠細胞可以從小鼠或小鼠胚胎中獲得。在一個實施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有與將要獲取的細胞一樣的基因型。在另一個實施方式中，小鼠或小鼠胚胎具有與將要獲得的細胞不同的基因型。當細胞從小鼠或小鼠胚胎中獲得後，細胞的基因可以通過如同源重組的方法破壞。另外，功能性轉基因可通過，如轉染的方法被引入細胞的基因組中。專業人員將發現任何已知的適當的方法都可被用於修改細胞的基因組，並由此獲得具有理想基因型的分離的小鼠細胞。本發明的另一個目標是缺乏H2 I類和II類分子，但包含功能性HLAI類轉基因和功能性HLA II類轉基因的分離的轉基因小鼠細胞。在一些實施方式中，轉基因小鼠細胞具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP °基因型。在其它實施方式中，HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。T細胞在獲得性免疫的很多方 面都具有重要的作用，實現了多種調節和防禦功能。當有的T細胞遇到感染或癌性細胞，它們會將其視為外來物並發揮殺手細胞的作用，作為細胞性免疫應答的一部分，殺死宿主本身的細胞。其它T細胞，如T輔助細胞，將通過刺激B細胞產生抗體或者抑制體液或細胞免疫應答的某些方面，而對外來抗原作出應答。T輔助細胞(Th)通過產生細胞因子協調多數免疫應答。儘管通常可根據攜帶⑶4細胞表面標記物識別，這些細胞根據它們生成的細胞因子和它們對於免疫系統的其它細胞的影響，從功能上被分為Thl或Th2亞群。Thl細胞通過被稱為T細胞抗原受體的識別系統檢測入侵的病原體或癌性宿主細胞。被稱為細胞免疫的Thl-相關免疫過程通常涉及非-B細胞的激活作用，並常常以生成IFN-Y作為特徵。但是，儘管Thl系統基本上獨立於體液性抗體的生成，Thl細胞因子確實促進了向lgG2a同種型的免疫球蛋白轉換。檢測到外來抗原後，大多數成熟的Thl細胞將指導釋放出IL-2、IL-3、IFN-Y、TNF-^、GM-CSF、高水平的TNF-a ,MIP-I a、MIP_1 ^和RANTES。這些細胞因子將促進遲髮型超敏反應和普通細胞介導免疫。例如IL_2是一種細胞生長因子，它可促進對初期檢測出來的特定的抗原敏感的T細胞克隆的生成。致敏T細胞附在細胞上並攻擊帶有這種抗原的細胞或病菌。相反，成熟的Th2 細胞可促進 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF和低水平TNF- a的分泌。另外，Th2應答通過激活B細胞、刺激抗體的生成和分泌、以及引導向IgA、IgG1和IgE同種型的類型轉換來促進體液免疫。此處使用的「抗原」包含1)至少一種HTL抗原表位、或2)至少一種CTL抗原表位、或3)至少一種B細胞抗原表位、或4)至少一種HTL抗原表位和至少一種CTL抗原表位、或5)至少一種HTL抗原表位和至少一種B細胞抗原表位、或6)至少一種CTL抗原表位和至少一種B細胞抗原表位、或7)至少一種HTL抗原表位和至少一種CTL抗原表位和至少一種B細胞抗原表位。「候選抗原」是一種處於調查階段，確定其是否能作為抗原的分子。「體液免疫應答」是一種抗體-介導的特異性免疫。「抗原表位」是被免疫系統識別出來的抗原上的一個位點。抗體抗原表位是被抗體識別出來的抗原上的一個位點。T-細胞抗原表位是抗原上與MHC分子相連的一個位點。TH抗原表位是與MHC II類分子相連的位點。CTL抗原表位是與MHC I類分子相連的位點。抗原可以包含多肽序列或多核苷酸序列(可含有RNA、DNA、或RNA和DNA)。在一個實施方式中，抗原至少包含一種編碼包含一種或多種抗原多肽的多核苷酸序列。在本文中，「包含」指的是宿主細胞的轉錄和/翻譯工具通過與編碼至少一種抗原多肽的外源多核苷酸提供了至少一種抗原多肽。如以下專利中所描述U. S.專利No. 6，194，389and 6，214,808。本發明中的抗原可以是任何抗原分子。抗原分子包括蛋白質、脂蛋白、糖蛋白(包括病毒的、細菌的、寄生的、動物)和真菌蛋白(如白蛋白、破傷風毒素、破傷風毒素、百日咳菌、細菌外膜蛋白(包括腦膜炎球菌外膜蛋白)、RSV-F蛋白、瘧疾衍生肽、B-乳球蛋白
B、抑酞酶、卵白蛋白、溶菌酶和腫瘤相關抗原(如癌胚抗原(CEA)、CA 15-3、CA125、CA19-9、前列腺特異性抗原(PSA)和TAA複合物(U.S.專利No. 5，478，556，在此全文引用作為參考)；碳水化合物(包括天然的和合成多糖以及其它聚合物，如聚蔗糖、葡聚糖、羧甲基纖維素、瓊脂糖、聚丙烯醯胺和其它丙烯酸樹脂、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙烯醇、局部水解聚醋酸乙烯酯、polyvinyl pryrolidine、B類葡萄球菌和肺炎球菌莢膜多糖(包括III型)、銅綠假單胞菌胞外粘液多糖和莢膜多糖(包括fisher type I)和流感(嗜血)桿菌多糖(包括PRP);半抗原和其它包含低分子重量分子，如TNP、糖、低聚糖、多糖、肽、毒素、藥物、化學藥品和變應原；以及從細菌、立克次(氏)體、真菌、病毒、寄生蟲中衍生出來的半抗原和抗原，包括白喉、百日咳、破傷風、乙型流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、克雷白(氏)桿菌屬、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腦膜炎雙球菌、脊髓灰質炎、腮腺炎、麻疹、風疹、呼吸道合胞病毒、狂犬病、伊波拉出血症、炭疽、李斯特菌屬、甲/乙/C型肝炎、I類/II類人免疫缺陷症病毒、1/2型單純性皰疹、巨細胞病毒、EB病毒(非洲淋巴細胞瘤病毒)、 水痘帶狀皰疹、瘧疾、結核、白色念珠菌和其它念珠菌屬、卡氏肺孢子蟲，支原菌、A/B流行感冒病毒，腺病毒、A組鏈球菌屬、B組鏈球菌屬、假單胞菌aeryinosa、鼻病毒屬、利什曼原蟲屬、1/2/3型副流感、冠形病毒、門(氏)菌、志賀(氏)桿菌、輪狀病毒、弓形體屬、腸道病毒，和沙眼衣原體和肺炎衣原體。此處的藥物合劑或疫苗包含至少一種免疫組分，這種組分能溶解、懸浮或與藥學上可接受的載體相結合。任何藥學上可採用的載體都能被用於給藥。合適的藥物載體在下文中進行了描述Remington, s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (A. Gennaro,ed. , 1990)Mack Pub. , Easton, Pa.,在此將其全文通過引用併入本文。載體可以是無菌液體，如水、聚乙二醇、二甲基亞碸(DMSO)J (包括石油、動物油、植物油、花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。載體可以以霧狀、噴霧劑、粉狀、蠟狀、膏狀、栓劑、埋植劑、對氧水楊酸鈉、軟膏、片狀、敷劑、膜狀或化妝品製劑的形態存在。藥物合劑或疫苗的適當組成取決於所選擇的給藥途徑。例如當通過單次快速靜脈注射或連續輸注進行靜脈給藥時，藥物最好是水溶性的，並且最好選擇鹽水作為載體。對於經皮、鼻內、口腔、胃、陰道內、直腸內或其它通過黏膜給藥，可選擇適當的能透過屏障的滲透劑作為藥物成分。對於口服給藥，活性成分可與適於加入片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿劑、混懸液的載體結合使用。時間敏感的給藥系統也可用於本發明的合劑給藥。代表系統包括聚合物基材系統，如聚(丙交酯糖苷)、copolyoxalates、聚已酸內酯、聚酯醯胺、多正酯類、聚-3-羥基丁酸和聚酐。這些及類似聚合物可根據已知的方法(如U. S.專利No. 5，075，109中的方法，在此全文引用作為參考)製成微包囊。適於本發明中的免疫刺激複合物的多選擇給藥系統包括在以下專利中提到的方法U. S.專利 No. 6，194，389，6，024，983 5，817，637，6，228，621，5，804，212，5，709，879，5，703，055，5，643，605，5，643，574，5，580，563，5，239，660，5，204，253，4，748，043，4，667，014，4，452，775，3，854，480，和3，832，252 (在此均全文應用作為參考)。葡萄糖水溶液和甘油溶液也可被作為液體載體使用，尤其是用於注射液和氣溶膠溶液。對於通過氣溶膠(使用自動噴霧罐或噴霧器)給藥，專業人員可酌情加入適當的噴射劑。免疫複合物中還可以加入增溶劑、乳化劑、穩定劑；分散劑、調味劑；佐劑；載體；局麻劑(如賽魯卡因、利多卡因等)；抗生素或其它已知或可疑的抗病毒、抗真菌、抗寄生物或抗腫瘤複合物進行配置。「佐劑」是一種可促進或增強對目標抗原的免疫應答的複合物。專業人員能選擇適當的佐劑進行本發明中的實踐。本發明包括通過施用本發明中的一種或多種抗原，對需要免疫刺激的病人進行治療的方法。本處的治療包括與任何疾病、狀況、異常或症狀相關的矯正、滋補、改善和預防方法。治療還進一步包括在試驗動物或體外引起或抑制免疫應答。因此，治療包括通過任何普通專業人員所熟知的方法(通常包括口服或鼻內途徑、以及靜脈、肌肉和皮下注射，但也包括腹膜內、體內、關節間、心室內、鞘內、表面、扁桃體、黏膜、經皮、陰道內及管飼法途徑)給予免疫刺激量的本發明中的任何免疫刺激複合物。熟練的專業人員都知道，選擇適當的給藥方法對治療的效果有幫助，對一些應用應優先選擇局部給藥。可採用的局部給藥途徑包括皮下、皮內、腹膜內、玻璃體內、吸入或灌洗、口服、鼻內給藥以及向預先確定的組織、器官、關節、腫塊或細胞群的定向注射。例如，黏膜應用或向黏膜淋巴節或派伊爾(氏)淋巴集結中注射可以促進體液免疫應答，引起實質性的IgA類轉換。或者，向傷口、病灶或身體感染部位進行靶注射可以用於治療實體瘤、局限性感染或其它需要免疫刺激的部位。或者，免疫系統細胞(如T細胞、B細胞、NK細胞或少突膠質細胞)可以從宿主中取出，並在體外進行處理。處理過的細胞可進一步進行培養或重新輸入病人體內(或輸入異源宿主中)以提供對病人或宿主的免疫刺激。例如，骨髓細胞可以被從病人身上抽出，並使用HDR進行處理以刺激全身或特異性免疫。高劑量輻射或類似處理可被用於毀壞病人體內剩餘的免疫細胞。在重新植入後，自體刺激細胞在病人體內將恢復正常的免疫功能。或者，從癌症病人體內分離NK和/或T細胞可在體外暴露於一種或多種病人癌症的特異性抗原中。在被重新植入病人體內後，抗原刺激細胞將對癌症細胞產生強大的分子免疫應答。免疫刺激(有效)量指的是能在病人體內引起免疫應答，足以阻止、改善或治療致病攻擊、過敏症、或免疫異常的疫苗的量。免疫刺激量指的是，與將抗原施用於未預先使用疫苗治療病人所獲得的應答相比，能提供可測定的對抗原的至少一種抗原表位的體液或分子免疫應答提高的量。因此，舉例來說，免疫刺激量指的是能促進針對感興趣的抗原表位的抗體的生成，或能激發可測定的對致病或致敏刺激的保護作用，或能促進針對感興趣的抗原表位的CTL應答的含抗原藥物的量。使用本發明中的免疫刺激量的含抗原藥物進行治療包括引起宿主(尤其是包含至少一種免疫系統細胞或細胞株衍生物的體外組織培養宿主細胞)內免疫應答的任何直接、間接或統計學上可見或可測量的增長或其它想要的變化。宿主細胞可以從人類或動物外周血、淋巴結或類似物中衍生出來。優先選擇的組織培養宿主細胞包括新提取的T細胞、B細胞、巨噬細胞、少突膠質細胞、NK細胞和單核細胞。每種都可以使用標準技術分離或提純出來。可見的或可測的應答包括B或T細胞增殖或激活；抗體分泌增加；同型體轉換；細胞因子釋放增多，尤其是一種或多種IL-I，IL-2，IL-3，IL-4，IL_5，IL_6，IL_9，IL-10，IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN- y，TNF- a，TNF- ^，GM-CSF, MIP-I a，MIP-I ^，或 RANTES 釋放增多；對特異性抗原的抗體滴度或親和力增加；與致病感染相關的發病或死亡率降低；促進、引起、維持或延長病毒潛伏期；抑制或改善惡性和良性腫瘤的生長、轉移或作用；以及提供對疾病或疾病效應的預防性保護。當需要抑制免疫應答時，如，在自身免疫性疾病或過敏症的治療中，有效劑量還包括足以引起可測量或可觀察的與待治療的病況或病理有關的應答降低。含抗原藥物的劑量及給藥頻率可以按經驗來確定，並考慮到所治療病人的年齡和身材，以及病情或所治療的疾病。適當的劑量在0.01微克至100微克/次接種範圍內，但也可略高於或低於這個量。第二次加強免疫可在間隔一周至數月後進行。以下實施例對本發明中的某些實施方式進行了說明。普通的專業人員將識別出在不改變本發明本質和範圍的前提下進行的各種修改和變動。這些修改和變動被認為屬於本發明的範圍以內。這些實施例不對本發明造成限制。實施例以下實驗技術和試劑被用於說明本發明中的某些非限制性實施方式。轉基因小鼠HLA-DRl-轉基因 H-2II 類-KO(IAP b° )小鼠由 HLA-DR1-轉基因小鼠(Altmann，
D.M. et al.，J Exp Med 181,867-875(1995))和 H-2II 類-KO(IA3 b。)小鼠(Rohrlich,P. S. etal. , Int TmmunoI 15, 765-772 (2003))在 Institute Pasteur of Lille 雜交得來。培育表達嵌合體單鏈(HHD分子HLA_A2. I的a I-a 2結構域、H_2Db的胞漿區的a 3，依靠15個胺基酸的肽接頭以其N末端與人0 2m C末端相連)的HLA-A21-轉基因小鼠。將HLA-A2. I (HHD)-轉基因 H-2 I 類-KO 和 HLA-DR1-轉基因 H2 II 類-KO(IA ^ b° )小鼠進行雜交篩選直到得到 HLA-A2. rA/HLA-DRl+l轉基因 H-2-I 類(P 2m°) -/II 類(IA ^ °) -KO 小鼠，用於此處所述的試驗。使用HLA-A2. 1+/_單轉基因H-2-I(02m°)-/II(IAP°)-KO小鼠作為保護性測定中的對照組。在Institut Pasteur巴黎的動物實驗室中培育小鼠；所有實驗設計經過Institut Pasteur權威機構評估,符合法國和歐洲關於動物福利的法規和公共衛生服務建議。基因分型使用PCR 檢測 HLA-DRB 1*0101、HLA-DRA*0101 和 HLA_A*0201 轉基因。在 56 °C，IOOmMNaCl、50mM Tris-HCI pH7. 2, IOOmM EDTA，I % SDS 和 0. 5mg/ml 蛋白酶 K 孵育過夜，再加入250微升飽和NaCl溶液和異丙醇沉澱提取尾DNA。將樣品在70%的酒精中洗三次，並在 150 微升 IOmM Tris-HCI, ImM EDTA pH8 中重懸起來。PCR 條件為I. 5mMMgCl2、I. 25U 的Taq聚合酶、生產商(InVitrogen, Carisbad, CA)提供的緩衝液、I個循環(7min, 94°C ), 40個循環(30sec，94°C;30sec，60°C;lmin，72°C )，1 個循環(4min，72°C )，使用正向引物和反向引物，對 HHD :5，CATTGA GAC AGA GCG GTT GGC CAC GAA GCA G 3，和 5，GGA TGACGT GAGTAA ACC TGA ATC TTT GGA GTA CGC 3』和對HLA_DRB1*0101 :5』TTC TTC AAC GGG ACG GAGCGG GTG 3』 和 5』 CTG CAC TGT GAA GCT ACC AAC 3』，和對 HLA_DRA*0101 :5』 CTCCAA GCCCTC TCC CAG AG 3，和 5，ATG TGC CTT ACA GAG GCC CC3，。FACS 分析使用、FITC-結合 W6/32(anti-HLA-ABC，Sigma, St Louis, MO)和生物素化抗-28-8-6S(anti-H-2Kb/Db，BD Biosciences, San Diego, CA)m. Ab 在去除了紅細胞的、淋巴細胞M-提純(Tebu-bio, Le Perray en Yvelines, France)的脾細胞上進行流式細胞分析研究。使用 PE-標記的 CT-CD4 抗-小鼠 CD4(CALTAG，South San Francisco, CA)和FITC-標記的 53-6. 7 抗-小鼠 CD8m. Ab (BD Biosciences)對 CD4+ 和 CD8+T 淋巴細胞進行染色。MHCII類分子表達的分析通過質譜柱陽性選擇B220+B淋巴細胞實現(MiltenylBiotec, Bergisch Gladbach, Germany)。用 2. 4G2 m. Ab 與 Fe 受體飽和結合，HLA-DRl 和H-2 IAb的表達可以用FITC標記的L243 (抗HLA-DR)和PE標記的AF6-120. I (抗H-IA ^ b)(BD Bioscciences)進行分析。使用 FACS Calibur (Becton Dickinson,Bedford,MA)對多聚甲醛固定細胞進行分析。免疫掃描分析在自動-Macs (Miltenyi Biotec)上陽性選擇來自未經免疫處理的小鼠的⑶4+和Q)8+T細胞,使用RNA簡易工具包(Qiagen, Hilden, Germany)處理RNA,並用於cDNA合成。使用BV片段家族特異性正向引物和兩個BC片段共享的反向引物對cDNA進行PCR-擴增。PCR產物為從屬於內在的BC FAM-標記引物的延續產物。延續產物加入6%丙烯醯胺/8M尿素凝膠中電泳(7h,35w)分離，使用 373A DNA測序儀(PerkinElmer Applied Biosystem,Foster City, CA)檢測。使用免疫掃描軟體(Pannetier, C. etal. , ProcNatlAcad Sci U S A 90,4319-4323(1993))進行數據分析。肽HLA-A2 結合肽 HBsAg348_357GLSPTVWLSV 和 HBsAg335_343WLSLLVPFV，H_2Kb 結合肽 HBsAg371_378ILSPFLPL，HLA-DRl 結合肽 HBsAg18(l_195QAGFFLLTRILTIPQS，H-2 IAb 結合肽HBsAg126^138REGLYFPAGGSSSG 以及 preS2 肽 HBsAg1(l9_134MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG 是通過Neo系統(Strasbourg, France)合成的，並溶解於濃度為lmg/ml的PBS-10% DMSO中。妝的胺基酸序列編號從HBV ayw亞型preSl域的第一個甲硫氨酸開始。使用編碼HBV的S2-S蛋白的DNA進行免疫在人類CMV早期快反應基因控制下表達preS2和S HBV表面抗原的pCMV_S2. S質粒載體(Michel, M. L. etal. , ProcNatlAcad Sci U S A 92,5307-5311 (1995))編碼通過質粒Giga Kit柱在沒有內毒素的條件下提純。如前所述，對小鼠的再生脛骨前肌進行注射普魯卡因麻醉(50 微克每側)(Davis, H. L.，Michel, M. L. &ffhalen, R. G.，Hum Mol Genet 2，1847-1851(1993))。T細胞增殖測定最後免疫的12天後，在加入10% FCSUOmM HEPES，ImM丙酮酸鈉、5x1 (T5M 2-巰基乙醇、100I.U/ml青黴素和100微克鏈黴素的RPMI培養基中同時培養去除了紅血細胞的、聚鹿糖提純脾細胞(5. 106細胞/25cm2培養瓶(Techno Plastic Products (TPP),Trasadingen, Switzerland))和肽-脈衝(20,微克/ml)、福射(180Gy) LPS-胚細胞(5. IO6細胞/培養瓶)。第七天，用於增殖分析細胞分於平底96孔板中，每孔5xl05細胞，含3% FCS不完全RPMI培養基中肽衝擊、放射線照射並用內毒素(每孔2xl05細胞)處理細胞72小時。每孔細胞用ICi 3H標記的胸腺嘧啶處理16小時，然後用帶濾膜的TOMTEC收集器(Perkin Elmer Applied Biosystem)收集細胞，用micro-0 計數器(Perkin ElmerApplied Biosystem)檢測參入的放射性。結果以刺激指數(SI)形式給出，SI =特異性肽的cpm/不相關肽的cpm。CTL活動測量
對進行增殖測定的同一免疫脾細胞群進行細胞毒性測定。使用與增殖測定相同的補充RPMI培養基同時培養應答細胞(5. 106細胞/25cm2培養瓶，TPP)和刺激性肽-脈衝(20，微克/ml) y -輻射(180Gy) LPS-胚細胞(5. 106細胞/培養瓶)7天。在針對10微克/ml試驗或對照肽脈衝的RMA-S HHD靶細胞的標準4h51Cr測定中檢測溶細胞活動。特異性溶解，以％為單位，被重複計算，依據[試驗性-自發釋放]/[最高自發性釋放]xlOO，減去使用對照肽觀察到的非特異性溶解。體內抗體產生測量在DNA注射前後的不同時間，使用加肝素的玻璃吸管對小數進行眼球後穿刺，採集血樣，並通過特異性ELISA對離心法恢復的血清進行抗HBs和抗-preS2測定。使用帶HBV小S蛋白(I微克/ml)或preS2 (120-145)合成肽(I微克/ml)的提純重組體顆粒作為固相。在使用追加了 10% FCS的PBST(含有0. 1% Tween 20的PBS)進行阻斷後，加入系列稀釋劑。在廣泛衝洗後，使用辣根過氧化物酶(Amersham,LittleChalfont,UK)標記的抗小鼠Ig(總IgG)對聯結抗體進行檢測。使用系列終點稀釋法確定抗體滴度。單獨檢測小 鼠血清，滴度是進行至少三次測定的平均值。血清稀釋在1/100以下被視為陰性。抗體滴度使用ELISA (Michel, M. L. etal) ，Proc Natl Acad Sci U S A92,5307-5311 (1995))在提純的HBV中、小蛋白或preS2合成HBs1(l9_134肽上對免疫小鼠血清分別進行了測定。在使用含有0. I % Tween 20，10% FCS的PBS進行封閉並衝洗三次後，使用辣根過氧化物酶-標記的抗-小鼠IgG (Amersham, Little Chalfont, UK)對連接抗體進行檢測。抗體滴度(至少三次測定的平均值)由系列終點稀釋法確定。滴度在1/100以下被視為陰性。痘苗攻擊及噬菌斑測定在最後一次注射12 天后，以 IO7PFU 表達 HBsAg(Smith, G. L. , Mackett, M. &Moss,
B., Nature 302,490-495 (1983))或 HBx 蛋白(Schek, N. , Bartenschlager, R. , Kuhn,
C.&Schaller,H. ,Oncogene 6,1735-1744. (1991))(分別由 Dr B. Moss和Dr H. SchalIer提供)的重組體痘苗病毒(Western Reserve strain)對DNA-注射小鼠進行腹膜內攻擊。四天後，採用BHK 21細胞的噬菌斑測定分析卵巢的rVV滴度(Buller，R. M. &ffallace, G. D.，Lab Anim Sci 35,473-476(1985)。實施例I :細胞表面MHC分子表達通過流式細胞術評估在脾細胞表面的HLA-A2. I、H_2Kb/Db、HLA-DRl和H_2 IAb分子的表達。如圖Ia所示，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因，H-2 I類/11類-KO小鼠和HLA-A2. I-轉基因，H-2 I類-KO小鼠身上觀察到相近水平的HLA-A2. I表達，但未觀察到HLA-A2. Ib表達，而且只在HLA-DRl-轉基因、H_2 II類-KO小鼠身上觀察到了 H_2Kb/Db表達。在B220+-濃縮B細胞上對細胞表面的HLA-DRl和H_2 IAb表達進行測量。如圖Ib所示，在 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I 類-/II 類-KO 小鼠和 HLA-DR1-轉基因、H_2 II類-KO小鼠身上觀察到相近水平的HLA-DRl表達，但在HLA-A2. I-轉基因、H-2 I類-KO類小鼠身上未觀察到該表達。但是，細胞表面的轉基因分子(尤其是HLA-DR1)表達低於內源性H-2 I類和II類分子表達。實施例2 :⑶4+和⑶8外周淋巴細胞
如圖2a所示，通過免疫染色和流式細胞術分析對⑶4+和⑶8+外周脾淋巴細胞的
數量進行確定。HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I 類-/II 類-KO 小鼠和 HLA-DR1-轉基因、H-2II類-KO小鼠身上的⑶4+T淋巴細胞佔了脾細胞總數的13-14%。相反，H-2 II類-KO小鼠身上的⑶4+細胞只佔脾細胞總數的2-3% (數據未顯示)，符合關於缺乏MHC II類分子小鼠的初期報告(Cosgrove, D. etal. , Cell 66,1051-1066(1991))。與預想的一樣，轉基因HLA-A2. I分子表達導致了⑶8+外周淋巴細胞數量的增加，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I類-/II類-KO小鼠和HLA-A2. I-轉基因、H-2 I類-KO類小鼠中均達到了脾細胞總數的2-3%，而在P 2微球蛋白2m)-KO MHC I類-缺失的小鼠身上只佔了 0. 6_1 %(Pascolo, S.etal. ,J ExpMed 185,2043-2051(1997))。實施例I和2中的結果表明(1)HLA-A2+HLA-DR1+P 2m。IAP。小鼠的 HLA-A2 分子表達、H2_Kb 分子缺失、CD8+外周淋巴細胞數量以及⑶8+T組成成分的多樣性，通常與HLA-A2+P 2m°小鼠相當；(2)在 HLA-A2+HLA-DRl+@ 2m° IAP ° 小鼠中，HLA-DR1 分子表達、H2_IAb 缺失、⑶4+T淋巴細胞的數量以及⑶4+組成成分的多樣性，通常與HLA-DR1+IAP °小鼠相當；(3) HLA-A2+HLA-DR1+3 2m。IAP 。小鼠具有 HLA_A2+P2m。小鼠和HLA-DR1+IAP。小鼠身上的所有優點。實施例3 T淋巴細胞受體(TCR)BV片段使用由於單MHC I類分子和單MHC II類分子的存在會減少TCR組成成分的數量和多樣性，按先前所述(Cochet, M. et al.，EurJ Immunol 22，2639-2647 (1992))，通過 RT-PCR免疫掃描技術在提純CD4+或CD8+脾淋巴細胞上對各BV家族和CDR3長度多樣性的表達進行研究。在CD8+(圖2b)和CD4+(圖2c)淋巴細胞中，大多數BV家族(15/20)都表現出了高斯分布的顯著強度高峰。在外周T淋巴細胞觀察到的這種分布圖形，每一個波峰都是BV片段與3個核苷酸長度變化的⑶R3亞區的功能性重排的典型表現(Cochet，M. etal.，EurJ Immunol 22,2639-2647(1992))。觀察到缺乏BV 5. 3和17分布(或者說其完全改變的分布趨勢)是意料中的，因為這兩個 BV 片段在 C57BL/6 小鼠中是假基因(Wade, T.，Bill, J.，Marrack, P. C.，Palmer,
E.&Kappler,J. ff. ,J Immunol 141,2165-2167(1988)) ；Chou,H. S. et al. ,Proc Natl AcadSci U S A 84,1992-1996 (1987) o而BV 5. 1、5. 2和11片段的改變的圖形是由於對應的BV-表達T淋巴細胞亞群小而引起的(它們在C57BL/6小鼠中小於5%，在HLA-DRl-轉基因H-2 II類-KO小鼠中佔約2% )(數據未顯示)。除了這些情況，HLA-A2. 1/HLA-DR1-轉基因，H-2 I類/11類-KO小鼠的⑶4+和⑶8+淋巴細胞均分別顯示出TCR BV鏈使用和⑶R3多樣性，這與非-轉基因C57BL/6小鼠的情況類似。實施例4 :功能表徵對Ag HBs (B肝病毒包膜蛋白)免疫的HLA-A2+HLA-DR1+P 2m° IAP °小鼠進行分析。圖5顯示了特異性體液應答，即如HBs S2抗體的生成所示。圖6顯示了 HBS348_357的特異性DRl-限制性CD4+T增殖應答。圖7顯示了 HBS348_357或HBS335_343的特異性HLA-A2-限制性CD8+細胞溶解T細胞應答。這些結果表明HLA-A2+HLA-DR1+P2m° IAP。小鼠可用於對免疫個體中的特異性體液應答、⑶4+T輔助細胞的Ag-特異性HLA-DRl-限制性應答以及Ag-特異性HLA-A2-限制性CD8+T細胞的細胞溶解應答進行同時分析。表1-3中提供了從小鼠身上獲得的其它信息。表I.注射了 pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII-轉基因小鼠中的對HBV病毒包膜HLA-DRl抗原表位的T⑶4+增殖應答
位置胺基酸序列應答者/試驗小鼠刺激指數
109-134 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG (12/12)3-4
200-214 TSLNFLGGTTVCLGQ(6/12)3-4
16/31 QAGFFLLTRILTIPQS(12/12)3-6
337/357 SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV(5/12)4-5表2.注射了 pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2 CI-CII-轉基因小鼠中的細胞溶解應答位置胺基酸序列應答者/試驗小鼠最大溶解348-357 GLSPTVffLS (12/12)20-70%335-343 WLSLLVPVF (4/12)30%表3.注射pcmv S2-S的HLA-A2+DR1+H-2CI-CII轉基因小鼠中的抗_PreS2抗體應答位置胺基酸序列應答者/試驗小鼠preS2 MQWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGG(9/12)實施例5 :對HBsAg-DNA-疫苗的免疫應答為評估HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I類/11類-KO小鼠的免疫能力，以及為將它們的體液、⑶4+和⑶8+T淋巴細胞應答與人類的這些應答相比較，使用HBsAg-DNA質體對小鼠進行免疫。這些質粒編碼兩種B肝病毒包膜蛋白(preS2/S中蛋白和S/小蛋白)，所述蛋白在帶有B肝病毒表面抗原的顆粒內自組裝。目前使用的B肝病毒疫苗包含這兩種蛋白。如圖3a中的代表性小鼠所示，HBsAg-特異性抗體在注射HBsAg-DNA-疫苗(圖3a，上)後第12天被首次測出，而這些抗體的滴度一直增加到第24天(第二次DNA免疫後的12天後，數據未顯示)。這種早期的抗體應答對中HBV包膜蛋白所攜帶的preS2-B細胞抗原表位(HBsl09 134)和HBsAg顆粒具有特異性，與HBsAg-DNA-免疫小鼠(Michel，M. L. etal. ,ProcNatl Acad Sci U S A 92,5307-5311 (1995))和 HBsAg 免疫人類的類似應答(Mou Iia-Pe I at, J. P. etal. , Vaccine 12,499-502(1994))相符。檢查對HBsAg 的 CD8+CTL 應答，確定 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I 類-/II類-KO類小鼠的CD8+外周淋巴細胞是否從功能上受到了轉基因人類I類分子的限制。在HBV-感染HLA-A2. 1+人群中，免疫顯性HLA-A2. I-限制性HBsAg-特異性CTL應答指向 HBsAg348_357 (Maini, M. K. etal. , Gastroenterology 117,1386-1396 (1999))和HBsAg335-343 (Nayersina,R. etal. ,J Immunol 150,4659-4671 (1993))月太(S卩，觀察到了多抗原表位應答)。在C57BL/6小鼠中，H-2Kb-限制性HBsAg-特異性CTL應答指向HBsAg371_378
肽(Schirmbeck, R.，Wild, J. &Reimann, J.，Eur J Immunol 28,4149-4161(1998))。為評估人化小鼠是否可作出與人一樣的應答，按照此處所描述的那樣，使用相關的(HBsAg348_357，HLA-A2. I-限制性)、或對照的(HBsAg37卜378，H_2Kb_ 限制性；MAGE_3271_279，HLA-A2. I-限制性)肽對脾淋巴細胞進行7天的再刺激。圖3a(中)表明HBsAg-DNA-免疫引起了強HBsAg348^357-特異 CTL 應答，但未引起對 HBsAg371_378 或 MAGE_3271_279 肽的應答。為確定HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I類-/II類-KO小鼠中的外周CD4+T淋巴細胞是否會從功能上受到轉基因人類II分子的限制，對針對HBsAg蛋白的CD4+T淋巴細胞應答進行檢查。在HBs Ag-接種或HBV-感染HLA-DRl+人群中，免疫顯性HLA-DRl-限制性 HBsAg-特異性 Q)4+T 淋巴細胞應答指向 HBsAg18(l_195 肽(Mm, ff. P. etal. , HumImmunol46，93-99 (1996))。在C57BL/6小鼠中，H_2IAb-限制性HBsAg-特異性CD4+T淋巴細胞應答指向 HBsAg126_138 肽(Milich, D. R.，Semin LiverDis 11,93-112(1991))。為將人化小鼠和人以及野生小鼠進行比較，使用相關(HBsAg18CI_195，HLA-DRl-限制性)或對照(HBsAg126.，H-21Ab-限制性；HIV IGag263^278, HLA-DRl-限制性)肽對脾T淋巴細胞進行體外再激活。圖3a (下)顯示了針對HLA-DRl-限制性HBsAg18(l_195肽的強增殖應答，而如預期那樣，、H-2IAP-限制性肽未能有效的激發應答。同樣，HIV I Gag263_278肽未能激發應答。另外，體外使用HBsAg18(l_195多肽增加一次免疫復活可使特異性增殖指數增加數倍(數據未顯示)。在第一種HBsAg-DNA-免疫 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因 H-2 I 類-/II 類-KO 小鼠中已記錄到HBsAg-特異性抗體、增殖應答及細胞溶解T細胞應答的發展和特異性，6隻額外的HBsAg-DNA-免疫和6隻未免疫對照組HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因H-2 I類-/II類-KO小鼠也被分別作了針對以上三種應答的檢測。如圖3b所示，這三種應答同時出現在6隻受試免疫動物身上，但未出現在對照組未免疫小鼠中。有趣的是，2隻免疫小鼠能引起針對 HBsAg348^357 和 HBsAg335_343HLA-A2. I 限制性肽的 CTL 應答(圖 3b，中)。實施例6:保護測定以上實施例記錄了在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-轉基因、H-2 I類/11類-KO小鼠體內誘導的HBsAg-特異性體液、CD4+和CD8+T細胞應答，並表明它們是指向與自然感染或HBsAg-接種的人體的相同的免疫顯性表位。本實施例測試了這些免疫應答能否給接種動物帶來保護。因為小鼠並不感染HBV，這些試驗採用了 HBsAg-重組體痘苗病毒(rVV-HBsAg)。兩次通過肌肉注射100微克HBsAgDNA對小鼠進行免疫。免疫12天後，使用IO7PFU的rVV-HBsAg對小鼠進行腹膜內攻擊。四天後，根據公布的方法確定病毒滴度並記錄為「rVVPFU/卵巢」的形式(Buller, R. M. &ffallace, G. D. , Lab AnimSci 35,473-476 (1985)) 圖4顯示了試驗結果。未經過HBsAg-DNA免疫的動物在攻擊後顯示出了 rVV_HBsAg複製。相反，HBsAg-DNA免疫小鼠的病毒滴度則要低超過4個數量級。這些結果強烈表明使用HBsAg-DNA進行免疫誘導了控制rVV-HBsAg感染的保護性HBsAg-特異性免疫應答。HBsAg-DNA免疫小鼠接受另一種HBx-重組痘苗病毒(rVV，編碼B型肝炎病毒x蛋白)的攻擊的研究證實了 HBsAg-DNA免疫引起的特異性保護。與未免疫的對照組相比，HBsAg-DNA-免疫小鼠中未觀察到rVV-HBx複製減少。實施例7 =HLA-DRl-限制性⑶4+T淋巴細胞對於抗體和CTL應答以及抵抗病毒感染的保護很關鍵為評估HLA-DRl-限制性T輔助淋巴細胞是否有助於人化小鼠中的抗體和CTL應答，對單(HLA-A2. I)和雙(HLA-A2. 1/HLA-DR1)轉基因H-2I類/11類-KO小鼠中的免疫應答和病毒感染的效力進行比較。如表4所示，在HLA-A2. 1-/HLA-DR1-雙轉基因、H-2 I類-/II類-KO小鼠中觀察到了有力的HBsAg348357-特異性CTL應答，但在HLA-A2. I單轉基因H-2 I類/11類-KO小鼠身上未發現。另外，在HBsAg-DNA-接種HLA-A2. I-單轉基因H-2 I類-/II類-KO小鼠身上檢測不到抗-HBs抗體。作為結果，HBsAg-DNA-免疫HLA-A2. I-單轉基因H-2I類-/II類-KO小鼠未能得到抗rVV-HBsAg感染保護。表4HBsAg-DNA免疫小鼠的抗體、細胞溶解、增殖應答和抗rVV-HBsAg-攻擊保護
.^ 特異性溶解(％) 增殖(SI) 抗體滴度 rVV-HBsAg
小鼠
348-357 335-343 179-194PFU/卵巢(IoglO) Al00I02.5.IO8
200I02.5.IO8
300I0IO8
400I02.5.IO8
500I0IO8
600I01.5.IO8
BI30154.72000IO4
21403.930003.IO3
33011475004.103
4502.565007.5.IO3
550306.3130007.5.IO2
640184160005.IO2
7672.915002.104
855325001.5.IO4
924364.53000< IO2
1023145150005.IO3
Cl00I0IO8
200I02.108
300I01.5.IO8
400I0IO8
500I02.5.IO8
600I0IO8使用IO7PFU 的 rVV-HBsAg 對未免疫的 HLA-A2. 1-/HLA-DR1-雙轉基因 H-2 I 類-/II 類-KO 小鼠(Al-6)、HBsAg-DNA-免疫的 IHLA-A2. 1-/HLA-DR1-雙轉基因 H-2 I 類-/II類-KO小鼠(B1-10)和HBsAg-DNA-免疫的HLA-A2. I-單轉基因H-2 I類-/II類-KO小鼠(C 1-6)進行腹膜內攻擊。四天後，使用HBsAg348_357 (免疫顯性表位)或HBsAg335_343 (亞顯性表位)對每個卵巢的噬菌斑形成單位數(PFU/卵巢)、細胞溶解、增殖脾T細胞應答和血清抗體滴度分別進行評估，加載了 HLA-A2. I-限制性肽的RMAS-HHD靶細胞(E/T比為30/1)用於細胞溶解測定，HBsAg179^194HLA-DRl-限制性肽用於增殖測定,preS2109_134肽用於確定抗體(IgG)滴度。
本申請中所引用的參考文獻的全部內容、專利和公布的專利申請在此全文弓I用作為參考。
權利要求
1.ー種同時確定候選抗原或抗原組中是否存在ー種或多種抗原表位的方法，其中所述抗原表位可引起特異性體液應答、TH HLA-DRl限制性應答和/或CTRL HLA-A2限制性應答，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用候選抗原或抗原組； b)測定小鼠體內對該抗原的特異性體液應答； c)測定小鼠體內對該抗原的THHLA-DRl限制性應答；並 d)測定小鼠體內對該抗原的CTRLHLA-A2限制性應答； 其中，如在小鼠體內觀察到對抗原的特異性體液應答，可確定抗原中存在引起體液應答的抗原表位； 如在小鼠體內觀察到對抗原的TH HLA-DRl限制性應答，可確定抗原中存在引起THHLA-DRl限制性應答的抗原表位；而 如在小鼠體內觀察到對抗原的CTRL HLA-A2限制性應答，可確定抗原中存在引起CTRLHLA-A2限制性應答的抗原表位。
2.權利要求I的方法，進ー步包括測定小鼠體內對抗原的Thl-特異性應答和測定小鼠體內對抗原的Th2-特異性應答； 其中，如在小鼠體內觀察到對抗原的Thl-特異性應答，可確定抗原中存在引起小鼠體內Thl-特異性應答的抗原表位； 如在小鼠體內觀察到對抗原的Th2-特異性應答，可確定抗原中存在引起小鼠體內Th2-特異性應答的抗原表位。
3.ー種確定候選抗原或抗原組中是否存在HLA DRl-限制性T輔助細胞抗原表位的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用候選抗原或抗原組；並 b)測定小鼠體內對抗原的THHLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答； 其中，如在小鼠體內觀察到對抗原的TH HLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答，可確定抗原中存在引起TH HLA-DRl限制性T輔助細胞抗原表位應答的抗原表位。
4.ー種確定候選抗原或候選抗原組中是否存在HLA-A2-限制性T細胞毒性(CTL)抗原表位的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠中施用候選抗原或候選抗原組；並 b)測定小鼠體內對抗原或抗原組的HLA-A2-限制性T細胞毒性(CTL)應答； 其中，如在小鼠體內觀察到對抗原或抗原組的HLA-A2-限制性T細胞毒性(CTL)應答，可確定在抗原或抗原組中存在引起HLA-A2限制性T細胞毒性(CTL)應答的抗原表位。
5.一種比較由兩種或兩種以上疫苗誘導的T-輔助細胞應答的效カ的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用第一種候選疫苗，並測量小鼠體內由第一種候選疫苗誘導的T-輔助細胞應答； b)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用第二種候選疫苗，並測量小鼠體內由第二種候選疫苗誘導的T-輔助細胞應答； c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLAI類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的轉基因小鼠，並測量小鼠體內由各種待比較的其他候選疫苗誘導的T-輔助細胞應答；和 d)通過比較針對各種待比較的疫苗的T-輔助細胞應答來確定各種候選疫苗誘導T-輔助細胞應答的效力。
6.權利要求5的方法，其中T-輔助細胞應答為HLA-DRl限制性應答。
7.—種比較由兩種或兩種以上疫苗誘導的T細胞毒性細胞應答的效カ的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用第一種候選疫苗，並測量小鼠體內由第一種疫苗誘導的T細胞毒性細胞應答； b)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用第二種候選疫苗，並測量小鼠體內由第二種候選疫苗誘導的T細胞毒性細胞應答； c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的轉基因小鼠，並測量小鼠體內由每種待比較的其他候選疫苗所誘導的T細胞毒性細胞應答；和 d)通過比較針對各種待比較的疫苗的T細胞毒性細胞應答來確定各種候選疫苗誘導T細胞毒性細胞應答的效力。
8.權利要求7的方法，其中T細胞毒性細胞應答為HLA-A2限制性應答。
9.ー種同時比較由兩種或兩種以上疫苗引起的T-輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答的效カ的方法，該方法包括a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用第一種候選疫苗，並測量小鼠體內由第一種候選疫苗所誘導的T-輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答； b)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用第二種候選疫苗，並測量小鼠體內由第二種候選疫苗所誘導的T-輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答； c)將每種待比較的其他候選疫苗分別施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+0 2m° IA3 °基因型的轉基因小鼠，並測量小鼠體內由各種待比較的候選 疫苗所誘導的T-輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答；並 d)通過比較針對各種待比較的疫苗的T-細胞輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答，確定各種候選疫苗誘導T-輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答的效力。
10.權利要求9的方法，其中T-輔助細胞應答為HLA-DRl限制性應答，且其中T細胞毒性細胞應答為HLA-A2限制性應答。
11.ー種同時確定在以抗原或以包含ー種或多種抗原的疫苗進行免疫後，小鼠體內的體液應答、T輔助細胞應答和T細胞毒性細胞應答的方法，該方法包括 a)將抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗施用於包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DR1+P 2m。IAP。基因型的轉基因小鼠； b)測定小鼠體內對抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗的特異性體液應答； c)測定小鼠體內對抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗的T-輔助細胞應答；並 d)測定小鼠體內對抗原或包含ー種或多種抗原的疫苗的T細胞毒性細胞應答。
12.權利要求11的方法，其中T-輔助細胞應答為THHLA-DRl限制性應答。
13.權利要求12的方法，其中T細胞毒性細胞應答為CTRLHLA-Al限制性應答。
14.ー種基於預先選定的標準對施用於人體的兩種或兩種以上候選疫苗組合物進行優化的方法，該方法包括 根據權利要求11，同時確定小鼠在使用兩種或兩種以上候選疫苗組合物進行免疫後的體液應答、T-輔助細胞應答和T細胞毒性應答；並 通過將預先選定的標準應用於測定結果，選擇最優的疫苗。
15.權利要求14的方法，其中兩種或兩種以上候選疫苗的區別僅在於疫苗中的抗原與佐劑的比例不同。
16.權利要求14的方法，其中兩種或兩種以上候選疫苗的區別僅在於疫苗中的佐劑類型不同。
17.一種確定疫苗在施用於人體後是否存在引起自身免疫性疾病的風險的方法，該方法包括 a)給包含斷裂的H2I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA-A2轉基因和功能性HLA-DRl轉基因的轉基因小鼠或缺乏H2 I類和II類分子、但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因、並具有HLA-A2+HLA-DRl+e2m° IA @。基因型的轉基因小鼠施用疫苗；並 b)測定小鼠體內的自身免疫應答； 其中，如觀察到小鼠體內出現自身免疫應答，表明疫苗在施用於人體後存在引起自身免疫性疾病的風險。
18.ー種分離的轉基因小鼠非胚胎細胞，其包含 a)斷裂的H2I類基因； b)斷裂的H2II類基因；和 c)功能性HLAI類或II類轉基因。
19.ー種分離的轉基因小鼠非胚胎細胞，其包含 a)斷裂的H2I類基因； b)斷裂的H2II類基因； c)功能性HLAI類轉基因；和 c)功能性HLA II類轉基因。
20.權利要求19的轉基因小鼠非胚胎細胞，其中HLAI類轉基因為HLA-A2轉基因，而HLA II類轉基因為HLA-DRl轉基因。
21.權利要求20的轉基因小鼠非胚胎細胞，其中HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
22.—種分離的缺乏H2 I類和II類分子的轉基因小鼠非胚胎細胞，其中所述轉基因小鼠非胚胎細胞包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因。
23.權利要求22的轉基因小鼠非胚胎細胞，其具有HLA-A2+HLA-DR1+P2m°IAP °基因型。
24.權利要求23的轉基因小鼠非胚胎細胞，其中HLA-A2轉基因包含序列表中提供的HLA-A2序列，而HLA-DRl轉基因包含序列表中提供的HLA-DRl序列。
全文摘要
具有人類主要組織相容性複合物(MHC)表型的轉基因小鼠、其實驗性使用及用途，本發明涉及轉基因小鼠和分離的轉基因小鼠細胞，小鼠和小鼠細胞包含斷裂的H2 I類基因、斷裂的H2 II類基因、功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因。在實施方式中，轉基因小鼠或小鼠細胞缺乏H2I類和II類分子，但包含功能性HLA I類轉基因和功能性HLA II類轉基因。在實施方式中，轉基因小鼠或小鼠細胞包含HLA-A2+HLA-DR1+β2m°IAβ°基因型。本發明還涉及使用本發明的轉基因小鼠的方法。
文檔編號C12N15/85GK102727875SQ20121013483
公開日2012年10月17日 申請日期2004年7月5日 優先權日2003年7月30日
發明者克洛德·奧裡歐, 安東尼·帕諾, 弗朗索瓦·萊蒙尼爾, 韋羅尼克·潘克裡, 龍玉春 申請人:巴斯德研究院