一種法氏囊素脂質體的製備方法與流程
2023-04-24 14:10:06 1
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種法氏囊素脂質體的製備方法。
背景技術：
法氏囊(bursaoffabricus，bf)是禽類獨有的中樞體液免疫器官，相當於哺乳動物的骨髓。bf中存在許多生物活性物質，尤其是一些具有免疫調節作用的小肽，能促進禽類及哺乳動物淋巴細胞的分化發育及免疫器官的成熟，一般將這一類小分子生物活性肽稱為法氏囊素(bursin,bs)。近年來人們對bs的生物學功能及其作用機制進行了廣泛的研究。現已證實，bs大多具有免疫調節功能，如囊素三肽，胺基酸組成順序是lys-his-gly-nh2，其中lys：his：gly：nh2為1：0.9：1：0.8，可誘導哺乳動物和禽類b細胞的分化，還能提高人的daudib細胞中camp、cgmp的濃度，並認為該物質在禽類和哺乳動物均有相似的生物活性。
法氏囊素作為一種最初從禽類法氏囊中提取出的物質並沒有種屬的限制性，在多種動物及疾病的研究中不僅證明了它具有提高機體增重和飼料轉化率等效果，還能增強機體的免疫調節水平，具有良好的免疫學活性。因此，將bs作為免疫增強劑用作各種動物疫苗佐劑、飼料添加劑或輔助治療劑等將會大大提高疫苗效果，增強動物的免疫力，保證動物的健康生長，促進養殖業的發展，提高經濟效益。
在以往的研究過程中，多數直接採用法氏囊粗提物作為研究法氏囊活性肽的材料，由於這種粗提物中含有大量非特異的大分子蛋白質等組織成分，給動物機體注射可能會引起不良反應，甚至發生過敏而死亡，幹擾或掩蓋了法氏囊素的作用，得不到一個可靠的實驗結果。此外，從法氏囊中提取的法氏囊素，如果直接投入使用，存在法氏囊素不穩定，操作不便等缺點。因此要想進一步研究法氏囊素的生物學活性及其應用，需要改進生產工藝，建立一套正確的製備方法，既保證其生物學活性又有一定的濃度和純度。
技術實現要素：
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種可以提高法氏囊素穩定性的法氏囊素脂質體的製備方法。
為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
一種法氏囊素脂質體的製備方法，包括以下步驟：
1)將磷脂與膽固醇按照質量比1∶3-5混合均勻，得到脂質混合物；
2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解於乙醚中，然後加入待包封的法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，並使體系始終處於惰性氣體環境中；
3）將上述兩相體系置於水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止；
4）超聲結束後，將體系中的混合物置於旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚；
5）收集上述旋轉蒸發後得到的混合物，離心，收集固相，得到法氏囊素脂質體。
所述步驟1），磷脂與膽固醇的質量比為1∶4。
所述步驟2），法氏囊素水相的濃度為1mg/ml。
所述步驟3），超聲功率為100-150w，超聲時間為10-60min，超聲溫度為10℃以下。
所述步驟4），旋轉蒸發的轉速為150-250r/min。
所述步驟4）的旋轉蒸發過程，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為500~700mmhg，旋轉蒸發25-35min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然後將旋轉蒸發瓶內壓強降低至400~600mmhg，旋轉蒸發15-20min除去混合物中痕量的乙醚。
所述步驟5），離心條件為：2~8℃條件下，20000-25000g離心25-35min。
進一步，所述步驟2），法氏囊素的製備方法如下：
1）取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗乾淨後，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶1-3混合均勻，然後採用組織搗碎機依次按照轉速16000-17000r/min、18000-19000r/min、21000-22000r/min進行搗碎，搗碎後的法氏囊經膠體磨勻漿後得到勻漿液，並於-20℃以下凍存；
2）取出凍存的勻漿液反覆凍融4-6次；
3）將凍融結束的勻漿液於2~8℃以下，6000-8000r/min離心15-25min，取上清液；
4）在上清液中加入終濃度為0.01-0.02%β-丙內酯，於2-8℃下攪拌16-32h進行滅活；
5）將滅活後的溶液於35-39℃水解2-3h；
6）將水解後的溶液用0.22-0.45μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液並採用1-5kd濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；
7）調節超濾透過液的滲透壓使之成為等滲溶液；
8）將上述等滲溶液用0.1-0.22μm除菌過濾器除菌，收集的液體即為法氏囊素。
本發明採用以上技術方案，將法氏囊素包封於脂質混合物中，得到法氏囊素脂質體，用於機體不僅增強了法氏囊素的穩定性，使其在機體中維持時間更長，而且容易與細胞發生吸附、融合、脂交換而被細胞內吞，直接進入細胞內，提高了治療指數及生物利用度，且當法氏囊素脂質體與滅活疫苗聯合使用時，滅活疫苗更容易溶解於法氏囊素脂質體中，操作更加方便。
本發明法氏囊素製備過程，步驟1）按法氏囊與注射用水的重量比為1∶1-3進行勻漿，使環境處於低滲狀態，細胞更容易破裂，更徹底釋放法氏囊素，增加了法氏囊的利用率。步驟4），凍融結束得到的法氏囊上清液採用β-丙內酯進行病毒滅活，保證提取液安全無毒。步驟6），運用超濾系統進行1-5kd超濾，不僅能夠去除大量非特異的大分子蛋白，而且截留更多有活性的小分子多肽。
具體實施方式
一種法氏囊素脂質體的製備方法，包括以下步驟：
1、提取法氏囊素
1.1取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗乾淨後，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶1-3混合均勻，然後採用組織搗碎機依次按照轉速16000-17000r/min、18000-19000r/min、21000-22000r/min進行搗碎，搗碎後的法氏囊經膠體磨勻漿後得到勻漿液，並於-20℃以下凍存；
1.2取出凍存的勻漿液反覆凍融4-6次；
1.3將凍融結束的勻漿液於2~8℃條件下，6000-8000r/min離心15-25min，取上清液；
1.4在上清液中加入終濃度為0.01-0.02%β-丙內酯，於2-8℃下攪拌16-32h進行滅活；
1.5將滅活後的溶液於35-39℃水解2-3h；
1.6將水解後的溶液用0.22-0.45μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液並採用1-5kd濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；
1.7調節超濾透過液的滲透壓使之成為等滲溶液；
1.8將上述等滲溶液用0.1-0.22μm除菌過濾器除菌，收集的液體即為法氏囊素。
2、製備法氏囊素脂質體
2.1將磷脂與膽固醇按照質量比1∶3-5混合均勻，得到脂質混合物（若該步驟選用液態形式的磷脂、膽固醇，應先將磷脂、膽固醇採用旋轉蒸發的形式去除溶劑）；
2.2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解於乙醚中，然後加入待包封的濃度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，並使體系始終處於惰性氣體環境中；
2.3）將上述兩相體系置於水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止(當液體從乳白色變成乳光狀，即對著日光能透過樣品看清窗框，即可)；
其中，超聲功率為100-150w，超聲時間為10-60min，超聲溫度為10℃以下；
2.4）超聲結束後，將體系中的混合物置於旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚。具體的，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為500~700mmhg，旋轉蒸發25-35min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然後將旋轉蒸發瓶內壓強降低至400~600mmhg，旋轉蒸發15-20min除去混合物中痕量的乙醚；旋轉蒸發的轉速控制為150-250r/min，在有機溶劑乙醚的蒸發過程中，必須完全避免起泡或沸騰；
2.5）收集上述旋轉蒸發後得到的混合物，於10℃以下，20000-25000g離心25-35min，收集固相，得到法氏囊素脂質體。
實施例1
一種法氏囊素脂質體的製備方法，包括以下步驟：
1、提取法氏囊素
1.1取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗乾淨後，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶3混合均勻，然後採用組織搗碎機依次按照轉速16800r/min、18800r/min、21500r/min進行搗碎，搗碎後的法氏囊經膠體磨勻漿後得到勻漿液，並於-20℃以下凍存；
1.2取出凍存的勻漿液反覆凍融6次；
1.3將凍融結束的勻漿液於2℃，6000r/min離心25min，取上清液；
1.4在上清液中加入終濃度為0.01%β-丙內酯，於5℃下攪拌27h進行滅活；
1.5將滅活後的溶液於37℃水解2h；
1.6將水解後的溶液用0.45μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液並採用5kd濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；
1.7調節超濾透過液的滲透壓使之成為等滲溶液；
1.8將上述等滲溶液用0.22μm除菌過濾器除菌，收集的液體即為法氏囊素。
2、製備法氏囊素脂質體
2.1將磷脂與膽固醇按照質量比1∶4混合均勻，得到脂質混合物；
2.2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解於乙醚中，然後加入待包封的濃度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，並使體系始終處於惰性氣體環境中；
2.3）將上述兩相體系置於水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止(當液體從乳白色變成乳光狀，即對著日光能透過樣品看清窗框，即可)；
其中，超聲功率為125w，超聲時間為30min，超聲溫度為10℃以下；
2.4）超聲結束後，將體系中的混合物置於旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚，具體的，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為600mmhg，旋轉蒸發30min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然後將旋轉蒸發瓶內壓強降低至500mmhg，旋轉蒸發15min除去混合物中痕量的乙醚；旋轉蒸發的轉速控制為250r/min，在有機溶劑乙醚的蒸發過程中，必須完全避免起泡或沸騰；
2.5）收集上述旋轉蒸發後得到的混合物，於10℃以下，22500g離心30min，收集固相，得到法氏囊素脂質體。
實施例2
一種法氏囊素脂質體的製備方法，包括以下步驟：
1、提取法氏囊素
1.1取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗乾淨後，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶2混合均勻，然後採用組織搗碎機依次按照轉速16000r/min、18000r/min、21000r/min進行搗碎，搗碎後的法氏囊經膠體磨勻漿後得到勻漿液，並於-20℃以下凍存；
1.2取出凍存的勻漿液反覆凍融5次；
1.3將凍融結束的勻漿液於4℃，8000r/min離心15min，取上清液；
1.4在上清液中加入終濃度為0.02%β-丙內酯，於2℃下攪拌30h進行滅活；
1.5將滅活後的溶液於35℃水解3h；
1.6將水解後的溶液用0.22μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液並採用1kd濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；
1.7調節超濾透過液的滲透壓使之成為等滲溶液；
1.8將上述等滲溶液用0.1μm除菌過濾器除菌，收集的液體即為法氏囊素。
2、製備法氏囊素脂質體
2.1將磷脂與膽固醇按照質量比1∶3混合均勻，得到脂質混合物；
2.2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解於乙醚中，然後加入待包封的濃度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，並使體系始終處於惰性氣體環境中；
.2.3）將上述兩相體系置於水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止(當液體從乳白色變成乳光狀，即對著日光能透過樣品看清窗框，即可)；
其中，超聲功率為100w，超聲時間為60min，超聲溫度為10℃以下；
2.4）超聲結束後，將體系中的混合物置於旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚，具體的，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為500mmhg，旋轉蒸發35min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然後將旋轉蒸發瓶內壓強降低至400mmhg，旋轉蒸發20min除去混合物中痕量的乙醚；旋轉蒸發的轉速控制為200r/min，在有機溶劑乙醚的蒸發過程中，必須完全避免起泡或沸騰；
2.5）收集上述旋轉蒸發後得到的混合物，於10℃以下，20000g離心35min，收集固相，得到法氏囊素脂質體。
實施例3
一種法氏囊素脂質體的製備方法，包括以下步驟：
1、提取法氏囊素
1.1取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗乾淨後，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶1混合均勻，然後採用組織搗碎機依次按照轉速17000r/min、19000r/min、22000r/min進行搗碎，搗碎後的法氏囊經膠體磨勻漿後得到勻漿液，並於-20℃以下凍存；
1.2取出凍存的勻漿液反覆凍融4次；
1.3將凍融結束的勻漿液於6℃，7000r/min離心15-25min，取上清液；
1.4在上清液中加入終濃度為0.015%的β-丙內酯，於8℃下攪拌24h進行滅活；
1.5將滅活後的溶液於39℃水解2h；
1.6將水解後的溶液用0.22μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液並採用3kd濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；
1.7調節超濾透過液的滲透壓使之成為等滲溶液；
1.8將上述等滲溶液用0.1μm除菌過濾器除菌，收集的液體即為法氏囊素。
2、製備法氏囊素脂質體
2.1將磷脂與膽固醇按照質量比1∶5混合均勻，得到脂質混合物；
2.2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解於乙醚中，然後加入待包封的濃度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，並使體系始終處於惰性氣體環境中；
.2.3）將上述兩相體系置於水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止(當液體從乳白色變成乳光狀，即對著日光能透過樣品看清窗框，即可)；
其中，超聲功率為150w，超聲時間為10min，超聲溫度為10℃以下；
2.4）超聲結束後，將體系中的混合物置於旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚，具體的，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為700mmhg，旋轉蒸發25min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然後將旋轉蒸發瓶內壓強降低至600mmhg，旋轉蒸發15min除去混合物中痕量的乙醚；旋轉蒸發的轉速控制為180r/min，在有機溶劑乙醚的蒸發過程中，必須完全避免起泡或沸騰；
2.5）收集上述旋轉蒸發後得到的混合物，於10℃以下，25000g離心25min，收集固相，得到法氏囊素脂質體。
實施例4
一種法氏囊素脂質體的製備方法，包括以下步驟：
1、提取法氏囊素
1.1取新鮮雞法氏囊，去除脂肪、筋膜，用注射用水清洗乾淨後，按法氏囊與注射用水的重量比為1∶3混合均勻，然後採用組織搗碎機依次按照轉速16800r/min、18800r/min、21500r/min進行搗碎，搗碎後的法氏囊經膠體磨勻漿後得到勻漿液，並於-20℃以下凍存；
1.2取出凍存的勻漿液反覆凍融6次；
1.3將凍融結束的勻漿液於8℃，6000r/min離心20min，取上清液；
1.4在上清液中加入終濃度為0.01-0.02%β-丙內酯，於6℃下攪拌24h進行滅活；
1.5將滅活後的溶液於37℃水解2.5h；
1.6將水解後的溶液用0.45μm濾膜進行切向流微濾，收集微濾透過液並採用5kd濾膜進行切向流超濾，收集超濾透過液；
1.7調節超濾透過液的滲透壓使之成為等滲溶液；
1.8將上述等滲溶液用0.22μm除菌過濾器除菌，收集的液體即為法氏囊素。
2、製備法氏囊素脂質體
2.1將磷脂與膽固醇按照質量比1∶4混合均勻，得到脂質混合物；
2.2）在惰性氣體環境中，將上述脂質混合物溶解於乙醚中，然後加入待包封的濃度1mg/ml法氏囊素水相，得到水-有機溶劑兩相體系，並使體系始終處於惰性氣體環境中；
.2.3）將上述兩相體系置於水浴式超聲儀中進行超聲反應，直至體系中的混合物變為澄清的單相分散體或有乳光的均勻分散體為止(當液體從乳白色變成乳光狀，即對著日光能透過樣品看清窗框，即可)；
其中，超聲功率為120w，超聲時間為25min，超聲溫度為10℃以下；
2.4）超聲結束後，將體系中的混合物置於旋轉蒸發儀中，減壓旋轉蒸發除去混合物中的殘留的乙醚，具體的，先維持旋轉蒸發瓶內的壓強為650mmhg，旋轉蒸發30min除去混合物中的大部分殘留乙醚，然後將旋轉蒸發瓶內壓強降低至500mmhg，旋轉蒸發15min除去混合物中痕量的乙醚；旋轉蒸發的轉速控制為150r/min，在有機溶劑乙醚的蒸發過程中，必須完全避免起泡或沸騰；
2.5）收集上述旋轉蒸發後得到的混合物，於10℃以下，25000g離心30min，收集固相，得到法氏囊素脂質體。