神經調節蛋白突變體、篩選方法及應用的製作方法

2023-04-24 10:45:16

專利名稱：神經調節蛋白突變體、篩選方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及特異性激活ErbB受體的NRG突變體、篩選方法及其應用。
背景技術：
神經調節蛋白(Neuregulins，NRGs)及受體ErbBs家族在神經、肌肉、上皮等組織、器官形成過程中細胞信號傳導的作用已經有廣泛的認識(Lemke，Mol.Cell.Neurosci.7247-262，1996；Burden et al.，Neuron 18847-855，1997)。
研究較深入的是NRG-1基因編碼的蛋白質，約包括結構相同的15種不同的亞型(Lemke，Mol.Cell.Neurosci.7247-262，1996 and Peles and Yarden，BioEssays 15815-824，1993)。NRG-1亞型包括Neu Differentiation Factor(NDF；Peles et al.，Cell 69，205-216，1992及Wen et al.，Cell 69，559-572，1992)，Heregulin(HRG；Holmes et al.，Science 2561205-1210，1992)，AcetylcholineReceptor Inducing Activity(ARIA；Falls et al.，Cell 72801-815，1993)，以及glial growth factors GGF1，GGF2和GGF3(Marchionni et al.，Nature 362312-8，1993)。
用同源克隆方法(Chang et al.，Nature 387509-512，1997；Carraway et al.，Nature 387512-516，1997；及Higashiyama et al.，J.Biochem.122675-680，1997)及基因組方法發現了NRG-2基因(Busfield et al.，Mol.Cell.Biol.174007-4014，1997)。NRG-2基因編碼的NRG-2亞型包括Neural-andThymus-Derived Activator of erbB Kinases(NTAK；Genbank Accession No.AB005060)，Divergent of Neuregulin(Don-1)以及Cerebellum-Derived GrowthFactor(CDGF；WO 97/09425)。表達ErbB4或ErbB2/ErbB4受體的細胞顯示出對NRG-2有較強的應答效應(Pinkas-Kramarski et al.，Mol.Cell.Biol.186090-6101，1998)。研究顯示NRG-3、NRG-4基因編碼蛋白主要結合併激活ErbB4受體磷酸化，但NRG-3對ErbB4受體的生物應答效應較低，而NRG-4則不產生對ErbB4受體的生物應答效應(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 949562-9567，1997Hijazi et al.，Int.J.Oncol.131061-1067，1998；Hobbset al.，Oncogene.，21(55)8442-52，2002)。
EGF-like結構域是各種NRG的重要功能域，是NRG結合併激活ErbB受體家族功能域，ErbB家族屬於生長因子家族，包括EGFR(或ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4或稱為HER1、HER2、HER3、HER4(Meyer et al.，Development 1243575-3586，1997；Orr-Urtreger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901867-71，1993；Marchionni et al.，Nature 362312-8，1993；Chen et al.，J.Comp.Neurol.349389-400，1994；Corfas et al.，Neuron 14103-115，1995；Meyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911064-1068，1994；andPinkas-Kramarski et al.，Oncogene 152803-2815，1997)。
NRG在各種生命活動有非常重要的作用，除了在神經系統中有重要的作用外(Garratt et al.，Bioessays 22987-996，2000；Jessen et al.，Microsc.Res.Tech.41393-402，1998；Jessen et al.，Neurosci.22402-410，1999；Vartanian et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96731-735，1999；Bermingham-McDonogh et al.，Mol.Cell.Neurosci.10184-195，1997；Canoll et al.，Mol.Cell.Neurosci.1379-94，1999)還在心臟發育及功能正常起重要的作用(Meyer et al，Nature 378386-390，1995；Leeet al，Nature.378394-398，1995；Gassmann et al，Nature 378390-394，1995；Liuet al，Proc.Natl.Acad.Sci.，9513024-13029.1998；Douglas et al，Circulation2002；1051551-1554以及Crone et al，Nat Med 8(5)459-465，2002)。NRG在心臟病的治療有重要的作用(WO00/37095，WO0064400，USPN6444642)。
NRGs與ErbB3或ErbB4受體有較高的結合作用。這種配體-受體的結合導致ErbB3或ErbB4受體與其他ErbB受體形成二聚體，該二聚體激活特定酪氨酸基團磷酸化。研究發現rhNRG在激活ErbB4受體治療心臟病的同時會激活其它ErbB受體產生副作用。本發明提供了特異性激活ErbB受體的NRG突變體、篩選方法及其應用。本發明提供的特異性激活ErbB受體的NRG突變體可避免激活其它ErbB受體引起的副作用。
發明概述本發明提供了篩選特異性激活ErbB受體的NRG突變體的方法，該方法包括用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4複合物的三維結構；分子動力學模擬NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的構象和穩定性；MM/PBSA方法計算NRG與ErbB3或ErbB4的結合自由能；丙氨酸理論掃描計算方法確定NRG殘基突變成丙氨酸後對NRG與受體親合性變化，根據該變化確定特異性激活ErbB受體的NRG突變體的篩選方法。本發明還提供了NRG突變體、NRG突變體的應用及製備方法。具體說，本發明提供了特異性激活ErbB3受體的NRG突變體和特異性激活ErbB4受體的NRG突變體以及上述NRG突變體的應用。


圖1NRG-1β和NRG-1α的序列聯配結果圖。
圖2(A)ErbB4和EGFR的序列聯配結果圖在圖中，「*」號，代表等同的殘基；「」，號代表保守的殘基取代；「.」代表半保守的取代。聯配結果為等同性，47.7％；相似性，80.9％。(B)ErbB3和EGFR的序列聯配結果圖在圖中，「*」號，代表等同的殘基；「」，號代表保守的殘基取代；「.」代表半保守的取代。聯配結果為等同性，44.9％；相似性，77.1％。
圖3(A)NRG-1β(蘭)與EGF(紅)結構疊合立體圖(B)ErbB3(蘭)和EGFR(紅)結構疊合立體圖(C)ErbB4(蘭)Cα鏈與EGFR(紅)結構疊合立體圖。
圖4(A)NRG-1β/ErbB3的PROCHECK4(B)NRG-1β/ErbB4的PROCHECK5NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4分子動力學模擬Cα(A)RMSD圖和(B)RMSF6NRG-1β/ErbB3(A)和NRG-1β/ErbB4(B)帶狀模型圖在複合物中NRG-1β部分顯示為紅色；複合物中受體結構域I、II、III和IV分別顯示為蘭色、綠色、橙色和灰色。本圖由MOLSCRIPT程序製作。
圖7ErbB3(綠色)和NRG-1β(紅)通過三個作用位點的相互作用圖(A)在位點1間的配體/受體相互作用；(B)在位點2間的配體/受體相互作用；(C)在位點3間的配體/受體相互作用。在本圖中只列出相互作用於殘基的側鏈，綠色的點代表氫鍵。
圖8ErbB4(綠色)和NRG-1β(紅)通過三個作用位點的相互作用圖(A)在位點1間的配體/受體相互作用；(B)在位點2間的配體/受體相互作用；(C)在位點3間的配體/受體相互作用。在本圖中只列出相互作用於殘基的側鏈，綠色的點代表氫鍵。
圖9(A)NRG-1β的Arg31的側鏈與ErbB3的Glu131的側鏈形成氫鍵距離在分子動力學過程中的變化(B)NRG-1β的Asn47的側鏈與ErbB3的Asp343的側鏈形成氫鍵距離在分子動力學過程中的變化圖10 NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4MM-PBSA自由能計算結果表示圖，負值的ΔΔGsubtotal表示取代會導致結合能力降低；正值的ΔΔGsubtotal表示取代會提高結合能力。
圖11.NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4結合位點附近的MM-PBSA自由能計算對ΔΔGbinding中ΔΔEvdw、ΔΔGnonpolar和ΔΔEele+ΔΔGPB能量分解示意圖.圖中(o)代表ΔΔEvdw；(▲)代表ΔΔGnonpolar；(·)代表ΔΔEele+ΔΔGPB。(A)為NRG-1β/ErbB3；(B)為NRG-1β/ErbB4。
圖12分子動力學模擬的蛋白質Cα的RMSD和RMSF圖。(A)NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的RMSD圖，(B)NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的RMSF圖。
實施發明方式為清楚公開發明內容而不是限制發明，分以下小節詳細說明。
A.釋義除另有定義，這裡使用的所有科技術語與本發明所屬技術領域的普通技術人員理解含義相同。所有專利文獻、專利申請文獻、公開的專利文獻和其他出版物均作為參考。如本節闡述的定義與上述參考文獻所述的定義不一致或相反時，以本節闡述的定義為準。
在此所用「一個」的意思是「至少一個」或「一個或多於一個」。
在此所用「神經調節蛋白」或「neuregulin」或「NRG」、「NRG-1」、「NRG-2」、「NRG-3」、「NRG-4」的意思是指與ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3結合，可以激活上述受體的蛋白質或多肽。它能激活上述受體，並調控多種生物反應如刺激乳腺癌細胞分化和乳蛋白的分泌；誘導神經脊細胞分化為Schwann細胞；刺激骨胳肌細胞內乙醯膽鹼受體的合成；以及促進心肌細胞成活。常見神經調節蛋白可由如NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)編碼的蛋白質或多肽。由於在多肽的非功能區域個別胺基酸的改變對其功能無影響(參見Watson等.Molecular Biology of theGene，4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)，這裡，NRG也包括保留NRG保守胺基酸序列，但其生物學活性不變的NRG異構體。
在此所用「EGF樣結構域」或「epidermal growth factor-like domain」或「EGF-like domain」是指與ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3結合，具有與EGF受體結合區域相同結構的多肽結構，常見「EGF樣結構域」可由NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)編碼。「EGF樣結構域」包括α、β亞型。關於EGF樣結構域參見WO 00/64400，Holmes等.，Science，2561205-1210(1992)；美國專利Nos.5,530,109及5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，131061-1067(1998)；Chang等，Nature，387509-512(1997)；Carraway等，Nature，387512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochern.，122675-680(1997)及WO 97/09425。
在此所用「功能片段或類似物」是指神經調節蛋白的功能片段或類似物保留對靈長類疾病的預防、治療或延緩作用。通常，這些功能片段或類似物至少保留50％對預防、治療或延緩靈長類疾病的作用，更好的情況下，這些功能片段或類似物至少保留60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％預防、治療或延緩靈長類疾病的作用。
在此所用「erb」指兩種癌基因，erb A和erb B，與骨髓成紅血細胞增多症病毒相關(一種急性的轉化性逆轉錄病毒)。
在此所用「用於治療特定疾病的化合物的有效用量」是指足以改善，或是以某種方式減少與該疾病相關的症狀的用量。這樣的用量可以作為單一劑量或者根據一個配方其可有效的服用劑量。這個用量可能治癒疾病，但是典型的情況是為了改善疾病症狀而服用。為達到期望的症狀改善，可能需要連續服用。
在此所用「治療」的意思是使任何狀態、不適或疾病的症狀得到改善或存在有益變化的方法。治療也包括其中組合物的任意藥物治療應用。
在此，通過服用特定的藥物治療組合物達到特定不適的症狀「改善」是指任何的減輕，不管是永久的還是暫時的，持久的還是短暫，只要該減輕可以歸功於或是與服用組合物有關係。
在此所用「重組方法生產」是指使用重組核酸方法的生產方法。本方法是以眾所周知、用克隆化的核酸表達所編碼的蛋白質的分子生物學方法。
在此所用「互補的」當是指兩個核酸分子時，意思是兩個核苷酸序列能雜交，優選是低於25％，更優選是低於15％，甚至更加優選是低於5％，最優選是在相對的核苷酸處不存在錯誤配對。優選在嚴格條件下，這兩個分子雜交。
在此所用決定錯誤配對百分率的「雜交的嚴格性」如下規定高嚴格性0.1 x SSPE，0.1％ SDS，65℃；中等嚴格性0.2 x SSPE，0.1％ SDS，50℃；(也指適度嚴格性)低嚴格性1.0 x SSPE，0.1％ SDS，50℃；應理解為使用對等的緩衝液、鹽和溫度，可以獲得相當的嚴格性。
「載體(質粒)」是指用於將外源DNA導入細胞進行表達或複製的不連續的元件。選擇和使用此種載體在這種技術人員的技術範圍內是廣為人知的。表達載體包括能表達DNA的載體，其DNA有效地與調控序列，例如啟動子區域，連接在一起。調控序列能影響該段DNA片段的表達。所以，一個表達載體是指重組DNA或RNA構成物，例如質粒、噬菌體、重組病毒或其他載體，它們一旦導入適當的宿主細胞中，導致克隆的DNA表達。合適的表達載體對本領域的技術人員而言十分清楚，並且包括能在真核細胞和(或)原核細胞中複製的載體以及保持游離態或整合進宿主細胞基因組的載體。
在此所用「啟動子區域或啟動子元件」是指控制與其有效連接的DNA或RNA的轉錄DNA或RNA片段。啟動子區域包含足以讓RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始的特定序列。啟動子區域的這一部分是指啟動子。並且，啟動子區域還包括調節RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始活動的序列。這些序列可以是順式作用因子或對反式作用因子作出響應。依據調節的性質，啟動子可以是組成型的或調節型的。考慮用於原核生物的典型的啟動子包括噬菌體T7和T3啟動子和相似的啟動子。
在此所用「有效連接和有效結合」是指核苷酸效應序列和調節序列，例如啟動子、增強子、轉錄和翻譯終止位點和其他信號序列與DNA間的功能關係。舉例而言，DNA和啟動子的有效連接是指DNA和啟動子間的物理和功能關係，該關係使專一識別、結合和轉錄該段DNA的RNA聚合酶能夠從啟動子處起始該段DNA的轉錄。為便於優化表達和(或)體外轉錄，有必要去掉、增加或改變克隆的5′不翻譯部分，以便消除多餘的、潛在不適當替代性翻譯起始密碼子或其他不論是在轉錄或翻譯水平上幹擾或減少表達的序列。其他方法還有將核糖體結合位點共有序列緊接起始密碼子的5′插入，可以增強表達。(參考實例，Kozak，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.，26619867-19870(1991)。
B.篩選特異性激活ErbB受體的NRG突變體的方法本發明提供了篩選特異性激活ErbB受體的NRG突變體的方法，該方法包括用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4複合物的三維結構；分子動力學模擬NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的構象和穩定性；MM/PBSA方法計算NRG與ErbB3或ErbB4的結合自由能；丙氨酸理論掃描計算方法確定NRG殘基突變成丙氨酸後對NRG與受體親合性變化，根據該變化確定特異性激活ErbB受體的NRG突變體的篩選方法。
C.NRG突變體及其製備本發明涉及編碼NRG突變體的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點25突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點35突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點46突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點16突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點29突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點31突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點33突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點47突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。
核酸片段可以適當的形式存在。例如，分離的核酸片段包括DNA、RNA、PNA或其衍生物。此外，分離的核酸片段可以包含DNA和RNA或其衍生物。分離的核酸片段能夠是單鏈形式並且適合雜交分析。另外，分離的核酸片段也能夠是雙鏈形式並在雜交分析前變性成單鏈結構。
分離的核酸片段可以包括包含遺傳密碼和(或)自然發生結構的任何一種寡聚核苷酸或核酸鏈。分離的核酸片段能夠包括非自然結構，例如非自然鹼基，例如次黃嘌呤和黃嘌呤，非自然糖類，例如2』-甲氧基核酸，或非自然磷酸二酯鍵，例如甲基膦酸酯、偶磷酯和多肽。
分離的核酸片段能用任何適合的方法產生。例如，分離的核酸片段由化學合成(參見，Ausubel，分子生物學流行方法(Current Protocols in MolecularBiology)，2.11.寡核苷酸的合成和純化(Synthesis and purification ofoligonucleotides)，John Wiley Sons公司(2000))，自然物中分離，由重組方法產生或由上述方法結合產生。優選地，用重組方法產生分離的核酸片段。
本發明還提供了包括上述核酸片段的質粒。同時，提供了包括上述質粒的細胞，包括任何適合的細胞，例如，細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞和人細胞。
本發明涉及生產NRG突變體的方法，該方法包括培養表達NRG突變體的細胞，以及回收表達的NRG突變體。
本發明涉及NRG突變體的蛋白質或肽，NRG突變體包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點25突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點35突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點46突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點16突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點29突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點31突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點33突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點47突變成丙氨酸的胺基酸序列的蛋白質或肽。任何一種合適的方法能產生NRG突變體。例如，NRG突變體能化學合成、從自然材料中分離、用重組方法產生或由上述方法結合生產。優選地，用重組方法生產NRG突變體。
本發明涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括分離的核酸片段和藥學上可以接受的載體或賦形劑，該核酸片段編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點25突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點35突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點46突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點16突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點29突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點31突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點33突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。編碼NRG突變體的核苷酸序列包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點47突變成丙氨酸的胺基酸序列的核酸片段。包括編碼的胺基酸序列所對應的核苷酸序列或其互補鏈。
本發明涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括基本上純化的蛋白質或肽和一種藥學上可接受的載體或賦形劑，該蛋白質或肽包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點25突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點35突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點46突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點16突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點29突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點31突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點33突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點47突變成丙氨酸的胺基酸序列的蛋白質或肽。
D.NRG突變體的應用在本發明中，特異性激活ErbB受體的NRG突變體，通過專一性激活ErbB2/ErbB4受體或專一性激活ErbB2/ErbB3受體途徑預防、治療或延緩哺乳動物疾病。
本發明中，篩選的NRG突變體在製備特異性激活ErbB2/ErbB3受體藥物的應用。本發明中，篩選的NRG突變體在製備特異性激活ErbB2/ErbB4受體藥物的應用。
本發明中，特異性激活ErbB受體的NRG突變體能用於預防、治療或延緩任何哺乳動物例如小鼠、大鼠、兔子、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬和靈長類動物。
本發明中，哺乳動物疾病包括發生在骨、耳、眼睛、眼瞼、頭頸部、心臟、喉、下顎、下顎外側髁、上頜骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、胰腺、腮腺、耳廓、垂體、前列腺視網膜、唾液腺、皮膚、肌肉、脊髓、甲狀腺、扁桃腺、神經系統、呼吸系統、消化系統、循環系統、生殖系統、泌尿系統、內分泌系統、心血管疾病、造血系統的疾病。
在本發明中，特異性激活ErbB2/ErbB3受體的NRG突變體，通過專一性激活ErbB2/ErbB3受體途徑，預防、治療或延緩哺乳動物神經系統疾病，其中神經系統疾病包括中樞神經系統疾病、周圍神經系統疾病、脊髓疾病、腦膜疾病、脫髓鞘性疾病、錐體外系統疾病。這裡特異性激活ErbB2/ErbB3受體的NRG突變體包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點25突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點35突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點46突變成丙氨酸的胺基酸序列，的蛋白質或肽。
在本發明中，特異性激活ErbB2/ErbB4受體的NRG突變體，通過專一性激活ErbB2/ErbB4受體途徑，預防、治療或延緩哺乳動物心臟病。這裡特異性激活ErbB4受體的NRG突變體包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點16突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點29突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點31突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點33突變成丙氨酸的胺基酸序列，包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點47突變成丙氨酸的胺基酸序列的蛋白質或肽。本發明中，特異性激活ErbB2/ErbB4受體的NRG突變體，可預防、治療或延緩哺乳動物心臟病如人的心力衰竭、心肌梗塞、擴張型心臟病及心肌炎。
NRG突變體用於預防、治療或延緩哺乳動物疾病的配方、劑量和給藥途徑，尤其作為藥物組合物時，可根據本技術領域所知的方法加以確定。(參見，例如，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy)，Alfonso R.Gennaro(編者)，Mack出版社，1997年四月；治療用肽和蛋白配方、加工和傳遞系統(Therapeutic Peptides and ProteinsFormulation，Processing，and Delivery Systems)，Banga，1999；和肽和蛋白製藥配方的發展(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins)，Hovgaard和Frkjr(編者)，Taylor Francis公司，2000；脂質體的醫學應用(Medical Applications of Liposomes)，Lasic和Papahadjopoulos(編者)，Elsevier Science，1998；基因治療教程(Textbook of Gene Therapy)，Jain，Hogrefe Huber出版社，1998；腺病毒基因治療的基本生物學(AdenovirusesBasic Biology to Gene Therapy)，15卷，Seth，LandesBioscience，1999；生物製藥的藥物設計和發展(Biopharmaceutical Drug Designand Development)，Wu-Pong和Rojanasakul(編者)，Humana出版社，1999；治療學上的血管發生從基礎科學到臨床(Therapeutic AngiogenesisFromBasic Science to the Clinic)，28卷，Dole等(編者)，Springer-Verlag New York，1999)。NRG突變體可配製成用於口服，直腸給藥，局部用藥，吸入法用藥，口腔用藥(例如舌下)，注射用藥(例如，皮下的，肌內的，皮內的，靜脈的)，經皮給藥或其他適合的給藥途徑。在任何給定的情況下，最合適的給藥途徑將取決於要治療情況的性質和嚴重程度以及所用的特定NRG突變體的性質。優選地，本發明中NRG突變體通過靜脈注射給藥。
NRG突變體能夠單獨使用。優選的方式是，NRG突變體與藥物治療上可接受的載體或者賦形劑共同使用。任何合適的藥物治療可以接受的載體或者賦形劑能用於本方法中(參見，例如，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(編者)，Mack出版社，1997年四月)。
根據本發明，無論單獨或是與其它藥劑、載體或賦形劑聯合使用的NRG突變體或者編碼NRG突變體的核酸，可以系統用於任何的給藥途徑，諸如海綿體內注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、皮內注射、口服或局部用藥。本方法可以使用以單位劑量形式、一次用量針劑或多劑量容器的含有添加的防腐劑的注射製劑。該配方可以採用油質或水質賦形劑中的懸濁液，溶液或乳濁液形式並且可以包含配方試劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。活性成分也可以是粉狀，以便在使用前與適合的載體、無菌不含熱源的水或其他溶劑混合。本發明的局部用藥可以採用泡沫狀物、凝膠體、霜、藥膏、透皮藥膏或軟膏。任何適合給藥途徑可以使用。劑量形式包括片劑、錠劑、扁囊劑、分散體、懸濁液、溶液、膠囊、藥膏和類似形態(參考，雷明頓氏藥物治療科學)。優選地，本發明中NRG突變體或者編碼NRG突變體的核酸是凍乾粉方式。
治療或預防中藥物治療劑量的大小將隨治療的狀況的嚴重程度和給藥途徑變化。劑量和劑量頻率根據病人自身年齡、體重、疾病狀況和反應而變化。
主治醫生應當知道怎樣和何時由於藥物毒性或不利的效應終止、中斷或將治療調整到低劑量。相反地，醫生應當知道怎樣和何時由於臨床效應不足(排除了毒性副效應)，將治療調整到高水平。
在實際應用中，無論單獨或是與其它藥劑聯合使用的NRG突變體可以根據傳統藥物治療混合技術作為活性成分與諸如β-環糊精和2-羥基-丙基-β-環糊精的藥物治療載體或賦形劑形成緊密添加混合物。載體根據期望使用方式，局部或注射用藥，採取多種配製形式。在製備用於注射劑的組合物時，例如靜脈注射或靜脈灌輸，相同的製藥介質可以使用，水、乙二醇、油、緩衝液、糖、防腐劑、脂質體和其他具有本技術領域技能的人所知的介質。注射組合物的實例包括，但不限於，5％w/v的葡萄糖、正常生理鹽溶液或其他溶液。待給藥的NRG突變體總劑量可以在一小瓶含有體積從1毫升到2000毫升的靜脈內液體中使用。根據所用總劑量，稀釋液體體積將有所變化。
實施例 篩選特異性激活ErbB受體的NRG突變體1.方法NRG-1β的EGF樣域能結合併激活受體執行生物功能。在本研究中，為了簡化模型，配體選擇NRG-1β的EGF樣域(NRG-β177-229，殘基1-52)，下面簡稱其為NRG-1β。由於目前缺乏NRG-1β和受體ErbB的三維結構信息，因此有必要用理論預測方法構建出它們的蛋白質三維結構，從而在微觀上研究其配體/受體相互作用。另外，目前為止，在理論生物學研究上運用同源模建、分子動力學模擬和自由能計算在原子水平上研究蛋白質/小分子配體或者蛋白質/蛋白質相互作用已經有很多成功的例子12-17。同源蛋白模建方法在預測蛋白和模板蛋白序列同源性高於30％時可準確地構建預測蛋白的三維結構，而分子動力學方法可用於模擬蛋白質/小分子配體或者蛋白質/蛋白質在溶液中的構象變化15。而且，近年來，一種新的理論研究方法-MM/PBSA(the Molecular Mechanics Poisson Boltzmann Surface Area)，由於其同時兼有快速的計算和準確的結果兩大優點引起了眾多計算生物學家的注意並在研究中得到廣泛的應用18-21。這種方法結合了用於連續溶液方法計算溶劑的分子力學能量和正則模式分析估計整個體系的自由能，它通過計算各個終態的自由能而無需考慮模擬中間狀態，從而極大地減小了計算量。眾所周知，丙氨酸掃描實驗可以研究實驗上配體與受體作用界面上殘基對複合物中配體與受體親合性的貢獻。而基於MM/PBSA方法，丙氨酸掃描理論計算方法可以從理論預測突變點殘基對配體/受體結合的貢獻，這種方法已經被應用於研究工作並取得了極大的成功21，22。
由於ErbB家族胞外區具有很高的序列同源性，如表3.1。因此，在本章的研究中，NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4複合物三維結構的構建是以EGF/EGFR複合物晶體結構(PDB號1ivo)23和NRG-1α的NMR結構(EGF樣域，PDB號1haf)24作為模板結構。MM/PBSA方法用來分別估算NRG-1β與ErbB3或ErbB4的結合自由能。另外，丙氨酸理論掃描計算方法用來研究NRG-1β每一個殘基突變成丙氨酸後對NRG-1β與受體親合性變化情況。從而建立一個關於NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的理論模型，為下一步設計增加NRG-1β對ErbB4選擇性結合的研究提供有意義的指導。
表3.1 ErbB家族間胞外區序列同源性比較圖

3.3結果和討論3.3.1 ErbB3和ErbB4與NRG-1β三維結構的構建和評估3.3.1.1 ErbB3和ErbB4三維結構的構建通過Fasta和Blast搜索到與ErbB3或ErbB4序列同源性較高的蛋白結構主要有ErbB家族中無配體的ErbB3晶體結構(pdb號1m6b)25、未激活的EGF/EGFR晶體結構(pdb號1nql)26以及人類表皮生長因子及其受體胞外區(EGF/EGFR)X射線晶體結構(PDB號1ivo)23。雖然ErbB家族中無配體的ErbB3晶體結構具有與ErbB3完全一致的序列，但是，經配體活化後的含配體的ErbB3具有與之完全不同的構象。而在本章我們研究ErbB3或ErbB4與其配體NRG-1β間的相互作用，因此，綜合上面因素，我們選取了EGF/EGFR的X射線晶體結構(PDB號1ivo)23作為ErbB3和ErbB4模板結構。ErbB3、ErbB4和EGF的序列取自於Swiss-Prot/TrEMBL資料庫。
在ErbB家族中，它的胞外區結構分為四個結構域(I-IV)。其中結構域II和結構域IV是半胱氨酸區，分別含有24和21個Cys27。由於在EGFR的晶體結構，由殘基513-619的結構域IV是一個無序的結構。因此，在我們進行同源模建結構時不包含這個區域。所有的序列聯配都是用InsightII的Homology模塊分別對ErbB3和EGFR、ErbB4和EGFR與NRG-1β(NRG-β177-229)和NRG-1α序列聯配後產生。具體參數為Gap Penalty為6；Gaplength Penalty為1.65。NRG-1β以NRG-1α的NMR結構為模板結構，而ErbB3和ErbB4以上述的EGFR晶體結構為模板結構。所有在模板結構中存在缺失原子的殘基均用Sybyl的Biopolymer補齊其缺失的原子。在模板結構EGFR中幾個與配體EGF殘基存在疏水作用的關鍵殘基Leu69、Leu98、Val350、Asp355和Phe357在ErbB3和ErbB4中均設定為保守殘基23，27；另外，構成EGFR中甘氨酸堆積的殘基(結構域I的39、63、85和122位及結構III中的343、379、404和435位)在ErbB3和ErbB4中也設定為保守殘基；最後，在所有的模板中，構成二硫鍵的Cys設定成保守殘基。最終的NRG-1β和NRG-1α的序列聯配結果如圖1、ErbB3和EGFR及ErbB4和EGFR聯配結果如圖2(A)和(B)。如圖2，ErbB3的序列(殘基8-511)、ErbB4的序列(殘基25-533)與晶體結構EGFR(殘基3-512)的序列同源性分別為44％和48％，而兩者的序列相似性則高達約80％。構建好後ErbB3、ErbB4結構與EGFR模板結構的RMSD分別為0.55和0.39，如圖3(B)、(C)所示。
3.3.1.2 NRG-1β三維結構的構建NRG-1β(NRG-β177-229，下文將其序號從1開始)以NRG-1α的NMR結構(EGF樣域，PDB號1haf)24為模板結構。NRG-1β、NRG-1α的序列取自於Swiss-Prot/TrEMBL資料庫，它們間的序列同源性高達80％，如圖1。由於NRG-1α的NMR結構中C末端(殘基51-63)是一個柔性大的無序結構，而有研究表明28，NRG-1β的殘基1至50就已能維持與受體結合併激活受體的正常生物功能。因此，在本章的研究中，我們選取了NRG-1β的剪切體(殘基1-52)作為研究模型。從結構上看，它的N末端包括三條β摺疊和一個α螺旋區以及C末端上有一個短的β摺疊。同時，整個結構通過形成六個Cys形成三對二硫鍵(Cys6-Cys20、Cys14-Cys34和Cys36-Cys45)。
3.3.1.3 NRG-1β/ErbB複合物三維結構的構建在NRG-1β、ErbB3和ErbB4最初的模型分別建立後，重要的一步是NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4複合物結構的構建。由於缺乏NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4複合物結構信息，因此，這兩個複合物結構的構建以EGF/EGFR晶體結構為模板。從三維結構上看，NRG-1α的EGF樣結構域與EGF/EGFR複合物中配體EGF的結構非常的相似，因而在我們研究NRG-1β結構與EGF結構極其相似，RMSD為1.3，如圖3(A)。因此，複合物結構的構建是將NRG-1β結構重疊入EGF/EGFR中EGF結構的位置，也即位於ErbB3或ErbB4的結構域I和結構域III之間，這與實驗報導29認為NRG-1β與ErbB3發生作用的位點位於結構域I和III的結果相一致。同時，定點突變實驗表明NRG-1β的N末端和C末端區域對於配體與受體的結合是極其重要的28。由於這兩個區域在結構上相互距離很遠，也即NRG-1β/ErbB之間的作用是多個區域聯合作用的，這與同源模建得到的複合物結構結果是一致的。雖然NRG-1β結構與EGF結構非常相似，但它們結構上一個環區(NRG-1β中是殘基21-33、EGF中是殘基21-30)存在較大差別。但是，有實驗證明當NRG-1β上的殘基21-33被EGF上的殘基21-30代替對它的配體/受體結合能力及激活受體磷酸化能力沒有任何影響28。綜上所述，NRG-1β與EGF結構上伸出的環區結構的不同對於構建複合物結構並不影響配體/受體的作用。因此，我們分別構建了NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的複合物結構。
3.3.1.4 ErbB3、ErbB4、NRG-1β及其複合物三維結構的評估同源模建方法建立的結構必須經過一些方法對其結構進行檢驗以證明其結構的可靠性。所有的結構均經PROCHECK和Profiles-3D程序檢驗理論模建所得結構的立體化學及蛋白質結構的正確性。
(1)Profiles-3D相容性評估在Profiles-3D的結構評估中，它對蛋白質中每一個殘基進行相容性打分的測試。結果為表3.2。最後可以看出Profiles-3D評估得到了較好的結果。從表中可以看出，我們建立的這些結構的蛋白的相容性得分是相當高的，這說明了這些結構在溶液環境中相容性是很好的。
表3.2 ErbB3和ErbB4結構的Profiles-3D的結構評估結果表

PROCHECK立體化學評估表3.3 NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4三維結構PROCHECK Ramachandran表

由於複合物結構是我們最終需要的結構，在這裡我們僅對複合物結構進行評估，PROCHECK評估結果列於表3.3和圖(A)和(B)。PROCHECK主要通過Ramachandran圖分析蛋白質結構的立方化學性質(如主鏈的Φ和Ψ角度)的合理性，以及通過將蛋白質劃分成「有利區域」、「附加的可接受區域」、「一般情況下可接受區域」和「不利區域」四種區域，然後通過統計蛋白質中除甘氨酸和脯氨酸外殘基位於不同區域的百分數以描述蛋白質結構的優劣。從結果上看，對於NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4複合物結構來說，位於「有利區域」和「可接受區域「的殘基百數分別佔96.2％和97.5％。而G因子，NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB的分別為-0.23和-0.18。對G因子來說，一般認為高於-0.5，蛋白質結構的立體化學性質是相當合理的。同時，從鍵長分析上看，100％的鍵長均符合正常範圍；從鍵角分析上看，對NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4這一數字分別為97.7％和97.9％；從二面角分析上看，對NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4這一數字分別為94.1％和93.4％。通過立體化學驗證，說明我們所建立的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4結構是相當合理的。
綜上所述，通過Profiles-3D相容性評估和PROCHECK立體化學評估，我們建立的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4結構具有相當的準確性，它不僅在蛋白質結構上是合理的，而且它能初步反映一些實驗信息，是基於知識的結構模建的結果，可以為我們下一步的分子動力學模擬和自由能計算提供一個良好的起點。
3.3.2、分子動力學模擬在理論構建出複合物結構基礎上，我們通過Sybyl6.8軟體包用Amber力場進行能量最小化以優化結構。優化策略如下先優化蛋白質結構的H原子，固定其它所有原子；接著優化所有的側鏈原子，固定主鏈原子；再接著固定保守區原子，優化結構變異區原子；最後，優化所有原子至收斂。能量最小化過程中用到的參數如下Kollman-united-atom力場，非鍵cutoff為9.5A，介電常數為4.0，最後優化的模型用以做分子動力學模擬的初始點。
3.3.2.1分子動力學模擬方法及策略為了考察蛋白的構象變化以及配體與受體作用時的動態信息，我們採取了分子動力學方法來進行研究。分子動力學是在分子力學的基礎上發展起來的，它採用牛頓第二運動方程來描述原子核的運動，所有電子的運動以及電子運動對核運動的影響都被忽略。整個分子動力學的計算流程如下●確定體系所有粒子的初始坐標

和

這裡

通常都是按照體系的初始溫度根據波爾茲曼分布賦值。
●採用特定的力場參數和能量評價函數從

得到體系的勢函數，由此計算每個粒子上的

再根據牛頓運動方程計算每個粒子的加速度

●運用牛頓第一運動方程由

積分計算

●用

作為輸入，計算再下一步的

不斷重複上述2-4步驟。
在我們的模擬中，採用AMBER7.0分子動力學程序，全部蛋白質複合物的分子動力學模擬均通過AMBER7.0軟體包及Parm99力場模擬。模擬中用TIP3P水來模擬蛋白質溶液環境；與氫原子相連的鍵都採用了SHAKE算法進行了限制；整個複合物結構外包10A的水，以保證複合物中任一原子離模擬系統盒子的邊界至少10A；對於帶電體系，加入適量的離子以中和整個體系；PME方法用以計算長程靜電相互作用。所有的動力學模擬均基於下列同樣的方法首先，所有複合物原子先用最陡下降法進行200步的優化，然後接著用共軛梯度法優化，以達到最後對整個複合物—水體系優化500步。對於兩個複合物體系的總原子數及其盒子的大小列表3.4中。
表3.4分子動力學模擬中體系的條件的描述

優化後的結構用以分子動力學模擬。整個體系分三個階段在150ps從0K逐步升溫300K，然後在300K平衡25ps，然後再進行數據採集，總的模擬過程對於NRG-1β/ErbB3進行了1100ps，對NRG-1β/ErbB4/進行了900ps。對於非鍵的cutoff設定為8A，非鍵相互作用設定為每25步更新一次。SHAKE方法用以限制包括H原子內的共價鍵原子。每個模擬都應用Berendsen算法在300K和1.0個大氣壓下進行。對於溫度浴和壓力浴參數分別設定為0.2ps和0.05ps。進行分子動力學模擬的每一個步長定為2fs。在能量最小化和分子動力學模擬過程中，在各個方向上用周期性的邊界條件。每個蛋白質的分子動力學的初始位置(t＝0ps)用以作研究模擬體系的穩定性及可能的結構漲落的Cα的RMSD的基準點。所有的模擬都在中國科學院上海藥物研究所藥物發現與設計中心的SGI3800和SGI3200上完成。
3.3.2.2分子動力學模擬結果和討論對於分子動力學模擬後蛋白質結構的RMSD，見圖5。在圖中可以明顯看到在軌跡的前100ps RMSD很快的上升，然後傾向於平衡。這些RMSD曲線的變化幅度，在數據收集階段並沒有太大變化，這表明這兩個體系已經趨向於平衡。在NRG-1β/ErbB4體系中，經過前400ps的平衡後，它的平均RMSD約為2.6；而在NRG-1β/ErbB3體系中，這一數值為3.7。同時，對RMSF的分析表明，一方面，RMSD變化比較大的主要在末端及遠離配體/受體作用位的結構域II，而配體/受體作用位點的變化比較小；另一方面，同RMSD變化的趨勢相同，NRG-1β/ErbB3體系的RMSF的變化要大於NRG-1β/ErbB4體系。從分子動力學運動軌跡中各殘基變化的幅度可以看出，在NRG-1β/ErbB3體系(殘基243-256)和NRG-1β/ErbB4體系(殘基265-278)構象變化的幅度較大。從無配體的ErbB3晶體結構上看，這些殘基是結構域II中伸展開來20個A的β髮夾式結構的一部分。在EGFR家族中，這個β髮夾式結構是高度保守，不僅起著連接結構域II和結構域IV的作用，而且在受體/受體相互作用中起著重要作用23，25，26。由於我們選擇經過剪切的配體受體1∶1作為我們的複合物模型RMSF，這個模型缺乏受體/受體相互作用導致缺乏結構域II和結構域IV的相互作用，因而在我們的模擬模型中，這個區域的RMSF比較大些。但是，整個結構的分析表明，我們的模型在分子動力學模擬過程中，結構上並沒有很顯著的變化，仍然保持一個比較穩定的結構。計算的步長為1ps。對於分子動力學模擬後配體與受體的相互作用用LIGPLOT程序來描述。
四、配體-受體相互作用在我們研究的NRG-1β/ErbB這兩個體系中，它們和EGF/EGFR類似，它們的配體/受體相互作用主要在三個位點存在(如圖6)。其中，NRG-1β的殘基20-35和Leu3與受體相互作用主要發生在受體結構域I的位點1；而NRG-1β的殘基10-19和Arg44與受體相互作用主要發生在受體結構域III的位點2；最後，NRG-1β在Tyr48後的C-末端殘基與受體相互作用主要發生在受體結構域III的位點3。NRG-1β的這些殘基通過各種各樣的靜電、疏水和氫鍵相互作用與受體結合。
在配體/受體相互作用的氫鍵作用分析中，我們主要列出了ErbB3/NRG-1β和ErbB4/NRG-1β配體受體間側鏈形成的氫鍵。這些氫鍵主要列於表3.5。從表上可以看出，無論哪一個體系，NRG-1β上的Arg44和Tyr48(Arg41和Arg45在EGF中)都與受體有很強的氫鍵相互作用23，30。在氫鍵分析中可以看出，NRG-1β的Arg44分別與ErbB3的Asp352和ErbB4的Asp376形成鹽橋。因此，如果將Arg44突變成Ala的話，將導致NRG-1β與ErbB3或ErbB4的結合活性顯著下降。
NRG-1β的Arg44與ErbB3的Asp352的側鏈存在氫鍵作用；而Tyr48則與Asn379的側鏈存在氫鍵作用。而從圖8來看，NRG-1β的Arg44與ErbB4的Asp376的側鏈存在氫鍵作用；而Tyr48則與Asn403的側鏈存在氫鍵作用。
除了氫鍵，如表3.5A，在配體NRG-1β和受體ErbB3或ErbB4的位點1、2和3中存在著廣泛的疏水相互作用。
在ErbB3/NRG-1β複合物中，在位點1，ErbB3的Val47、Leu48、Met72、和Leu102的側鏈原子和NRG-1β的Leu3、Val23、和Leu33存在較強的疏水作用(如圖7A)。如圖7B，在位點2中，ErbB3的結構域III的Trp354和NRG-1β的Phe13和Tyr32形成疏水作用。進一步，NRG-1β的Arg44的長且非極性的的側鏈也與Trp354的側鏈也有一定疏水作用。在位點3中，如圖7C，ErbB3的結構域III的Tyr405，Phe409和Ile413與NRG-1β的Tyr48周圍的殘基形成一個大的疏水腔。
在ErbB4/NRG-1β複合物中可看到相似的疏水作用，作為這些疏水作用的結果，在ErbB4/NRG-1β的界面中形成了三個疏水腔。在圖8A中，NRG-1β的Leu3，Val23和leu33的側鏈與ErbB4的結構域I的位點1的Leu36，Leu91和Leu121的側鏈構成第一個疏水腔。在圖8B、8C中，NRG-1β的Phe13，Val15和Tyr48周圍的殘基分別於ErbB4的結構域III的位點2、位點3分別以相似的作用形成了另兩個疏水腔。所有這些通過這兩個模型的而得到的相互作用均與對NRG-1β和ErbB3及ErbB4的定點突變實驗相吻合30，31。
表3.5配體NRG-1β和受體ErbB的氫鍵和疏水作用列表(A)NRG-1β/ErbB在整個分子動力學模型過程中的氫鍵列表(圖中黑體部分為NRG-1β形成氫鍵的殘基，僅列出NRG-1β通過側鏈形成氫鍵的殘基；平均距離為整個動力學過程所有結構該氫鍵的平均距離(B)配體NRG-1β和受體的疏水作用列表

(B)配體NRG-1β和受體的疏水作用列表

3.3.3 NRG-1β與受體ErbB的MM-PBSA自由能計算3.3.3.1方法MM-PBSA是一個新發展起來的自由能計算方法，MM-PBSA/GBSA即用MM(Molecular Mechanics)，分子力學的方法計算配體和受體之間的靜電和範德華相互作用能，用PB(Poisson-Boltzman)，泊松玻爾茲曼方程或GB(General Born)，波恩方程求溶劑化自由能的靜電作用貢獻32，33，用SA(solvent-accessibility surface areas)和疏水自由能之間的經驗關係求溶劑化自由能中的疏水作用貢獻34，35，從而得到配體和受體的結合自由能，如式1、2。
ΔGbind＝Emm+ΔGPB+ΔGNP-TS (1)ΔGbind＝ΔGcomplex-[ΔGreceptor+ΔGligand] (2)許多研究都表明MM-PBSA法可以有效地計算分子間的結合自由能，利用諧振子模型估算熵的條件下也可以較好地給出分子的絕對結合自由能。但是需要指出的是在對熵的估算還是非常粗略的。雖然這些近似的方法不如自由能微擾法那麼嚴格，但是它們可以快速的大量地對分子的結合自由能進行排序和估算，大大加速藥物分子的設計和發現過程。
在NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4研究體系中，我們採用的策略具體如下首先，從分子動力學運動軌跡中每4ps取一個結構(snapshot)，總計從平衡後的400ps中取100個結構；然後，運用AMBER7.0的MM-PBSA模塊中的delphi程序計算自由能。蛋白質的每一個結構通過上面方法取出後，然後計算出每一個複合物和受體、配體的自由能差值。由於在我們研究中，NRG-1β的突變體和野生型的NRG-1β的差別只有一個殘基，因此，我們假設熵的影響對於不同NRG-1β突變體是相差很小的。從以前Massova和Kollman的計算人類p53的一個12肽和它的突變體的TΔS結果表明，這種假設是可行的36。因此，在下列的研究中，我們用不含TΔS的ΔG來估計不同NRG-1β突變體和ErbB3及ErbB4的結合能力的不同。因此，我們對NRG-1β的52個殘基(除了N末端的Ser1、所有的Gly和保持蛋白質結構的形成二硫鍵的Cys)用MM-PBSA方法研究其每個殘基對NRG-1β與受體的結合能力的貢獻。
3.3.3.2結果與討論3.3.3.2.1配體/受體結合位點附近MM-PBSA自由能計算表3.6分別列出了結合界面附近殘基突變後NRG-1β與ErbB3和ErbB4的結合自由能的各能量項。表3.7列出了運用丙氨酸掃描的計算方法計算NRG-1β中約所有除Gly、Cys、Ala和Pro外共38個殘基的突變分別對NRG-1β與ErbB3和ErbB4結合的影響。ΔΔGsubtotal值越負代表該取代會導致配體和受體的結合更弱。另一方面，也就是說ΔΔGsubtotal為正值的代表將該殘基突變成Ala後NRG-1β突變體與受體的結合將增強。同時，圖10也描述了運用丙氨酸掃描的計算方法對這兩個體系的研究結果。從表3.7和圖10可以看出，NRG-1β的幾個位置的突變同時極大地減少了它與ErbB3或ErbB4的結合能力，尤其是在44、48和50位的突變。從圖7A和表3.5A上可知，NRG-1β的Arg44與ErbB3的Asp352的側鏈存在氫鍵作用；而Tyr48則與Asn379的側鏈存在氫鍵作用。而從圖8B和表3.5A來看，NRG-1β的Arg44與ErbB4的Asp376的側鏈存在氫鍵作用；而Tyr48則與Asn403的側鏈存在氫鍵作用。同時從ΔΔEele項可以看出，NRG-1β的Arg44和Tyr48結合能中主要成分來自於靜電相互作用，因此，當這兩個殘基被非極性的Ala取代時，其NRG-1β突變體與受體結合的能力被嚴重削弱了。另外，從ΔΔEvdw上和表3.5B可以看出，Tyr48和Met50突變後結合能力降低的原因可能是範德華作用的急劇減小。同時，配體和受體的疏水相互作用包含了這些基團，這些結果和實驗上的定點突變結果相當的一致30。理論預測的結果的可信性不僅驗證了同源建模構建的蛋白質結構的可靠性，而且它為從原子水平上提供了更多實驗上無法得到結構信息。從上述結果上看，Arg44、Tyr48和Met50的Ala的突變對配體和受體的結合是不利的。
前面生物背景部分講到，NRG-1β通過與ErbB4的結合可以加強成人心肌細胞中的肌原組織、顯著地提高或者保護心肌、避免心肌進一步惡化。因此，這些能提高NRG-1β與ErbB4結合的選擇性的突變具有更大的意義。從表3.7和圖10並結合實驗信息30可以看出，屬於這類的NRG-1β突變主要在31、47位的突變。從表3.5A上可知，NRG-1β的Arg31的側鏈與ErbB3的Glu131的側鏈存在很強的氫鍵作用；NRG-1β的Asn47的側鏈與ErbB3的Asp343和Tyr405的側鏈存在氫鍵作用。為了從動態上研究分子動力學過程中NRG-1β的Arg31和Asn47的氫鍵，我們對其氫鍵距離隨動力學過程的變化作圖。如圖9A，可以看出，與ErbB3結合時，NRG-1β的Arg31的NH1和NH2分別與Glu131的OE1和OE2形成了一個很強的氫鍵網絡，而這種的氫鍵網絡在NRG-1β與ErbB4結合時並不存在(在與ErbB4結合時，NRG-1β的Arg31對結合的貢獻幾乎可以忽略)。而對NRG-1β的Asn47來說，它的情況與Arg31類似。如圖9B，Asn47的ND2和ErbB3的Asp343的側鏈形成兩根較強的氫鍵，另外它還與Tyr405形成一根較弱的氫鍵；而對它與ErbB4結合時，NRG-1β的Asn47僅參於了部分的疏水作用。因此，當這兩個殘基分別被非極性的A1a取代時，其NRG-1β突變體與受體ErbB3結合的能力被嚴重削弱了，而與受體ErbB4結合能力變化並不大30。
表3.6(A)NRG-1β/ErbB3的MM-PBSAa自由能計算結果例表

(B)NRG-1β/ErbB4的MM-PBSAa自由能計算結果例表

a上述表所列值單位為kcal mol-1；b差值(Delta)＝Contribution(複合物)-Contribution(受體)-Contribution(配體)；c400個結構的平均值(mean)；d平均值的標準偏差(Std)。
表3.7.NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4結合位點附近的MM-PBSA自由能計算結果(ΔΔGsubtotal＝ΔGwildtype-ΔGmutant)

為了進一步研究每一個殘基的Ala突變後對結合能的影響，我們分析了每一個突變後的分子內的範德華作用和靜電相互作用的變化。在MM-PBSA計算結果中，大多數情況下的分子內的靜電能的變化和溶劑化能的變化相反。因此，綜合考慮ΔΔGele和ΔΔGPB是非常重要的。從圖11上看，ΔΔGnonpolar相對於自由能中其它能量項的變化來說幾乎可以忽略不計。自由能中ΔΔEvdw項大多為負，這表明進行Ala定點突變後，它與野生型相比，突變體減小了配體/受體結合界面的範德華作用。另一方面，大多數的殘基進行Ala定點突變對能量項中ΔΔEele和ΔΔGPB之和是增加的，這其中一個例外是Arg44的。在NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的野生型複合物中，由於正電性的NRG-1β的Arg44與負電性的Asp(ErbB3中是Asp352，ErbB4中是Asp376)形成了很強的靜電相互作用。類似的結果在NRG-1β的Arg31被Ala取代後與ErbB3相互作用變化的結果中可以看到，而由於NRG-1β/ErbB4體系的Arg31與受體不存在強的靜電相互作用，因此，在NRG-1β/ErbB4體系則沒有呈現出上述的現象。在NRG-1β/ErbB3中，當NRG-1β的Arg31突變成Ala後，它破壞了原先存在的氫鍵作用。而對於當受體是ErbB4來說，NRG-1β的Arg31與受體並不存在氫鍵相互作用。它的突變體的自由能的變化主要是來自於範德華作用的喪失和ΔΔEele+ΔΔGPB的增加之間的平衡，從無論實驗還是理論結果上看，它的這種突變是有利於NRG-1β和ErbB4間的結合，而極大地削弱了NRG-1β和ErbB3的親合作用30。
3.3.4不同分子動力學軌跡下NRG-1β的R31A和N47A的ΔΔGbinding的比較研究為了評估在Ala突變後，複合物體系構象變化的大小以及它對ΔΔGbinding的影響，我們對NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的Arg31Ala和Asn47Ala都分別進行分子動力學的模擬。所有模擬的方法同上述部分野生型複合物的分子動力學模擬。選這兩個位點的原因主要因為這兩個位點的定點突變對NRG-1β/ErbB4這個體系來說結合能是增強的；而對NRG-1β/ErbB3體系來說結合能是減弱的。這些分子動力學的初始結構取自於同源模建得到的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4結構，只不過這些結構中NRG-1β的Arg31或者Asn47突變成Ala。然後，我們同樣有MM-PBSA方法計算了這幾個突變體的ΔΔGbinding。如表3.8所示，用突變體重新做分子動力學模擬後計算的ΔΔGbinding與前面所計算得到的ΔΔGbinding的結果基本相似。在所有四個例子中，這兩種不同方法得到的ΔΔGbinding能量相差不到1kcal/mol。這說明無論在NRG-1β/ErbB3還是在NRG-1β/ErbB4體系中，單個Ala突變對整個蛋白質的構象影響較小，從而，我們可以用同一套野生型複合物的分子動力學軌跡進行計算的Ala掃描模擬。
表3.8.(A)基於野生型NRG-1β/ErbB3分子動力學軌跡的Arg31Ala和Asn47Ala的MM-PBSA結果與基於Arg31Ala和Asn47Ala後分子動力學軌跡的MM-PBSA結果比較表

(B)基於野生型NRG-1β/ErbB4分子動力學軌跡的Arg31Ala和Asn47Ala的MM-PBSA結果與基於Arg31Ala和Asn47Ala後分子動力學軌跡的MM-PBSA結果比較表

a基於野生型的NRG-1β/ErbB分子動力學軌跡的Arg31Ala和Asn47Ala的MM-PBSA結果b基於Arg31Ala和Asn47Ala分別突變後分子動力學軌跡的MM-PBSA結果3.3.5分子動力學模擬研究NRG-1β/ErbB Pro29Ala選擇性的差異從丙氨酸掃描試驗上看，當NRG-1β的Pro29Ala時，NRG-1β和受體ErbB3親合性減弱了幾倍；而NRG-1β和ErbB4的親合性則得到了極大的增強。眾所周知，Pro常位於蛋白質的拐角處，起著維持蛋白質結構穩定的作用。一方面，如果Pro突變成Ala後其蛋白質的結構可能發生大的變化；另一方面，由於我們上述所用的MM-PBSA方法不適用於直接將Pro突變成Ala後預測其自由能變化。因此，為了考察在Pro突變成Ala後，複合物體系結構變化的大小以及這種結構變化導致NRG-1β和不同受體結合能力的變化的原因，我們對NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的Pro29Ala分別進行分子動力學模擬。所有模擬方法同上述分子動力學模擬部分策略一致，只不過為了能更詳盡的研究這種結構上的變化，這部分研究的分子動力學模擬時間均為2ns。模擬的初始結構取自於同源模建得到的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4結構，只不過這些結構中NRG-1β的Pro29突變成Ala。然後，我們同樣用MM-PBSA方法計算了它們的ΔGsubtotal，並用Nmode方法預測了熵變，從而得到了總的ΔGbinding。
3.3.5.1分子動力學模擬結果和討論對於分子動力學模擬後蛋白質結構的RMSD，見圖12(A)。在圖中可以明顯看到在軌跡的前100ps RMSD很快的上升，然後傾向於平衡。這些RMSD曲線的變化幅度，在數據收集階段並沒有太大變化，這表明這兩個體系已經趨向於平衡。在NRG-1β/ErbB4體系中，經過前400ps的平衡後，它的平均RMSD約為3.1；而在NRG-1β/ErbB3體系中，這一數值為3.0。同時，對RMSF的分析表明(如圖12(B)，RMSD變化比較大的主要在末端及遠離配體/受體作用位的結構域II；但是，與野生型的NRG-1β/ErbB體系的分子動力學模擬的RMSF(如圖5B)不同，它的配體結構的變化還是比較明顯的(在ErbB3中，配體是殘基469-520；在ErbB4中，配體是殘基474-525)。另一方面，從分子動力學運動軌跡中NRG-1β各殘基變化的幅度可以看出，無論NRG-1β/ErbB3還是NRG-1β/ErbB4體系，它們的構象變化的幅度較大。而且，這種變化趨勢與RMSD變化的趨勢相同，NRG-1β/ErbB4體系的中配體的RMSF的變化要大於NRG-1β/ErbB3體系。同時，對於突變的Pro29位附近的NRG-1β殘基的RMSF明顯比其它區域要大(兩個末端除外)。
3.3.5.2配體受體相互作用在對配體/受體相互作用的氫鍵作用分析中，我們主要列出了ErbB3/NRG-1β和ErbB4/NRG-1β配體側鏈與受體形成的氫鍵。這些氫鍵主要列於表3.9中。從表上可以看出，無論哪一個體系，NRG-1β上的Asp25、Ser27、Arg31、Arg44和Tyr48都與受體有很強的氫鍵相互作用。同時，與野生型的NRG-1β/ErbB體系相同，NRG-1β的Arg44分別與ErbB3的Asp352和ErbB4的Asp376形成鹽橋。這說明，Arg44在NRG-1β/ErbB體系是相當保守的。因此，如果將突變體NRG-1β的Arg44突變成Ala的話，將也可能導致NRG-1β與ErbB3或ErbB4的結合活性顯著下降。
與野生型的NRG-1β/ErbB3體系相比，突變體NRG-1β與受體ErbB3結合在N末端得到加強。它新增了Asn16、Asp25和Ser27與受體形成氫鍵。但是，在原本形成很強的氫鍵的C末端，它的結合被嚴重削弱了。突變體NRG-1β與受體ErbB3結合在C末端的氫鍵少了Asn47與Asp343、Asn47與Tyr405和Asn38與Asn25的氫鍵。而Tyr48與Asn379的氫鍵雖然維持，但是其數目由它們的側鏈原子互相作氫鍵受體供體形成的兩根氫鍵(％occupied數分別為78.45和72.36)減至Tyr48的OH與Asn379的ND2一根氫鍵(％ occupied數降至61.65)。另外，原本在野生型NRG-1β/ErbB3體系中存在的Tyr48與ErbB3的Tyr405氫鍵則消失了。雖然突變體NRG-1β的Arg44仍與ErbB3的Asp352的側鏈存在氫鍵作用，但是，它只形成了三根氫鍵，而不象野生型NRG-1β的Arg44的NH1和NH2與ErbB3的Asp352的OD1和OD2形成一個氫鍵網絡，它的氫鍵的強度顯然減弱了。對NRG-1β的Arg31來說，突變後變化情況與Arg44類似；並且，它們的氫鍵％ occupied數從近100降至只有60左右。因此，綜合考慮，由於NRG-1β的Pro29Ala後，它與受體ErbB3的結合構象發生了一些變化，雖然在N末端(靠近結構域I部分)可能結合更緊密了，但是原來形成很強的氫鍵網絡的C末端則被削弱得更多。因此，從定性上可以認為當NRG-1β的Pro29Ala，其整體結合可能會減弱，這與丙氨酸掃描實驗中NRG-1β的Pro29Ala時它與受體的結合減弱了幾倍是一致的30。
而突變體NRG-1β和ErbB4的結合恰恰相反，從分子動力學模擬結果上看，NRG-1β的Pro29Ala的氫鍵網絡得到了加強。首先，在C末端，雖然Tyr48與受體形成的氫鍵消失了，但是，Arg44和Asp376形成的鹽橋得到了極大的加強。而且，它們的氫鍵％ occupied數從80左右上升至約100％。同樣，Glu39和Lys438不僅形成的氫鍵％ occupied數上升了，而且，它的形成的氫鍵的數目也增加了。特別是，由於突變後蛋白質結構的變化，在NRG-1β和受體ErbB3結合中起著重要貢獻而對NRG-1β和受體ErbB4結合沒有特別大影響的Arg31也參與了NRG-1β和受體ErbB4的結合，而且，它形成了三根很強的氫鍵。而在原來形成氫鍵並不多的N端，NRG-1β的Asp25、Ser27與受體結合的氫鍵數不僅增加了，而且氫鍵％ occupied數也上升至近90％。由於氫鍵作用在維繫蛋白質/蛋白質相互作用中起著關鍵的作用，因此，由於NRG-1β的Pro29Ala後，配體與受體ErbB4結合的構象尤其是側鏈的構象發生變化，導致NRG-1β與ErbB4結合時，無論與受體的結構域I還是結構域III的氫鍵網絡得到了極大的加強，因此，這也從定性上與丙氨酸掃描實驗中NRG-1β的Pro29Ala時它與受體的結合能力得到了很大的提高這一實驗事實相符的。
除了氫鍵，和野生型的NRG-1β和受體ErbB存在的疏水作用相似，見表3.10，在突變體NRG-1β和受體ErbB3或ErbB4的位點1、2和3中存在著廣泛的疏水相互作用。
在突變體ErbB3/NRG-1β複合物中，在位點1，ErbB3的Asn25、Met72、Leu102和Tyr104的側鏈原子和NRG-1β的His2、Val23、和Asn38存在較強的疏水作用。在位點2中，ErbB3的結構域III的Trp354和NRG-1β的Phe13形成疏水作用；而且，NRG-1β的Arg44的長且非極性的的側鏈也與Trp354的側鏈也有一定疏水作用。在位點3中，如圖8C，ErbB3的結構域III的Gln381、Lys415、Tyr436以及稍遠一點(距離4左右)的Tyr405和，Phe409與NRG-1β的Phe40和Tyr48周圍的殘基形成一個大的疏水腔。
在突變體ErbB4/NRG-1β複合物中也可以看到相似的疏水作用，作為這些疏水作用的結果，在ErbB4/NRG-1β的界面中形成了三個疏水腔。NRG-1β的Leu26、Pro37、Glu39和Asp43的側鏈與ErbB4的結構域I的位點1的Glu33、Lys35、Leu39、Ser40、Ala48、Tyr52、Phe120、Leu121和Gln151的側鏈構成第一個疏水腔。NRG-1β的Val15、Arg44和Tyr48周圍的殘基分別於ErbB4的結構域III的位點2、位點3分別以相似的作用形成了另兩個疏水腔。
綜合NRG-1β/ErbB的Pro29Ala氫鍵和疏水作用分析，可以看出無論野生型還是突變體、無論受體是ErbB3還是ErbB4，配體/受體間存在著廣泛的疏水相互作用，並沒因為突變後有太大的變化。但是，在氫鍵方面，NRG-1β/ErbB3突變體的氫鍵強度有了少許減弱；而NRG-1β/ErbB4突變體不僅氫鍵強度得到了加強，而且它所形成的氫鍵數目也增加了，這可能正是實驗上NRG-1β的Pro29/Ala後，NRG-1β呈現出與ErbB3和ErbB4結合能力變化不同的根本原因。
表3.9 NRG-1β/ErbB的Pro29/Ala和野生型複合物的氫鍵在整個分子動力學模型過程中比較(圖中黑體部分為NRG-1β形成氫鍵的殘基，這邊僅列出NRG-1β通過側鏈形成氫鍵的殘基；表中％ occupied為分子動力學模擬過程中可能有氫鍵作用結構數佔總結構數的百分數)

表3.10 NRG-1β/ErbB的Pro29/Ala的疏水相互作用ligplot表(所有結構取自分子動力學平衡過程的平均結構，平衡結構以從400ps後開始計算)

3.3.5.3配體受體結合自由能為了從結合自由能角度研究NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4體系中突變後，NRG-1β/ErbB的Pro29Ala和野生型複合物結合能力的變化，我們結合MM-PBSA和Nmode方法估計野生型和突變體的結合自由能。具體策略如下首先，用MM-PBSA方法得到Gsubtotal，具體計算部分策略與前面所述策略一致。其次，用諧振子的正則分析Nmode計算蛋白質的熵效應TΔS部分，由於Nmode通過一階和二階導數進行簡正模式分析，用於尋找局域最小值，進行振動分析，需要相當多的計算資源，因此，只從MM-PBSA方法所取的100個結構中取出10個結構。由於，NMODE方法只能用於估算不到200個殘基的蛋白。因此，我們在進行NMODE計算中切除了遠離突變點Pro29的受體的結構域II和結構域III，從而估算出野生型複合物和突變體複合物的自由能，具體結果列於表3.13。
在NRG-1β/ErbB3方面(表3.11A)，與野生型複合物相比，突變體複合物的Evdw與之相差無幾(野生型中是-144.02，突變體中是-148.71)，這與前面所做的疏水相互作用分析中是一致的。雖然，與野生型複合物相比，體系的靜電作用的增加被體系的溶劑化能的減少給抵消了。另外，從熵效應上看，突變體的熵效應尤其是配體部分明顯大於野生型複合物的熵效應，這與前面RMSF分析中，突變體的配體原子構象的變化明顯大於野生型是一致的。而且，受體部分的熵變對野生型還是突變體的熵變效應變化並不太大，這說明NRG-1β/ErbB3的Pro29/Ala突變後主要是配體結構發生變化，導致了配體/受體結合能力的變化。從最後的結合自由能看，兩者相差無幾，這與實驗中突變體的NRG-1β與ErbB3的結合能力是野生型的NRG-1β的80％的實驗基本相符的30。
在NRG-1β/ErbB4方面(表3.11B)，與野生型複合物相比，突變體複合物的Evdw和NRG-1β/ErbB3情況大致相同(野生型中是-139.35，突變體中是-144.99)，但是，體系的靜電作用大幅度增加(這與氫鍵分析中突變體複合物氫鍵強度和數量都增加相符)，雖然體系的溶劑化能的減少和熵效應抵消了對體系總結合自由能的貢獻，但是，從最後的結果上看，突變體NRG-1β與ErbB4的結合自由能還是增加了2.73kcal/mol，這與實驗上NRG-1β的Pro29Ala與ErbB4的結合是野生型NRG-1β與ErbB4約10倍是基本一致的。
表3.11 (A)NRG-1β/ErbB3的Pro29/Ala的MM-PBSAa及Nmode自由能計算結果表

(B)NRG-1β/ErbB4的Pro29/Ala的MM-PBSAa及Nmode自由能計算結果表

備註a上述表所列值單位為kcal mol-1；b差值(Delta)＝Contribution(複合物)-Contribution(受體)-Contribution(配體)；c400個結構的平均值(mean)；d平均值的標準偏差(Std)。eNmode計算熵效應，Nmode方法只取與MMPBSA計算方法同-套分子動力學運動軌跡的10個結構(即每40ps一個結構)，圖中黑斜體部分為同樣方法計算野生型NRG-1β/ErbB的熵值後體系的自由能。ΔGbinding＝Gsubtotal-TΔS(T＝298.15K)
序列表110上海澤生科技開發有限公司120
130
140
1412004-7-2150
151
1602170FastSEQ for Windows Version 4.02101211183212DNA213智人(Homo sapiens)4001agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc 60ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt 120actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac 180cag210221161212PRT(SEQ ID NO.1)213智人(Homo sapiens)4002Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val5 10 15Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser20 25 30Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys35 40 45Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln50 55 60
權利要求
1.篩選特異性激活ErbB3受體的NRG突變體的方法，該方法包括a)用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4複合物的三維結構b)分子動力學模擬NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的構象變化和穩定性c)MM/PBSA方法計算NRG與ErbB3或ErbB4的結合自由能d)丙氨酸理論掃描計算方法確定NRG殘基突變成丙氨酸後對NRG與受體親合性變化e)計算ΔΔGsubtotal＝ΔGwildtype-ΔGmutantf)根據步驟e)計算結果中NRG/ErbB3的ΔΔGsubtotal為正值，NRG/ErbB4的ΔΔGsubtotal為負值的位點殘基突變成Ala後特異性激活ErbB3受體的NRG突變體。
2.權力要求1所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點25突變成丙氨酸的胺基酸序列。
3.權力要求1所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點35突變成丙氨酸的胺基酸序列。
4.權力要求1所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ ID NO1的胺基酸殘基位點46突變成丙氨酸的胺基酸序列。
5.權力要求1所述的方法篩選的NRG突變體在製備特異性激活ErbB2/ErbB3受體藥物的應用。
6.權力要求5所述的應用，其中NRG突變體通過激活哺乳動物ErbB2/ErbB3受體，從而治療、預防或延緩哺乳動物疾病。
7.根據權力要求6所述的應用，其中所述哺乳動物為人類。
8.根據權力要求6所述的應用，其中所述哺乳動物疾病包括發生在骨、耳、眼睛、眼瞼、頭頸部、心臟、喉、下顎、下顎外側髁、上頜骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、胰腺、腮腺、耳廓、垂體、前列腺視網膜、唾液腺、皮膚、肌肉、脊髓、甲狀腺、扁桃腺、神經系統、呼吸系統、消化系統、循環系統、生殖系統、泌尿系統、內分泌系統、心血管疾病、造血系統的疾病。
9.根據權力要求8所述的應用，其中神經系統疾病包括中樞神經系統疾病、周圍神經系統疾病、脊髓疾病、腦膜疾病、脫髓鞘性疾病、錐體外系統疾病。
10.篩選特異性激活ErbB4受體的NRG突變體的方法，該方法包括a)用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4複合物的三維結構b)分子動力學模擬蛋白質/小分子配體或者蛋白質/蛋白質在溶液中的構象變化和穩定性c)MM/PBSA方法計算NRG與ErbB3或ErbB4的結合自由能d)丙氨酸理論掃描計算方法確定NRG每一個殘基突變成丙氨酸後對NRG與受體親合性變化e)計算ΔΔGsubtotal＝ΔGwildtype-ΔGmutantf)根據步驟e)計算結果中NRG/ErbB4的ΔΔGsubtotal為正值，NRG/ErbB3的ΔΔGsubtotal為負值的位點殘基突變成Ala後特異性激活ErbB4受體的NRG突變體。
11.權力要求10所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ IDNO1中胺基酸殘基位點16突變成丙氨酸的胺基酸序列。
12.權力要求10所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ IDNO1中胺基酸殘基位點29突變成丙氨酸的胺基酸序列。
13.權力要求10所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ IDNO1中胺基酸殘基位點31突變成丙氨酸的胺基酸序列。
14.權力要求10所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ IDNO1中胺基酸殘基位點33突變成丙氨酸的胺基酸序列。
15.權力要求10所述方法篩選的NRG突變體，該NRG突變體包括SEQ IDNO1中胺基酸殘基位點47突變成丙氨酸的胺基酸序列。
16.權力要求10所述的方法篩選的NRG突變體在製備特異性激活ErbB2/ErbB4受體藥物的應用。
17.根據權力要求16所述的應用，其中NRG突變體通過激活哺乳動物ErbB2/ErbB4受體，從而治療、預防或延緩哺乳動物疾病。
18.根據權力要求16所述的應用，其中所述哺乳動物為人類。
19.根據權力要求17所述的應用，其中所述哺乳動物疾病包括發生在骨、耳、眼睛、眼瞼、頭頸部、心臟、喉、下顎、下顎外側髁、上頜骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、胰腺、腮腺、耳廓、垂體、前列腺視網膜、唾液腺、皮膚、肌肉、脊髓、甲狀腺、扁桃腺、神經系統、呼吸系統、消化系統、循環系統、生殖系統、泌尿系統、內分泌系統、心血管疾病、造血系統的疾病。
20.根據權力要求19所述的應用，其中心血管疾病包括心力衰竭、心肌梗死、快速心律失常、家族性心肌肥大型心肌病、缺血性心臟病、原發性擴張型心肌病和心肌炎。
21.根據權力要求20所述的應用，其中所述導致心力衰竭的原因為充血性心衰、心肌梗死、快速心律失常、家族性心肌肥大型心肌病、缺血性心臟病、擴張型心肌病和心肌炎。
22.根據權力要求19所述的應用，其中肌肉疾病包括平滑肌、骨骼肌、心肌疾病。
全文摘要
本發明提供了篩選特異性激活ErbB受體的NRG突變體的方法，該方法包括用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4複合物的三維結構；分子動力學模擬NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的構象和穩定性；MM/PBSA方法計算NRG與ErbB3或ErbB4的結合自由能；丙氨酸理論掃描計算方法確定NRG殘基突變成丙氨酸後對NRG與受體親合性變化，根據該變化確定特異性激活ErbB受體的NRG突變體方法。本發明還提供了NRG突變體、NRG突變體的應用及製備。
文檔編號A61P11/04GK1715926SQ200410025728
公開日2006年1月4日 申請日期2004年7月2日 優先權日2004年7月2日
發明者周明東, 徐凌飛 申請人:上海澤生科技開發有限公司