一種長穗偃麥草e組染色體特異rapd-scar分子標記的製作方法

2023-04-25 05:35:31 1

專利名稱：一種長穗偃麥草e組染色體特異rapd-scar分子標記的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種長穗偃麥草E組染色體特異RAPD-SCAR分子標記，尤其涉及一種 檢測小麥E組染色體的試劑盒及其應用。
背景技術：
偃麥草屬是小麥的一個近緣種屬，它具有普通小麥缺少的許多優良性狀，如分櫱 能力強，根系發達，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽鹼力強，多花、大穗、多實，籽粒蛋白含量高以及 優良的烘烤品質，抗多種病害能力強，對小麥條銹病、葉銹病、杆銹病、白粉病、黃矮病、條紋 花葉病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麥遺傳育種的重要親本之一。長穗偃麥草(Agropyron elongatum)是小麥的一個重要近緣種，具有蛋白質含量高、抗多種真菌和病毒病害、耐旱、 耐寒、大穗多花等優異性狀，是在小麥品種改良中應用最廣泛的野生種之一。在自然界，長穗偃麥草有二倍體、四倍體和十倍體3種倍性類型。其中二倍體長穗 偃麥草(Thinopyrum elongatum) E組染色體是組成偃麥草屬(Elytrigia)多倍體物種的基 本染色體組，攜帶有對小麥遺傳育種有益的基因，但對於四倍體和十倍體類型的染色體組 構成，一直沒有一致的結論。通過遠緣雜交及染色體工程的方法從普通小麥野生近緣種屬 轉移優良基因的方法已被實踐證明是一條卓有成效的途徑。目前，國外從長穗偃麥草中成 功轉移了 Sr24 (3DL)，Sr26 (6AL)，Sr25 (7DL, 7AL)，Lrl9, Lr24 等基因。國內從小麥與長穗 偃麥草雜種後代中育成了小偃4號、5號、6號、小偃107等小麥品種。通過雜交和漸滲的方式是將外源染色體的優良性狀和優異基因導入小麥的一種 有效的方法，但是，在重組的小麥中，源於小麥-長穗偃麥草雜交後代的外源E組染色質或 染色體的檢測成為至關重要的問題，雖然通過農學上的重要特性以及生化分析已將有價值 的基因繪圖在長穗偃麥草染色體上，但這些實驗的檢測手段是不穩定的，而且不適合進行 重要的農學性狀的檢測。有一些遺傳學手段，如染色體分帶、原位雜交等技術，已經將其用 於小麥遺傳背景下外源遺傳物質的檢測，但這些技術費時、費力，對技術的要求也很高，而 且用這些實驗手段進行大規模的後代快速篩選依然存在一定的局限。所以，迫切要求開發 一種可以在小麥遺傳背景下快速、準確、大規模的鑑定長穗偃麥草外源染色質或染色體的 分子標記技術。隨著分子生物學的發展，DNA分子標記已經廣泛應用於小麥遺傳育種的研究，限制 片段長度多態性(RFLP)是首次被使用的分子標記，在植物遺傳研究中獲得很大的應用價 值，但是，RFLP技術需要大量純化的DNA，而且實驗本身費時，對技術要求也很高，它不適合 進行育種系統的大規模的篩選，因此，育種學家已經開始進行普通PCR的研究，期望在小麥 育種系統中找到一種更簡單的方式鑑定外源染色質，許多基於PCR的DNA分子標記技術已 經被開發，如 RAPD，AFLP，EST，SSR等。在這些標記中，RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)技術相對簡單，而且它不需要知道有關序列方面的信息，同時在指紋圖譜和系統發生 學研究領域的應用是高效的。但它的重複性和穩定性卻很差，如果將其轉化為SCAR標記， 其特異性和穩定性大幅度提高，可以更方便快捷地應用於異源染色體的檢測。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測植物E組染色體的試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的 序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物，所述含有長穗偃 麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物具體為「中國春」-長穗偃麥草3E 二體附加系和「中 國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。本發明的另一個目的是提供一種檢測植物E組染色體的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由如下引物對、dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶和PCR緩衝液組 成所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另 一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5 μ M ；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR試 劑中的濃度為0. 06υ/μ 1 ；所述氯化鎂在所述的PCR試劑中的濃度為0. ISmM ；所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物。所述含有長穗偃麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物為「中國春」-長穗偃麥草 3Ε 二體附加系和「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1 代自交得到的F2代。所述引物對或所述的PCR試劑或所述的試劑盒在檢測長穗偃麥草E組染色體中的 應用，也是本發明保護的範圍。PCR緩衝液購自寶生物工程(大連)有限公司，產品目錄號R10T1。本發明的第三個目的是提供一種輔助檢測待測植物中是否含有E組染色體的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述試劑盒中的引物對或所述的PCR試劑 對待測植物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；檢測所述PCR擴增產物，若所述PCR擴增產 物中含有大小為807bp的片段，則所述待測植物中候選含有E組染色體，若所述PCR擴增產 物中不含有大小為807bp的片段，則所述待測植物中候選不含有E組染色體。所述PCR擴增中，以待測植物的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為57°C。所述PCR擴增產物的核苷酸序列為序列表中序列2自5』末端第觀7_1093位核苷酸。所述檢測所述PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發明的實驗證明，本發明開發的SCAR分子標記為快速、準確地鑑定小麥遺傳背 景下的外源長穗偃麥草E組染色質或染色體奠定基礎。小麥外源E組染色質的檢測是鑑定 小麥-長穗偃麥草重組系、漸滲系的關鍵，大量雜交後代的篩選和鑑定工作非常繁雜，本發 明獲得的E基因組特異SCAR標記，即SCAR8tl7,將為小麥-長穗偃麥草重組系E組染色質的 快速檢測和準確鑑定以及分子標記輔助育種提供新的途徑和方法。


圖1為RAPD引物0PF03在普通小麥「中國春」、「中國春」-2C 二體附加系、二倍體
長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中的擴增結果圖2為RAPD-SCAR引物在CS-1E 7E 二體附加系，CS-2C 二體附加系，二倍體長
穗偃麥草，四倍體長穗偃麥草中的擴增結果圖3為SCAR8tl7引物在CS-3EXCS-2C的F1, F2代中的擴增結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。供試材料為「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系(Endo TR. Allocation of a Gc chromosome of Aegilops cylindrica to wheat homoeologous group 2. Genes Genet Syst，1996，71 J43-M6，公眾可從哈爾濱師範大學獲得)，二倍體長穗偃麥草(Knott D R.The inheritance of rust resistance. VI. The transfer of stem rust resistance from Agropyron elongatum to common wheat. Canadian Journal of Plant Science, 1961,41 :108-123,公眾可從哈爾濱師範大學獲得)、「中國春」-長穗偃麥草二體附加 系(1E-7E)(Dvorak J，Knott DR. Disomic and diteleosomic additions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol,1974, 16 :399-417,公眾可從哈爾濱師範大學獲得)來自於日本國家生物資源計劃小麥中心；四 倍體長穗偃麥草(Heneen W K，Runemark H. Cytology of Elym us (Agropyron) elongata complex. Hereditas，1972，70 (2) :155_164，公眾可從哈爾濱師範大學獲得)來自於中國 農業科學院；普通小麥「中國春」(Miller TE，Hutchinson J，Chapman V Investigation of a preferentially transmitted Aegilops sharonesis chromosome in wheat. Theor Appl Genet, 1982,61 :27-33.，公眾可從哈爾濱師範大學獲得)、「中國春」-長穗偃麥草 3E 二體附力口系(Dvorak J，Knott DR. Disomic and diteleosomic additions of diploid Agropyron elongatum chromosomes to Triticum aestivum[J]. Can J Genet Cytol, 1974, 16 :399-417,公眾可從哈爾濱師範大學獲得)與「中國春」_殺配子染色體2C 二體附加系雜 交獲得的Fp F2代來自於哈爾濱師範大學。 實施例1、長穗偃麥草E組染色體特異RAPD-SCAR分子標記0PF03的獲得1、長穗偃麥草E組染色體特異RAPD-SCAR分子標記0PF03的篩選與克隆利用36條RAPD引物，對普通小麥「中國春」、「中國春」-殺配子染色體2C 二體附 加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草等材料進行擴增篩選，分離和克隆E基因組特 異擴增片段。PCR擴增體系Template DNA50ngIOx buffer2. 5 μ 11. 5mMMgCl222. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM)1· 5 μ 1
RAPD Primer (10 μ Μ)1 μ 1r Taq polymerase (5U/μ 1) 0. 25 μ 1_Distilled sterile water up to 20 μ 1PCR反應程序94°C預變性5分鐘，45個循環包括94°C變性30秒，36°C退火45秒， 72°C延伸1分鐘，45個循環，之後72°C延伸10分鐘。4°C保存。RAPD擴增產物均在含有lmg/ml EB的1. 2%瓊脂糖上電泳檢測，在紫外成像系統 (Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下觀察並照相記錄結果。PCR擴增結果如圖1所示，其中1.為普通小麥「中國春」;2.為「中國春」-殺 配子染色體2C 二體附加系；3.為二倍體長穗偃麥草；4.為四倍體長穗偃麥草；M.為 DL2000marker，從圖中看出，引物0PF03 5，-CCTGATCACC-3，(序列1)在二倍體長穗偃麥草、 四倍體長穗偃麥草中能擴增出一條HOObp左右的片段，此產物在普通小麥「中國春」中沒 有出現，在中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系中沒有出現目的片段；表明這個片段是長 穗偃麥草E基因組所特有的。回收從二倍體長穗偃麥草中得到的特異片段，送去測序。經測序結果可知，該PCR 產物具有序列表中序列2所示的核苷酸，序列表的序列2由1407個核苷酸組成，將PCR產 物命名為0PF0314Q7。在GeneBank中將其進行Blast同源性搜索，0PF0314(17未找到與其具有同源性的序 列，所以可以初步證明該片段是長穗偃麥草E基因組所特有的。也可人工合成序列2。2、長穗偃麥草E組染色體特異RAPD-SCAR分子標記的建立與定位根據序列表中序列2的序列，利用I^rimer Premier 5. 0軟體，設計了 1對SCAR引 物。SCAR807 上遊引物5，-GGCACGGTAAGTGTCAAG-3，(序列 3)SCAR807 下遊引物5，-GATACGTTGCCACAGTCC-3，(序列 4)反應體系為20μ 1，將RAPD擴增條件調整為正反向引物各0.5μ 1，退火溫度為
57°C, 35個循環外，其他同RAPD分析。PCR擴增體系Template DNA50ngIOx PCR buffer2. 5 μ 11. 5mMMgCl2 (終濃度為 0. 18mM)2. 5 μ 1dNTP Mix (2. 5mM,終濃度為 0. 18mM)1· 5 μ 1SCAR807 上遊引物(10 μ Μ,終濃度為 0. 5 μ Μ)0. 5 μ 1SCAR807 下遊引物(10 μ Μ,終濃度為 0· 5 μ Μ)0. 5 μ 1
r Taq polymerase (5U/ μ 1，終濃度為 0. 06U/ μ 1)0. 25 μ 1
Distilled sterile waterup to 20 μ 1IOx PCR buffer購自寶生物工程(大連)有限公司，產品目錄號RlOTl。分別以二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草、普通小麥「中國春」和「中國春」-殺 配子染色體2C 二體附加系的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。
結果如圖2所示，其中，1-7分別為「中國春」-長穗偃麥草二體附加系(1E-7E) 1.為CS-IE 二體附加系；2.為CS-2E 二體附加系；3.為CS-3E 二體附加系；4.為CS-4E 二 體附加系；5.為CS-5E 二體附加系；6.為CS-6E 二體附加系；7.為CS-7E 二體附加系；8.為 普通小麥「中國春」CS ;9.為二倍體長穗偃麥草；10.為四倍體長穗偃麥草；11.為「中國 春」-殺配子染色體2C 二體附加系；M.為DL2000marker。從圖中看出，在「中國春」-長穗 偃麥草二體附加系(1E-7E)、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中都能擴增出807bp片 段，而在「中國春」、「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系中沒有此片段。測序807bp的 片段，結果為該片段具有序列表序列2自5』末端第觀7-1093位核苷酸，表明該片段為長穗 偃麥草E基因組所特有。同時還利用一套「中國春」-長穗偃麥草二體附加系(1E-7E)將該對SCAR引物進 行初步定位分析，結果顯示，SCAR807標記分布於長穗偃麥草E基因組所有染色體上。實施例2、長穗偃麥草E組染色體特異RAPD-SCAR分子標記的應用用SCAI 8(17上遊引物和SCAI 8(17下遊引物對「中國春」-長穗偃麥草3E 二體附加系 與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交後代F1和F1自交得到的F2代進行了鑑定。 以普通小麥「中國春」、「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體 長穗偃麥草為對照。結果如圖3所示，其中1-9為「中國春」-長穗偃麥草3E二體附加系和「中國春」-殺 配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代；10-19為F1代自交獲得的F2代；20為普通小 麥「中國春」;21為「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系；22為二倍體長穗偃麥草；23 為四倍體長穗偃麥草；M為DL2000marker。從圖中可以看出，SCAR8tl7標記在F1代均表現為陽性結果(得到807bp的片段)。為 了在後代中進行易位系的初步篩選和鑑定，選取76株「中國春」-長穗偃麥草3E 二體附加 系與「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系的自交F2代進行上述PCR鑑定，結果為陰性、 陽性結果同時存在，有4株2n = 42的後代在SCAR8tl7標記中出現了陽性結果(得到807bp 的片段)，所以可以初步判斷這些植株為易位系，易位的機率約為5. 26% (殺配子染色體2C 是一種可以誘導染色體產生畸變的特殊染色體，它可以使不含有它的配子產生致死或半致 死的效應，半致死的效應就包括如染色體的易位、缺失等染色體畸變，達到創製易位系或缺 失系的目的，這是一種誘導染色體產生畸變的一種方式，但2C產生的這些畸變行為完全是 隨機的。目前有實驗證明此種誘導染色體產生畸變的頻率一般在5% 10%左右，因此本 發明的易位的機率在理論值範圍內)。利用SCAR8tl7分子標記能夠快速、準確地鑑定小麥遺傳背景下的外源長穗偃麥草E 組染色質或染色體，這樣可以大大提高育種速度，縮短育種周期，實現了利用分子標記輔助 選擇育種的目的。
權利要求
1.一種檢測植物E組染色體的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條 引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物，所述含有長穗偃麥草 E組染色質或染色體的小麥屬植物具體為「中國春」-長穗偃麥草3E 二體附加系和「中國 春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1代自交得到的F2代。
3.一種檢測植物E組染色體的PCR試劑，由如下引物對、dNTP、氯化鎂、DNA聚合酶和 PCR緩衝液組成所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條 引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。
4.根據權利要求3所述的PCR試劑，其特徵在於所述引物對中各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ ；所述dNTP在所述的PCR試劑中的濃度為0. 18mM,所述DNA聚合酶在所述的PCR試劑中 的濃度為0. 06U/y 1 ；所述氯化鎂在所述的PCR試劑中的濃度為0. ISmM ；所述植物為含有長穗偃麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物。
5.根據權利要求3或4所述的PCR試劑，其特徵在於所述含有長穗偃麥草E組染色質或染色體的小麥屬植物為「中國春」-長穗偃麥草3Ε 二體附加系和「中國春」-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代和/或所述F1代自 交得到的F2代。
6.權利要求1或2所述試劑盒或權利要求3-5中任一所述的PCR試劑在檢測長穗偃麥 草E組染色體中的應用。
7.一種輔助檢測待測植物中是否含有E組染色體的方法，包括如下步驟用權利要求1 或2所述試劑盒中的引物對或權利要求3或4中所述的PCR試劑對待測植物進行PCR擴增， 得到PCR擴增產物；檢測所述PCR擴增產物，若所述PCR擴增產物中含有大小為807bp的片 段，則所述待測植物中候選含有E組染色體，若所述PCR擴增產物中不含有大小為807bp的 片段，則所述待測植物中候選不含有E組染色體。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增中，以待測植物的基因組DNA為模板；所述PCR擴增的退火溫度為57°C。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述PCR擴增產物的核苷酸序列為序列表中序列2自5』末端第觀7-1093位核苷酸。
10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特徵在於所述檢測所述PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發明公開了一種長穗偃麥草E組染色體特異RAPD-SCAR分子標記。提供了一種檢測植物E組染色體的試劑盒，包括如下引物對所述引物對中的一條引物為序列表中的序列3所示的核苷酸，所述引物對中的另一條引物為序列表中的序列4所示的核苷酸。小麥外源E染色質的檢測是鑑定小麥-長穗偃麥草重組系、漸滲系的關鍵，大量雜交後代的篩選和鑑定工作非常繁雜，本發明的實驗證明，本發明開發的SCAR分子標記能夠為快速、準確地鑑定小麥遺傳背景下的外源長穗偃麥草E組染色質或染色體奠定基礎。
文檔編號C12Q1/68GK102127597SQ201010594469
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者劉春影, 徐國輝, 束永俊, 蘇文悅, 郭長虹 申請人:哈爾濱師範大學