遼寧鹼蓬膽鹼加單氧酶基因及其克隆的製作方法

2023-04-24 19:35:11 1

專利名稱：遼寧鹼蓬膽鹼加單氧酶基因及其克隆的製作方法
技術領域：
本發明是遼寧鹼蓬膽鹼加單氧酶基因及其克隆，屬於生物工程領域。特別涉及到遼寧鹼蓬(S.liaotungensis kitag.)編碼膽鹼加單氧酶的基因及其克隆。
對非生物脅迫的普遍適應是積累與細胞代謝相容的有機溶質，廣泛存在的最普遍的滲透物質是甘油、甘露醇、脯氨酸、蔗糖、海藻糖和銨的四價化合物。甜菜鹼就是一類季銨化合物，在細菌、藻類、動物和多種植物中普遍存在，其中藜科、禾本科等植物在乾旱或鹽脅迫下甜菜鹼的積累更為明顯。甜菜鹼除定位於葉綠體外還存在於微粒體和胞漿中。對細菌和植物的研究都表明甜菜鹼的存在與耐滲透脅迫有關。甜菜鹼起著無毒滲透保護劑的作用，它的積累使得許多代謝中的重要酶類在滲透脅迫下能保持活性。Saneoka等人證明，含甜菜鹼的玉米在鹽脅迫下比缺失型所受的損傷明顯下降。甜菜鹼是以膽鹼為底物經兩步酶催氧化生成，即膽鹼→甜菜鹼醛→甜菜鹼。在高等植物中，催化第一步反應的是膽鹼加單氧酶(choline monooxygenase CMO)，催化第二步反應的是甜菜鹼醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase BADHE.C.1.2.1.8)。這兩個酶的活性受鹽和乾旱脅迫誘導。目前只有極少數幾種植物的膽鹼加單氧酶基因被測序克隆。遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)是一種耐鹽性很強的鹽生植物，其膽鹼加單氧酶活性較高。
本發明提供了遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)編碼膽鹼加單氧酶的基因CMO，提供了CMO cDNA全序列及其相應的胺基酸序列。提供了含有CMO的克隆載體pUC19-CMO和含有這種載體的大腸桿菌(E.coli)JM109細胞JM109-pUC19-CMO。提供了CMO的植物表達載體pBI121-CMO和含有這種載體的大腸桿菌(E.coli)JM109細胞JM109-pBI121-CMO。利用本發明，可以進行植物基因轉化，提高植物耐鹽、耐低溫及耐旱性。
本發明以菠菜(Spinacia oleracea L.)、甜菜(Beta vulgaris)的膽鹼加單氧酶基因CMO核苷酸序列作參考，根據同源性較好的區域設計併合成兩條寡核苷酸引物，提取遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)總RNA為模板，RT-PCR方法合成CMO的部分片段，並對此PCR產物測定核苷酸序列。根據此序列，在靠近5′端一側設計一條反轉錄引物，兩對嵌套PCR引物，5′RACE法合成CMO的5′端片段，對此片段進行PCR產物測序。根據第一個片段的序列，在靠近3′端一側設計一條引物，3′RACE法合成CMO的3′端片段，對此片段進行PCR產物測序。這樣獲得了遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)CMO cDNA全序列，根據CMO cDNA全序列，設計兩條引物，RT-PCR法合成CMO基因編碼區，並將CMO基因編碼區克隆到克隆載體pUC19，形成CMO克隆載體pUC19-CMO。熱擊法將這個克隆載體導入大腸桿菌(E.coli)JM109感受態細胞，形成含有pUC19-CMO的大腸桿菌細胞JM109-pUC19-CMO。將pUC19-CMO和植物表達載體pBI121分別用限制性內切酶切割，形成互補的粘性末端，T4DNA連接酶連接，形成CMO的植物表達載體pBI121-CMO，熱擊法將這個表達載體導入大腸桿菌(E.coli)JM109感受態細胞，形成含有pBI121-CMO的大腸桿菌細胞JM109-pBI121-CMO。
遼寧鹼蓬(S.liaotungensis kitag.)CMO cDNA核苷酸序列如下 其中前面的小寫字母表示5′端非編碼區，中間大寫字母為編碼區(既開放閱讀框架)，後面的小寫字母表示3′端非編碼區。 為翻譯起始密碼， 為翻譯終止密碼， 為加poly(A)信號。
根據以上核苷酸序列，推導遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)膽鹼加單氧酶蛋白的胺基酸序列如下 DAQTFDPKEYGLKPLKVAVWGPFVLISLDKTLPESDVGTEWLGSSAEDVKAHAFDPSLKFIHRSEFPMECNWKVFSDNYLDSSYHVPYAHKYYATELDFDTYDTQTIGKVVIQRVGSNTNRPDGFDRLGEKAFYAFTYPNFAVERYGPWMTTMHVQPIAQRKCKLVVDYYIEDSLLDNKDYIEKGIAINDNVQKEDKVLCESVQKGLETPAYRSGRYVMPIEKGIHHFHCWLHQILKCMO cDNA全長1820bp，5′端非編碼區123bp，3′端非編碼區368bp，開放閱讀框架1329bp，編碼443aa其中有Rieske-type〔2Fe-S〕蛋白的保守Cys-His對 克隆載體pUC19-CMO中含有CMO編碼區全序列。受體大腸桿菌細胞JM109-pUC19-CMO中含有克隆載體pUC19-CMO。表達載體pBI121-CMO中含有CMO編碼區全序列。受體大腸桿菌細胞JM109-pBI121-CMO中含有表達載體pBI121-CMO。
CMO是首次被提取、測序和克隆的遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)的膽鹼加單氧酶基因。因其所編碼的膽鹼加單氧酶能夠催化甜菜鹼的合成，所以該基因的表達載體可用於植物的基因轉化，提高植物的耐鹽、耐寒、耐旱能力。
以下是本發明的最佳實施例實施例1S.Liaotungensis kitag.膽鹼加單氧酶cDNA全序列的獲得採集遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)，取葉子進行液氮研磨，TRIZOL試劑盒(GIBICOL公司產品)提取總RNA。
①、CMO cDNA部分片段的獲得以菠菜(Spinacia oleracea L.)、甜菜(Beta vulgaris)的膽鹼加單酶基因CMO核苷酸序列作參考，根據同源性較好的區域設計併合成兩條寡核苷酸引物，RT-PCR法獲得部分片段。
引物如下C15′-AAAGGATGGCAAGTTGCAGG-3′C25′-GGGCCATACCTTTCCACAGC-3′RT反應條件如下
MgCl24ul10×RNA PCR Buffer 2ulRNase Free H2O 8.5uldNTP Mixture2ulRNase Inhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase 1ulOligo dT-adapter Primer 1ulTemplate RNA1ul20ul42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5minPCR反應條件如下MgCl26ul10×RNAPCRBuffer8ul滅菌蒸餾水 61.5ulTaKaRa Taq 0.5ulC1(10pM)2ulC2(10pM)2ulcDNA20ul100ul94℃ 2min 72℃ 7min4℃
PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳後，用NaI回收試劑盒(TAKARA公司產品)回收約700bp的DNA片段，對該片段用Sanger鏈終止法測定其核苷酸序列，為遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)的膽鹼加單氧酶基因部分序列。
②、CMO cDNA 5′端序列的獲得根據①的序列，在靠近5′端一側設計一條反轉錄引物，兩對嵌套PCR引物，5′RACE法合成CMO的5′端片段。
引物如下RT-primer5′-(p)GAGAACGAATGGTC-3′F15′-CCTGCTTTGTGTGCCCTTAC-3′R15′-GACTTTITGCCACTTCCACA-3′F25′-ACAAAAGCCACCCAAACAAC-3′R25′-TTCACCATCTCGGCTCACCA-3′RT反應條件如下總RNA 1ul10×RT buffer 1.5ulRnase Inhibiter(40U/ul) 0.5ulAMV Reverse Transcriptase XL(5U/ul) 1ulRT-primer(1ug/ul) 1ul15ul30℃ 10min50℃ 30min80℃ 2min4℃Hybrid RNA的分解RT反應液15ul5×Hybrid RNA degenaration buffer 15ulDEPC水 45ulRnase H(60U/ul) 1ul
30℃反應1小時，然後進行乙醇沉澱。通過連接反應將單鏈cDNA環化乙醇沉澱的單鏈cDNA5×RNA Ligation Buffer 8ul40％PEG#600020ulDEPC水 12ulT4RNA ligase 1ul41ul16℃反應15～18小時。1st PCR反應上述連接液 1ul10×LA PCRBuffer5uldNTP Mixtme 8ulTaKaRa LA Taq(5U/ul)0.5ulF1(20pmol/ul) 0.5ulR1(20pmol/ul) 0.5ulddH2O 34.5ul50ul94℃ 1min 4℃2nd PCR反應1st PCR反應產物 1ul10×LA PCR Buffer 5uldNTP Mixtrue8ulTaKaRa LA Taq(5U/ul)0.5ul
F2(20pmol/ul) 0.5ulR2(20pmol/ul) 0.5ulddH2O 34.5ul50ul 4℃反應得到一條約700bpDNA片段，回收，測序，為遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)的膽鹼加單氧酶基因5′端序列。
③、CMO cDNA 3′端序列的獲得根據①的序列，在靠近3′端一側設計一條引物，3′RACE法合成CMO的3′端片段。
引物如下C35′-CTAGTGCCGAAGATGTTAAG-3′RT反應條件如下MgCl24ul10×RNA PCR Buffer 2ulRNase Free H2O 8.5uldNTP Mixture2ulRNase Inhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase 1ulOligo dT-adapter Primer 1ulTemplate RNA1ul20ul42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5minPCR反應條件如下cDNA2ulTaKaRa LA Taq 1ul10×LA PCR Buffer 10uldNTP Mixtrue16ulC3(20pM)1ulM13primer M4(20pM) 1ulddH2O 69ul100ul94℃ 1min 72℃ 7min4℃反應得到一條約1kbDNA片段，回收，測序，為遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)的膽鹼加單氧酶基因3′端序列。
將上述三個序列連接起來，既為遼寧鹼蓬(S.Liaotungensis kitag.)的膽鹼加單氧酶基因全序列。
④、CMO基因編碼區的獲得根據上述全序列設計引物，RT-PCR法獲取CMO基因編碼區。
引物如下CMO ORF F primer5′-ggGGATCGAATTTAAGGTCTTGTTTGATGGCTG-3′CMO ORF R primer5′-ggGAGCTC5′TCACTTCAAAATTTGGTGCAACC-3′RT反應條件如下MgCl24ul10×RNA PCR Buffer 2ul
RNase Free H2O 8.5uldNTP Mixture2ulRNase Inhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase 1ulOligo dT-adapter Primer 1ulTemplate RNA1ul20ul42℃ 30min99℃ 5min5℃ 5minPCR反應條件如下cDNA2ulTaKaRa LA Taq 1ul10×LAPCRBuffer 10uldNTP Mixtrue16ulCMO ORF F primer(20pM) 1ulCMO ORF R primer(20pM) 1ulddH2O 69ul100ul94℃ 1min 72℃ 7min4℃反應得到一條約1.3kbDNA片段，回收，測序，為遼寧鹼蓬(s.Liaotungensis kitag.)的膽鹼加單氧酶基因編碼區全序列。實施例2CMO與克隆載體pUC19的重組及轉化大腸桿菌JM109CMO與克隆載體pUC19分別用BamH I/Sac I雙酶切。酶切條件如下Eppendorf A Eppendorf BCMO gene(0.2ug/ul) 35ul pUC19(2ug/ul) 5ul0.5×K buffer 7.5ul 0.5×K buffer 10ulBamH I 6ulBamH I 9ulSac I 7ulSac I 7ulH2O94.5ul H2O 166ul150ul 200ul37℃酶切3小時，電泳後分別回收兩個目的片段，用T4DNA連接酶連接。連接條件如下pUC19(0.05ug/ul)1ulCMO gene(0.05ug/ul) 3ul10×T4DNA連接酶Buffer 1ulT4DNA連接酶(1U/ul) 1ulddH2O 4ul16℃連接2小時，熱激法轉化大腸桿菌JM109，PCR法檢測陽性克隆JM109-pUC19-CMO。從JM109-pUC19-CMO中提取質粒，以pUC19的通用引物測定外源插入序列CMO的核苷酸序列，與實施例1所述測序結果一致。
實施例3CMO與表達載體pBI121的重組及轉化大腸桿菌JM109從JM109-pUC19-CMO中提取質粒pUC19-CMO、表達載體pBI121分別用BamH I/Sac I雙酶切，連接，形成JM109-pBI12-CMO，熱激法轉化大腸桿菌JM109，形成JM109-pBI12-CMO，條件同實施例2。
權利要求
1.一種膽鹼加單氧酶基因CMO，其特徵在於它是遼寧鹼蓬(S.Liaotungensiskitag.)編碼的膽鹼加單氧酶基因。
2.權利要求1所述膽鹼加單氧酶基因CMO的核苷酸序列
3.根據權利要求1所述膽鹼加單氧酶CMO的克隆載體pUC19-CMO。
4.根據權利要求3所述克隆載體pUC19-CMO的大腸桿菌(E.coli)受體細胞JM109-pUC19-CMO。
5.根據權利要求1所述膽鹼加單氧酶CMO的表達載體pBI121-CMO。
6.根據權利要求5所述表達載體pBI121-CMO的大腸桿菌(E.coli)受體細胞JM109-pBI121-CMO。
全文摘要
本發明是遼寧鹼蓬膽鹼加單氧酶基因及其克隆,屬於生物工程領域。本發明提供了一種來自於遼寧鹼蓬(Suaedaliaotungensis kitag.)編碼膽鹼加單氧酶的基因CMO,提供了CMO cDNA全序列及其相應的胺基酸序列。提供了含有CMO的克隆載體pUC19－CMO和植物表達載體pBI121－CMO以及分別含有這兩種載體的大腸桿菌(E.coli)JM109細胞JM109－pUC19－CMO和JM109－pBI121－CMO。本發明可用於植物的基因轉化,達到提高植物耐鹽、耐低溫及耐旱性的目的。
文檔編號C12N15/52GK1364905SQ0110607
公開日2002年8月21日 申請日期2001年1月12日 優先權日2001年1月12日
發明者李秋莉, 高曉蓉, 安利佳 申請人:大連理工大學, 遼寧師範大學