水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的檢測方法

2023-04-24 19:39:11 2

專利名稱：水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，具體涉及水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑 桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的快速檢測技術。
背景技術：
黃單胞菌屬Xanthomonas種類繁多，致病性多樣，第2版的《伯傑氏系統細菌學手 冊》收錄了 20個種，70個分類地位已經確定的致病變種和70個分類地位尚不確定的致病 變種。現行的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中收錄了 14個檢疫性黃 單胞菌。水稻白口十枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)禾口水稻細菌性條斑病菌 (X. oryzae pv. oryzicola，Xooc)是水稻上重要的細菌性病害。水稻白葉枯病菌可造成水 稻減產10 % 30 %，嚴重時可達50 %以上。水稻細菌性條斑病菌可造成水稻減產5 % 10%，嚴重時可達20%。柑桔潰瘍病菌(X. axonopodis pv. citri,Xac)能夠侵染為害絕大 多數柑桔栽培品種，是影響全球柑桔種植業發展的重大檢疫性病菌。以上三者都是我國重 要的檢疫性細菌。甘藍黑腐病菌(X. campestris pv. campestris, Xcc)是十字花科植物重 要的病原菌，在世界範圍內，尤其是熱帶和亞熱帶地區引起十字花科作物如甘藍、花椰菜和 大白菜等發生黑腐病，對蔬菜生產造成嚴重的經濟損失。若要有效防止上述4種黃單胞菌進境，就必須要有快速準確的診斷方法。鑑定黃 單胞菌的方法主要有生理生化方法、基於PCR技術的分子生物學方法等。生理生化方法， 操作步驟繁瑣，一股鑑定一種菌需要15天左右的時間，太耗時，而且相關人員需要豐富的 經驗。基於PCR技術的分子生物學，對黃單胞菌檢測主要有普通PCR、雙重PCR、實時螢光 PCR和滾環擴增等方法；這些方法存在易汙染、靈敏度低，而且每次只能檢測一種致病菌等 不足。

發明內容
本發明的目的是克服以上技術缺陷，提供一種快速檢測水稻白葉枯病菌、水稻細 菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌四種黃單胞菌的方法。水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的檢測方 法，包括如下步驟a、提取DNA 提取檢測樣本的基因組DNA，製得DNA溶液；b、DNA模板PCR反應以DNA溶液作為模板，用引物進行PCR反應，擴增得到PCR 產物；其中，引物包括引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R兩對引物，分別具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,
正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R :TACCGGAGCTGCGCGTT,引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病 菌和甘藍黑腐病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設計，引物&p0D-F/)(rp0D-R能對水 稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增，引物PSRG-F/PSRG-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌 和甘藍黑腐病菌的鐵載體受體DNA序列設計，引物PSRG-F/PSRG-R能對水稻白葉枯病菌、水 稻細菌性條斑病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增，引物XrpoD-F/XrpoD-R 與引物 PSRG-F/PSRG-R 不相互幹擾；c、雜交將PCR產物與基因晶片上的特異性探針雜交；其中，特異性探針包括探針 Xoo-Sl、探針Xooc-Sl、探針Xac-Al和探針Xcc_S2，分別具有如下序列探針Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探針Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探針Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探針Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探針X00-Sl是根據水稻白葉枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得 到的PCR產物設計的，探針Xoo-Sl對應水稻白葉枯病菌；探針X00C-Sl是根據水稻細菌性 條斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xooc-SI 對應水稻細菌性條斑病菌；探針Xac-Al是根據柑桔潰瘍病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R 作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xac-Al對應柑桔潰瘍病菌；探針XCC-S2是根據甘 藍黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xcc_S2對 應甘藍黑腐病菌；d、採集雜交結果；e、分析判斷根據採集到的雜交結果，分析雜交結果是否為陽性，如果特異探針呈 陽性，則檢測樣本中含有該特異探針對應的病菌，反之陰性則不含有該特異探針對應的病 菌。進一步地，所述基因晶片上的探針還包括陽性定位點探針Pos-ck，其具有如下序列，陽性定位點探針 Pos-ck :NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG ；步驟c還包括陽性定位點探針Pos-ck與檢測陽性定位點探針的互補鏈探針 AntiPos-ck雜交的步驟，互補鏈探針AntiPos-ck具有如下序列，互補鏈探針AntiPos-ck Cy5-CCAAATTGATCCCACCC ；步驟e還包括將探針Xoo-Sl、探針Xooc-Sl、探針Xac-Al、探針Xcc_S2雜交結果與 陽性定位點探針Pos-Ck雜交結果進行比較的步驟，雜交結果相同則為陽性。進一步地，所述基因晶片上的探針還包括陰性質控探針Neg-CK，其具有如下序列， 陰性質控探針 Neg-CK :NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGACo進一步地，步驟d採用雷射共聚焦掃描儀掃描、軟體分析得到。進一步地，步驟a之前還包括菌種的培養的步驟；具體地，菌種的培養是指30°C 下、將檢測樣本在營養瓊脂培養基上培養2-3天。本發明的再一目的是提供一種用於檢測水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、 柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的PCR引物和特異探針，PCR引物包括引物&p0D-F/&p0D-R和引物PSRG-F/PSRG-R兩對引物，分別具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT，引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病 菌和甘藍黑腐病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設計，引物&p0D-F/)(rp0D-R能對水 稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增， 引物PSRG-F/PSRG-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑 腐病菌的鐵載體受體DNA序列設計，引物PSRG-F/PSRG-R能對水稻白葉枯病菌、水稻細菌性 條斑病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增，引物XrpoD-F/XrpoD-R 與引物 PSRG-F/PSRG-R 不相互幹擾；特異性探針包括探針Xoo-Sl、探針Xooc-Sl、探針Xac-Al和探針Xcc_S2，分別具有 如下序列探針Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探針Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探針Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探針Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探針X00-Sl是根據水稻白葉枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得 到的PCR產物設計的，探針Xoo-Sl對應水稻白葉枯病菌；探針X00C-Sl是根據水稻細菌性 條斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xooc-SI 對應水稻細菌性條斑病菌；探針Xac-Al是根據柑桔潰瘍病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R 作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xac-Al對應柑桔潰瘍病菌；探針XCC-S2是根據甘 藍黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xcc_S2對 應甘藍黑腐病菌。本發明的第三目的是提供一種用於檢測水稻白葉枯病菌的引物&p0D-F/&p0D-R 和探針Xoo-Sl，引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和探針Xoo-Sl具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探針Xoo-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG ；引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設 計，引物&poD-F/)(rp0D-R能對水稻白葉枯病菌DNA進行PCR擴增，探針Xoo-Sl是根據水 稻白葉枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。本發明的第四目的是提供一種用於檢測水稻細菌性條斑病菌的引物&poD-F/ XrpoD-R和探針Xooc-Sl，引物XrpoD-F/XrpoD-R和探針Xooc-Sl具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探針Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設計，引物&poD-F/&p0D-R能對水稻細菌性條斑病菌DNA進行PCR擴增，探針Xooc-Sl是根 據水稻細菌性條斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。本發明的第五目的是提供一種用於檢測柑桔潰瘍病菌的引物&p0D-F/&p0D-R 和探針Xac-Al，引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和探針Xac-Al具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探針Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,引物&p0D-F/)(rp0D-R根據柑桔潰瘍病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設 計，引物&p0D-F/&p0D-R能對柑桔潰瘍病菌DNA進行PCR擴增，探針Xac-Al是根據柑桔 潰瘍病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。本發明的第六目的是提供一種用於檢測甘藍黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和 探針Xcc-S2，引物PSRG-F/PSRG-R和探針探針Xcc_S2具有如下序列，正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG，反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT，探針Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,弓丨物PSRG-F/PSRG-R根據甘藍黑腐病菌的鐵載體受體DNA序列設計，引物PSRG-F/ PSRG-R能對甘藍黑腐病菌DNA進行PCR擴增，探針Xcc_S2是根據甘藍黑腐病菌DNA在引物 PSRG-F/PSRG-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。本發明提供的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐 病菌的檢測方法，通過採用弓I物&p0D-F/)(rp0D-R和引物PSRG-F/PSRG-R兩對弓|物同時對 檢測樣本潛在的4種病菌的DNA模板進行PCR反應，因此速度快。通過基因晶片上設置的 特異性探針與PCR產物雜交，能快捷準確得出反應結果陽性與否，這種雜交方法不易汙染、 靈敏度高；採用基因晶片雜交結果判斷檢測結果，技術人員無需豐富的形態學知識和經驗， 檢測結果直觀明確。


圖1是基因晶片雜交結果一；圖2是基因晶片雜交結果二 ；圖3是基因晶片雜交結果三；圖4是基因晶片雜交結果四；圖5是基因晶片雜交結果五；圖6是基因晶片雜交結果六。
具體實施例方式實施例1檢測樣本A是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，包括如下步驟a、提取DNA 在30°C下、將檢測樣本A在營養瓊脂培養基上培養2_3天；提取檢測樣本的基因組DNA，製得DNA溶液；細菌基因組DNA的提取是公知技術，本實施例中具體操作如下1) 1. 5mL菌液，室 溫13000r/min離心5min，去上清；2)取沉澱加濃度為50g/L的溶菌酶100 μ L，懸浮菌液， 37° C，放置2h ;3)加入TE 385 μ L, 20% SDS 15 μ L，煮沸IOmin ;4)用等體積的酚氯仿抽 提，充分振蕩混勻，4°C 13000r/min離心5min，將上清移至滅菌離心管；5)加ImL冰無水乙 醇，_20°C放置30min以上，沉澱DNA ；6)4°C 13000r/min離心lOmin，棄上清，冰無水乙醇洗 滌1次，75%乙醇洗滌2次，溶解於100 μ L ddH20, _20°C保存備用。b、DNA模板PCR反應以DNA溶液作為模板，用引物進行PCR反應，擴增得到PCR 產物；其中，引物包括引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R兩對引物，分別具有如下 序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,
正向引物 PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT ；引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病 菌和甘藍黑腐病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設計，引物&p0D-F/)(rp0D-R能對水 稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增；引物PSRG-F/PSRG-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌 和甘藍黑腐病菌的鐵載體受體DNA序列設計，引物PSRG-F/PSRG-R能對水稻白葉枯病菌、水 稻細菌性條斑病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增；引物XrpoD-F/XrpoD-R 與引物 PSRG-F/PSRG-R 不相互幹擾；PCR 反應體系為0· 25mmol/L IOXBuffer (Mg2+free)(大連寶生物)、2· Ommol/ L MgCl2 (大連寶生物)、0· 2mmol/L CY5_dNTPs (Amersham Biosciences 公司)、正向引物 (XrpoD-F, PSRG-F)和反向引物(XrpoD-R，PSRG-R)各 0. 2 μ mol/L、IU Taq 酶(大連寶生 物)、模板DNA 10 20ng，總體積25 μ L。標記PCR擴增在T3PCR儀(德國Biometra公司) 上進行，擴增條件為94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，共 30 個循環；72°C IOmin0c、雜交將PCR產物、互補鏈探針AntiPos-ck與基因晶片上的特異性探針雜 交；其中，基因晶片上的探針包括特異性探針Xoo-Sl、特異性探針Xooc-Sl、特異性探針 Xac-Al、特異性探針Xcc-S2、陽性定位點探針Pos-ck和陰性質控探針Neg_CK，各探針分別 具有如下序列互補鏈探針AntiPos-ck Cy5-CCAAATTGATCCCACCC ；探針Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探針Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探針Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探針Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,陽性定位點探針 Pos-ck NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG,陰性質控探針 Neg-CK NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGAC,互補鏈探針AntiPos-ck是陽性定位點探針Pos-ck的互補鏈探針，該探針可與陽性定位點探針Pos-ck雜交並使得陽性定位點探針Pos-ck顯示陽性；探針Xoo-Sl是根 據水稻白葉枯病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探 針Xoo-Sl對應水稻白葉枯病菌；探針X00c-Sl是根據水稻細菌性條斑病菌DNA在引物 XrpoD-F/XrpoD-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xooc-SI對應水稻細菌性條斑病 菌；探針Xac-Al是根據柑桔潰瘍病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下擴增得到的PCR 產物設計的，探針Xac-Al對應柑桔潰瘍病菌；探針XCC-S2是根據甘藍黑腐病菌DNA在引物 PSRG-F/PSRG-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xcc_S2對應甘藍黑腐病菌；基因晶片上還設置有空白對照，基因晶片上各特異性探針、陽性定位點探針、陰性 質控探針和空白對照具有表1所示的布局表 1
Pos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckPos-ckXoo-SlXoo-SlXoo-SlXoo-SlXoo-SlXooc-SlXooc-SlXooc-SlXooc-SlXooc-SlPos-ckXac-AlXac-AlXac-AlXac-AlXac-AlXcc-S2Xcc-S2Xcc-S2Xcc-S2Xcc-S2Pos- ckNeg-CKNeg-CKNeg-CKNeg-CKNeg-CK空白對 照空白對 照空白對 照空白對 照空白對 照晶片基片選擇晶芯光學級醛基基片(北京博奧生物有限公司)；探針用TE緩衝液 (pH 8.0)稀釋至終濃度40 μ mol/L，將50% DMSO加入384孔板中，再加入等量的探針溶液， 輕輕混勻，並按表1設計的探針順序，用晶片點樣儀(德國GeSim公司)將探針點至基片 上；點樣後基片經37°C水合12h，用0. 2% SDS溶液漂洗5min ；去離子水分別漂洗3次，每 次2min ；再將基片放入0. 2% NaBH4封閉液中漂洗15min，前5min攪拌，中間5min靜置，後 5min攪拌；去離子水漂洗3次，每次2min ；2000r/min室溫離心2min，4°C避光保存；用雷射 共聚焦掃描儀GenePix 4200A(美國Axon公司)對基片進行預掃描質檢；雜交過程如下分別取雜交液7 μ L (2 % SDS和5 % SSPE等體積混合)、PCR產物 6 μ L和互補鏈探針AntiPos-Ck 1 μ L，混勻後95°C變性5min，立即於冰水中放置5min。將 變性後的混合物加入基因晶片點樣區，蓋上蓋玻片置於溼盒中50°C避光雜交3h。雜交後的 基因晶片依次在洗液I (0.3X SSC，0.2% SDS)和洗液II (0. 06X SSC)中各清洗2min，室溫 2000r/min 離心 2min。d、採集雜交結果；用雷射共聚焦掃描儀掃描基因晶片，用GenePix 5. 0軟體分析 掃描得到的圖像，雜交結果如圖1所示。e、分析判斷根據採集到的雜交結果，同時參照基因晶片上的陽性定位點探針 Pos-Ck雜交結果、陰性質控探針Neg-CK和空白對照，判斷探針X00-S1、探針Xooc-S 1、探針 Xac-Al和探針Xcc-S2的雜交結果陽性與否，來判斷檢測樣本A中是否含有探針Xoo-Sl、探 針X00c-Sl、探針Xac-Al和探針Xcc-S2對應的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔 潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌。如果特異探針呈陽性，則檢測樣本中含有該特異探針對應的病 菌，反之陰性則不含有該特異探針對應的病菌。在本實施例中探針Xoo-Sl、探針Xooc-Sl、探針Xac-ΑΙ和探針Xcc_S2均為陽性， 因此檢測樣本A含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌四種黃單胞菌。實施例2檢測樣本B是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，與實施例1具有檢測方法完全相同，雜交結果如圖2所示，即探針 Xoo-Sl為陽性，因此檢測樣本B含有水稻白葉枯病菌，不含水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍 病菌和甘藍黑腐病菌。實施例3檢測樣本C是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，與實施例1具有檢測方法完全相同，雜交結果如圖3所示，即探針 Xooc-Sl為陽性，因此檢測樣本C含有水稻細菌性條斑病菌，不含水稻白葉枯病菌、柑桔潰 瘍病菌和甘藍黑腐病菌。實施例4檢測樣本D是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，與實施例1具有檢測方法完全相同，雜交結果如圖4所示，即探針 Xac-Al為陽性，因此檢測樣本D含有柑桔潰瘍病菌，不含水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑 病菌和甘藍黑腐病菌。實施例5檢測樣本F是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，與實施例1具有檢測方法完全相同，雜交結果如圖5所示，即探針 Xcc-S2為陽性，因此檢測樣本E含有甘藍黑腐病菌，不含水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑 病菌和柑桔潰瘍病菌。實施例6檢測樣本F是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，與實施例1具有檢測方法完全相同，雜交結果如圖6所示，即探針 Xoo-Sl、探針X00c-Sl、探針Xac-Al和探針Xcc_S2均為陰性，因此檢測樣本F不含有水稻白 葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌四種病菌。實施例7用於檢測水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌 的PCR引物和特異探針，PCR引物包括引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和引物PSRG-F/PSRG-R兩對 引物，分別具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT。引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病 菌和甘藍黑腐病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設計，引物&p0D-F/)(rp0D-R能對水 稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增； 引物PSRG-F/PSRG-R根據水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑 腐病菌的鐵載體受體DNA序列設計，引物PSRG-F/PSRG-R能對水稻白葉枯病菌、水稻細菌性
10條斑病菌和甘藍黑腐病菌的DNA進行PCR擴增；並且引物&p0D-F/)(rp0D-R與引物PSRG-F/ PSRG-R不相互幹擾。 特異性探針包括探針Xoo-Sl、探針Xooc-Sl、探針Xac-Al和探針Xcc_S2，分別具有 如下序列探針Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG,探針Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG,探針Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,探針Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探針X00-Sl是根據水稻白葉枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得 到的PCR產物設計的，探針Xoo-Sl對應水稻白葉枯病菌；探針X00C-Sl是根據水稻細菌性 條斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xooc-SI 對應水稻細菌性條斑病菌；探針Xac-Al是根據柑桔潰瘍病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R 作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xac-Al對應柑桔潰瘍病菌；探針XCC-S2是根據甘 藍黑腐病菌DNA在引物PSRG-F/PSRG-R作用下擴增得到的PCR產物設計的，探針Xcc_S2對 應甘藍黑腐病菌。實施例8用於檢測水稻白葉枯病菌的引物&poD-F/)(rp0D-R和探針Χοο-Sl，引物&p0D_F/ XrpoD-R和探針Xoo-Sl具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探針Xoo-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAGo引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設 計，引物&poD-F/)(rp0D-R能對水稻白葉枯病菌DNA進行PCR擴增，探針Xoo-Sl是根據水 稻白葉枯病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。實施例9用於檢測水稻細菌性條斑病菌的引物&p0D-F/)(rp0D-R和探針Xooc-S 1，引物 XrpoD-F/XrpoD-R和探針Xooc-Sl具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探針Xooc-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAGo引物&p0D-F/)(rp0D-R根據水稻白葉枯病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設 計，引物&poD-F/&p0D-R能對水稻細菌性條斑病菌DNA進行PCR擴增，探針Xooc-Sl是根 據水稻細菌性條斑病菌DNA在引物&p0D-F/)(rp0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。實施例10用於檢測柑桔潰瘍病菌的引物&p0D-F/)(rp0D-R和探針Xac_Al，引物&p0D_F/ XrpoD-R和探針Xac-Al具有如下序列，正向引物XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY,反向引物XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT,探針Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC,
引物&p0D-F/)(rp0D-R根據柑桔潰瘍病菌的RNA多聚酶西格瑪因子DNA序列設 計，引物&p0D-F/&p0D-R能對柑桔潰瘍病菌DNA進行PCR擴增，探針Xac-Al是根據柑桔 潰瘍病菌DNA在引物&p0D-F/&p0D-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。實施例11用於檢測甘藍黑腐病菌的引物PSRG-F/PSRG-R和探針Xcc_S2，引物PSRG-F/ PSRG-R和探針探針Xcc-S2具有如下序列，正向引物PSRG-F GAATATCAGCATCGGCAACAG,反向引物PSRG-R TACCGGAGCTGCGCGTT，探針Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC 弓丨物PSRG-F/PSRG-R根據甘藍黑腐病菌的鐵載體受體DNA序列設計，引物PSRG-F/ PSRG-R能對甘藍黑腐病菌DNA進行PCR擴增，探針Xcc_S2是根據甘藍黑腐病菌DNA在引物 PSRG-F/PSRG-R作用下擴增得到的PCR產物設計的。實施例12 28採用已知樣本病菌作為檢測樣本，並採用實施例1完全相同的檢 測方法進行檢測，以驗證引物、探針的有效性和特異性；各實施例具體數據如表2所示。表2
實 施例檢測樣 本序號樣本名稱來源檢測結果結論12G水稻白葉枯病 菌南京農業大學探針Xoo-Sl呈陽性探針Xoo-Sl及引物對 樣本病菌有效13H水稻白葉枯病 菌南京農業大學探針Xoo-Sl呈陽性探針Xoo-Sl及引物對 樣本病菌有效14I水稻白葉枯病 菌中國檢驗檢疫科學 研究院探針Xoo-Sl呈陽性探針Xoo-Sl及引物對 樣本病菌有效15J水稻細菌性條 斑 病菌南京農業大學探針Xooc-Sl呈陽性探針Xooc-Sl及引物 對樣本病菌有效16K水稻細菌性條 斑 病菌南京農業大學探針Xooc-Sl呈陽性探針Xooc-Sl及引物 對樣本病菌有效17L水稻細菌性條 斑 病菌中國檢驗檢疫科學 研究院探針Xooc-Sl呈陽性探針Xooc-Sl及引物 對樣本病菌有效18M柑桔潰瘍病菌南京農業大學探針Xac-Al呈陽性探針Xac-Al及引物對 樣本病菌有效19N柑桔潰瘍病菌中國檢驗檢疫科學 研究院探針Xac-Al呈陽性探針Xac-Al及引物對 樣本病菌有效200甘藍黑腐病菌南京農業大學探針Xcc-S2呈陽性探針Xcc-S2及引物對 樣本病菌有效21P甘藍黑腐病菌中國檢驗檢疫科學 研究院探針Xcc-S2呈陽性探針Xcc-S2及引物對 樣本病菌有效22Q玉米細菌性枯 萎 病菌深圳出入境檢驗檢 疫局動植中心探針X。。-Si、探針X。。c-Si、探針 Xac-Al、探針Xcc-S2均陰性探針相對樣本病菌具 有特異性23R西瓜果斑病菌中國農業大學種子 健康檢測中心同上探針相對樣本病菌具 有特異性24S洋蔥腐爛病菌中國農業大學種子 健康檢測中心同上探針相對樣本病菌具 有特異性
12 由表1可知，引物&p0D-F/)(rp0D-R能對水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌四種黃單胞菌有效擴增，引物PSRG-F/PSRG-R能對水稻白葉 枯病菌、水稻細菌性條斑病菌和甘藍黑腐病菌三種黃單胞菌有效擴增，探針Xoo-Sl、探針 Xooc-Sl、探針Xac-Al、探針Xcc_S2具有特異性。 實施例1 6、12 28均設置了用於質控雜交、方便判斷雜交結果陽性與否的陽 性定位點探針Pos-ck、陰性質控探針Neg-CK和空白對照；陽性定位點探針Pos-Ck、陰性質 控探針Neg-CK和空白對照，不是本發明中所必需的，熟練的檢測人員可以在不設置陽性定 位點探針Pos-ck、陰性質控探針Neg-CK和空白對照的情況下做好雜交質控、判斷雜交結果 陽性與否。
權利要求
水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的檢測方法，包括如下步驟a、提取DNA提取檢測樣本的基因組DNA，製得DNA溶液；b、DNA模板PCR反應以DNA溶液作為模板，用引物進行PCR反應，擴增得到PCR產物；其中，引物包括引物XrpoD F/XrpoD R和引物PSRG F/PSRG R兩對引物，分別具有如下序列，正向引物XrpoD FCGGCTTCAACGACCTGATY，反向引物XrpoD RGAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT，正向引物PSRG FGAATATCAGCATCGGCAACAG，反向引物PSRG RTACCGGAGCTGCGCGTT；c、雜交將PCR產物與基因晶片上的特異性探針雜交；其中，特異性探針包括探針Xoo S1、探針Xooc S1、探針Xac A1和探針Xcc S2，分別具有如下序列探針Xoo S1NH2 TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG，探針Xooc S1NH2 TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG，探針Xac A1NH2 TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC，探針Xcc S2NH2 TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC，探針Xoo S1對應水稻白葉枯病菌；探針Xooc S1對應水稻細菌性條斑病菌；探針Xac A1對應柑桔潰瘍病菌；探針Xcc S2對應甘藍黑腐病菌；d、採集雜交結果；e、分析判斷根據採集到的雜交結果，分析雜交結果是否為陽性，如果特異探針呈陽性，則檢測樣本中含有該特異探針對應的病菌，反之陰性則不含有該特異探針對應的病菌。
2.根據權利要求1所述的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌 和甘藍黑腐病菌的檢測方法，其特徵是所述基因晶片上的探針還包括陽性定位點探針 Pos-ck，其具有如下序列，陽性定位點探針 Pos-ck :NH2-TTTTTTTTTTGGGTGGGATCAATTTGG ； 步驟c還包括陽性定位點探針Pos-ck與檢測陽性定位點探針的互補鏈探針 AntiPos-ck雜交的步驟，互補鏈探針AntiPos-ck具有如下序列， 互補鏈探針 AntiPos-ck :Cy5_CCAAATTGATCCCACCC ；步驟e還包括將探針Xoo-S 1、探針Xooc-S 1、探針Xac-Al、探針Xcc_S2雜交結果與陽性 定位點探針Pos-ck雜交結果進行比較的步驟，雜交結果相同則為陽性。
3.根據權利要求1所述的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，其特徵是所述基因晶片上的探針還包括陰性質控探針Neg-CK， 其具有如下序列，陰性質控探針 Neg-CK :NH2-TTTTTTTTTTCTGGAACAGCCAGAAGGACo
4.根據權利要求1所述的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，其特徵是步驟d採用雷射共聚焦掃描儀掃描、軟體分析得到。
5.根據權利要求1所述的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘 藍黑腐病菌的檢測方法，其特徵是步驟a之前還包括培養檢測樣本的步驟。
6.根據權利要求1所述的水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的檢測方法，其特徵是培養檢測樣本是指30°C下、將檢測樣本在營養瓊脂培 養基上培養2-3天。
7.用於檢測水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌 的PCR引物和特異探針，其特徵是PCR引物包括引物&p0D-F/)(rp0D-R和引物PSRG-F/ PSRG-R兩對引物，分別具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R :GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 正向引物 PSRG-F :GAATATCAGCATCGGCAACAG, 反向引物 PSRG-R :TACCGGAGCTGCGCGTT ；特異性探針包括探針Xoo-Sl、探針X00c-Sl、探針Xac-Al和探針Xcc_S2，分別具有如下 序列探針 Xoo-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAG, 探針 Xooc-Sl NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAG, 探針 Xac-Al NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGAC, 探針 Xcc-S2 NH2-TTTTTTTTTTCTCGGGTATCAGCCGTGGTCGC,探針Xoo-Sl對應水稻白葉枯病菌；探針X00C-Sl對應水稻細菌性條斑病菌；探針 Xac-Al對應柑桔潰瘍病菌；探針Xcc-S2對應甘藍黑腐病菌。
8.用於檢測水稻白葉枯病菌的引物&poD-F/)(rp0D-R和探針Xoo-Sl，其特徵是引物 XrpoD-F/XrpoD-R和探針Xoo-Sl具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 探針 Xoo-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGCTGGATGAAGo
9.用於檢測水稻細菌性條斑病菌的引物&p0D-F/)(rp0D-R和探針Xooc-Sl，其特徵是 引物)(rpoD-F/)(rpoD-R和探針Xooc-Sl具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 探針 Xooc-Sl :NH2-TTTTTTTTTTGAGGATGCGGTGGATGAAGo
10.用於檢測柑桔潰瘍病菌的引物&p0D-F/&p0D-R和探針Xac-Al，其特徵是引物 XrpoD-F/XrpoD-R和探針Xac-Al具有如下序列，正向引物 XrpoD-F CGGCTTCAACGACCTGATY, 反向引物 XrpoD-R GAYCTTCTTGAACTTGGCGTAT, 探針 Xac-Al :NH2-TTTTTTTTTTGACACGGCGACCGGACo
全文摘要
本發明公開了水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌和甘藍黑腐病菌的檢測方法，本方法通過兩對引物同時對檢測樣本的DNA模板進行PCR反應擴增得到PCR產物，然後PCR產物與基因晶片上設置的特異性探針雜交，根據雜交結果陽性與否，來判斷出檢測樣本是否含有水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、柑桔潰瘍病菌或甘藍黑腐病菌；本發明能一次性對4種細菌完成檢測，檢測速度快，並且檢測結果直觀明了，容易判斷。
文檔編號C12Q1/68GK101921843SQ201010218670
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者李一農, 李芳榮, 鄭耘, 龍海 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心;深圳市檢驗檢疫科學研究院