人工關節的製造方法
2023-04-25 02:10:06
專利名稱：人工關節的製造方法
技術領域：
本發明涉及人工關節的製作方法。具體來說，涉及在任意的曲面上加載具有適當厚度的細胞層，在關節面全部範圍內修復軟骨層的基礎技術。
背景技術：
軟骨是由軟骨細胞和軟骨基質構成的結締組織，關節骨是被有足夠厚度的軟骨覆蓋的組織。關節由軟骨支撐，因此可以順滑活動。但是，一旦軟骨受到損傷或破壞，極少可以自然治癒。因此，對於因變形性關節病、關節風溼病等使得關節的功能極度降低的病例，選擇採用了含有金屬或陶瓷、聚乙烯的人工關節置換術。該方法是將損傷的關節軟骨切除，用金屬、陶瓷或聚乙烯等人造物質覆蓋關節面的手術方法，在世界範圍得到廣泛的普及，目前是主要的治療方法。並且經過長期的材質的改良或設計的改良等，其有效性可達到10年或以上這樣的長時間。
但是，金屬、陶瓷或聚乙烯對於機體來講是異物，是沒有自身修復能力的材料。並且，源自材料的各種問題例如會產生摩擦、腐蝕疲勞、人工關節與骨界面的鬆動、嵌入、感染等。實際上有很多因人工關節磨損和損傷而不得不重新手術的病例。
因此，人們希望開發出新的治療方法，以代替現有的使用人造物質作為材料的人工關節的治療方法。
近年來，以ES細胞或來自自身的細胞為基礎的組織或器官的再生研究日益活躍。針對關節軟骨中的部分缺損開發出了利用各種組織工程學的技術。例如開發了將來自自身的細胞移植到缺損部位，誘導周圍的健康部位分泌再生因子，以治癒缺損的方法(Treatment of deepcartilage defects in the knee with autologous chondrocytetransplantation.N Engl J Med.1994 oct 6；331(14)889-95)。但是，該技術不過是包埋缺損部位的方法，難以作為大範圍的關節破壞的治療方法應用。
另一方面，Vacanti等人發表了關於缺損的耳廓或手指的再生方法的研究(Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cellconstruct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a humanear.Plast Reconster Surg.1997 Aug；100(2)297-302)。該方法是將患者的細胞附著於預先成型為耳或手指形狀的聚合物等載體上，將其移植到裸小鼠的皮下，使用由小鼠提供的營養，促進膠原等胞外基質的產生，以獲得移植組織的形狀的方法。裸小鼠是免疫系統缺損的小鼠。使來自患者的細胞在小鼠體內增生，然後重新移植給患者，具有無排斥反應的特徵，因而利用價值高。
但是，小鼠的大小是有限度的，因此，可由該方法製備的組織的大小依賴於小鼠的大小。另外，該方法在宗教上或動物保護方面存在問題。並且，還必須時常考慮到對動物的排斥感、以狂牛症為代表的傳染病的風險等。也進行了使比小鼠大型的動物例如豬的免疫機能缺損，應用於再生醫療的嘗試，但這種情況下，對於將經由其它種動物的體內的組織移植到人的行為，人們會產生厭惡感或有未知的傳染病的風險等，這些問題尚未見任何解決辦法。
還有公開了以凝膠作為模具，在模具的周圍附著細胞懸浮液，並使細胞附著於聚合物等上面的方法(日本特開2003-144139號公報)。該方法的目的是附著細胞懸浮液，因此，實際上不過是製備了膜狀細胞層，難以製備具有象關節軟骨那樣厚度的組織。
因此，為了使相當於關節軟骨的部分具有厚度，還有人發表了使軟骨細胞附著於預先用分解性聚合物製備的棉狀支撐物上，使其具有厚度的方法。但是，該方法中，聚合物殘留在關節軟骨部分上，可能會在分解過程中轉變為有毒物質，對細胞產生不良的影響(Chondrogenesis in a cell-polymer-bioreactor system.Exp Cell Res.1998Apr 10；240(1)58-65.)。
另一方面，人們還嘗試了將細胞包埋於膠原凝膠內進行軟骨再生，但膠原來自牛等其它動物，與移植受體可能有親和性的問題(Transplantation of cartilage-like tissue made by tissue engineering inthe treatment of cartilage defects od knee.J Bone Joint Surg Br.2002May；84(4)571-8)。
發明內容
如上所述，人們希望開發出可代替目前的金屬、陶瓷、聚乙烯的人工關節，對於大範圍的關節破壞有效，並且不會有對於使用其它種動物的厭惡感或未知的傳染病風險的新型的人工關節。
本發明人為解決上述課題進行了深入地研究，結果發現使細胞團附著於任意載體的表面，在規定條件下進行培養，可形成目標軟骨，從而完成了本發明。
即，本發明提供軟骨的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於加工成目標形狀的載體的表面，在誘導向軟骨組織分化的條件下培養上述細胞團。本發明還提供人工關節的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於加工成目標形狀的載體的表面，在誘導向軟骨組織分化的條件下培養上述細胞團。
關節面是由細胞、細胞所產生的基質或它們的組合所形成的。
本發明的方法中，載體可以例舉三磷酸鈣制的作為載體，優選其表面具有微孔。細胞可以例舉間充質幹細胞或軟骨細胞。上述培養例如在機體外且在生長因子或增生因子存在下進行。
附圖簡述
圖1是表示只由細胞構成的球狀關節面的圖。
圖2是基於兔股骨遠側部分的三維數據而設計的載體的圖。
圖3是表示使細胞團附著於載體的圖。
圖4是表示使細胞團再次附著於載體的圖。
圖5是表示兔股骨遠側關節面的全體成像的圖。
實施發明的最佳方式以下詳細說明本發明。
本發明提供細胞層具有必要足夠的厚度、並可附著於任意的曲面上的來自自身細胞的軟骨和人工關節的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於預先加工成目標形狀的載體的表面，將其在可分化為軟骨組織的條件下進行培養。由此，細胞團沿著載體的形狀增生，細胞團之間融合，關節面得以再生，發揮人工關節的功能。其特徵還在於通過添加生長因子或施加力學負荷，增進了胞外基質的生成，可以在機體外製備在強度方面理想的關節軟骨。
1.細胞作為培養對象的細胞為幹細胞(ES細胞、來自臍帶血的細胞、未分化間充質幹細胞等)等未分化細胞或其分化型細胞。特別優選未分化間充質幹細胞。
成骨細胞、軟骨細胞可容易地從未分化間充質幹細胞誘導分化，因此也可以使用這些誘導分化的細胞(關節軟骨細胞、骨細胞等)。還可以使用成熟間充質幹細胞。
幹細胞可以將多種細胞例如骨細胞和軟骨細胞組合，在任意的部位混合進行培養。例如可以是下述的2層組合上層為只含有由軟骨細胞得到的細胞團，下層是來自骨細胞的細胞團。為股骨時，可以是關節部分與軟骨系細胞團粘附，骨的部分與骨系的細胞團粘附。這樣的混合培養可以應用於包括關節面的所有骨的再生。
上述細胞可以通過Dexter法、磁珠法、細胞分選法等公知的方法從小鼠、兔、大鼠、豚鼠、狗、豬、山羊、牛等實驗動物或患者的骨髓中採集。
細胞大致分為懸浮細胞和支持物依賴性細胞，血液系統或免疫系統的細胞屬於前者，皮膚或骨骼等的細胞屬於後者。皮膚或骨骼等的細胞在培養液中如果是懸浮狀態則會死亡，要通過附著於玻璃等的培養皿等來增生。因此，在特氟隆(註冊商標)中，細胞會匯集於一處，這樣細胞尋求支持點，互相粘附，形成細胞團塊即球狀體。並且，球狀體之間粘附、融合，形成大的形狀。
如Molecular Biology of the cell第三版中的記載，已知通過酶處理等而分散開的細胞會自然凝聚，並已知該現象在從海膽等低等動物到哺乳類細胞中均可見。該自然凝聚是由含有鈣黏著蛋白的被稱為細胞黏著分子(CAM)的胞外黏著因子引起的，可認為是與生物發生初期形成四肢時發生的間充質幹細胞凝聚幾乎相同的現象在成熟個體中的再現(Gerisch，G.Curr.Top.Dev.Biol.14243-270.1980.；Hennings，H.Exp.Cell Res.143127-142.1983.；Moscona，A.A.；Hausman，R.E.Biological and biochemical studies on embryonic cell-cell recognition.InCell and Tissue Interactions，Society of General Physiologists Series(J.W.Lash，M.M.Burger，eds.)，Vol.32，173-185頁.New YorkRavenPress，1977.；Roth，S.；Weston，J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 58974-980.1967.)。
近年來，有報告指出由間充質幹細胞分化為軟骨細胞時，顯示經由鈣黏著蛋白的細胞之間的粘附作為開關，可以起始膠原的表達(Yoon YM，J Cell Biochem 2002；87(3)342-59)。
本發明中，優選先製成球狀體，然後再形成所需的形狀。本發明中，將上述間充質幹細胞等單層培養，然後轉移至疏水性或細胞非粘附性的圓底多孔或U字型孔中孵育。結果，細胞自然凝聚，產生細胞團(細胞團塊)。至產生細胞團所需的孵育時間為6-48小時，優選24-48小時。製備細胞團的方法除上述方法之外，還可採用向旋轉的溶液中加入細胞懸浮液的旋轉培養法、向試管中加入細胞懸浮液並用離心器沉澱的方法、精氨酸珠法等，並沒有特別限定。從可大量處理均勻的細胞團考慮，向疏水性或細胞非粘附性的多孔中加入細胞懸浮液的方法效率高，因此優選。
通過形成上述球體狀，細胞進入細胞周期的靜止期，可認為此時蛋白質的生產增加。將細胞誘導至靜止期後進行分化，將其稱為「脫離細胞增生周期，轉入細胞分化」。
2.細胞團的培養接著，使上述製備的細胞團附著於預先成型為任意形狀的載體上並進行培養。細胞團的個數沒有特別限定，可以任意設定。並且，如果需要，可以在附著後進一步追加細胞團，這也可與現有細胞團融合。
本發明中，使細胞團附著的載體可以根據人或兔的關節結構設計成任意的形狀。為了獲得耳廓、鼻等立體形狀的目標物，可以預先設計基於三維數據的模具，製作載體。
「載體」是指細胞團可粘附的材料，構成人工關節的全部或部分，發揮細胞團支撐物的功能。該載體是機體適合性材料，優選可在機體內吸收、置換為自身的組織的材料。優選載體的表面具有微孔。所述載體的例子有三磷酸鈣制的載體，也可採用高分子乳酸聚合物等生物體分解性的聚合物。
載體中無需附著細胞團的區域也可以用疏水性或細胞非粘附性的材料覆蓋。
附著於載體上的細胞團之間基於與機體本身具備的愈傷大致相同的機理分別融合，結果形成具有目標大小和細胞結構的結構體。
本發明中，為了使細胞團附著於具有立體結構的載體上，需要使縱向(高度或厚度)加長。結果，細胞存在於距液面很深之處，氣體交換效率降低。
因此，本發明中，將培養液調節至細胞團的一部分稍接觸氣相的程度(接觸氣相但不乾燥的程度)的量。這樣，培養液可從載體的微孔中出入，與細胞團接觸。「微孔」是指細胞團不能通過、但培養液可通過的大小的孔(直徑10-500μm)。微孔可以在載體本身的成型過程中產生，也可以用細針刺載體而形成。
培養液可以自由通過載體的微孔，因此可以總是向細胞供給培養液，足以進行細胞團分化、成熟、細胞團之間的融合、成熟。這種情況下，成熟是指細胞所產生的各種膠原或蛋白聚糖等胞外基質的增加，本來，機體內的細胞大多是被豐富的胞外基質包圍的。
培養液的量只要可以使細胞增生、分化即可，沒有特別限定，但每個細胞團必須有總量至少為0.5ml的培養液。
培養所使用的培養液有含10％FBS的DMEM培養基、無血清DMEM高糖培養液等。
培養在可誘導細胞團分化為軟骨的條件下進行。由細胞團向軟骨的分化誘導可在生長因子或細胞增生因子存在下培養。生長因子或細胞增生因子可以使用骨形成蛋白(BMP)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)等。
上述因子根據增生的大小、胞外基質的產生量單獨或適當組合，調節種類或量來添加。例如，由間充質幹細胞分化成軟骨細胞時要添加TGF-β，並且通過追加BMP、FGF、IGF等，更可以獲得膠原豐富的軟骨樣組織。
這裡，已知對細胞施加一些刺激，則通常mRNA量增加，之後蛋白質的產生增加。基於該點，本發明中，可改變培養條件(培養時間、其它條件)，調節細胞的成熟度。「成熟度」是指適合將細胞團移植到骨或關節等缺損部位的程度。關於該移植時期，可以探討在(1)mRNA增加時移植；(2)在蛋白質(這種情況下是指膠原等胞外基質)增加的過程中移植；或者(3)蛋白質產生足夠量(＝成熟)時移植。
如果是人工關節型，則最好在蛋白質充分產生時進行移植，培養期間優選1個月或以上。因此，使用在體外長期不變性的載體是很重要的。
通常，在誘導培養開始2周時RNA的產生達到峰值，之後可見膠原產生的上升，在5-6周達到穩定。
並且通過添加各種生長因子或增生因子，可以調節胞外基質的量。通過施加流體靜力壓或剪切彈力等機械刺激、超聲波或衝擊波等，可以使胞外基質增加。因此通過施加上述生長因子或流體靜力壓、超聲波等機械刺激，可以將RNA的產生達到峰值的時間提前。
與前述同樣，也可以使用BMP、FGF、TGF-β、IGF、PDGF、VEGF等作為生長因子或細胞增生因子。
這樣，通過調節培養條件或培養期間，可以任意調節成熟度。
與以往的臨時移植到裸小鼠的皮下、使再生組織成熟的方法不同，本發明的方法不需要動物。因此可以不受小鼠身體大小的限制，可得到任意的大小形狀。
通過使用患者本人的未分化間充質幹細胞，可以使用來自自身細胞的組織再生骨、軟骨等。
以下通過實施例具體說明本發明。本發明並不受這些實施例的限定。
本實施例是模仿人股骨關節、股骨頭的實施例。
單層培養來自人骨髓的間充質幹細胞。最終，每個15cm皿上得到1.0×106個間充質幹細胞。將該細胞用胰蛋白酶處理，製成細胞懸浮液，向Sumitomo Bakelite公司製造的球形孔板中分別接種1.0×105個細胞。然後在37℃、5％二氧化碳的條件下進行培養，第二天，每孔板可得到96個直徑平均為0.5mm的細胞團。將該細胞團附著於加工成半球形的三磷酸鈣上。然後添加0.01μg/ml的TGF-β，培養48小時，使細胞團分化成軟骨。附著於該曲面的細胞團之間融合24-48小時左右，得到只由細胞構成的球狀關節面(圖1)。圖1中，B為A的放大圖。
本實施例是兔股骨遠側關節面的製作例。
對兔關節軟骨切片進行膠原酶處理，進行所得軟骨細胞的單層培養。最終每個15cm皿上得到1.0×106個軟骨細胞。將該細胞用胰蛋白酶處理，製成細胞懸浮液，向Sumitomo Bakelite公司製造的球形孔板中分別接種1.0×105個細胞。然後在37℃、5％二氧化碳的條件下進行培養，第二天，每孔板可得到96個直徑平均為0.5mm的細胞團。
另一方面，模仿兔股骨遠側關節面的形狀，預先製作三維數據(圖2)，製作該形狀的三磷酸鈣制載體。
將上述細胞團附著於三磷酸鈣上。使該三磷酸鈣的股骨遠側關節面上具有微孔。然後添加0.01μg/ml量的TGF-β，培養48小時，使細胞團分化成軟骨。附著於該曲面的細胞團之間融合24-48小時左右，得到只含有細胞的關節面(圖3)。圖3中，稍顯褐色的部分是附著有細胞團的部分。第二周(7天後)將320個細胞團再次附著於上述得到的關節面(圖3)上。結果，新附著的細胞團與已附著的細胞團融合，形成了順滑的曲面(圖4A)。
再將320個細胞團附著於上述關節面，結果最終如圖4B所示，可以製成目標關節。圖4B中，褐色的部分是附著有細胞團的區域。周圍的白色部分是用於遮蓋的石蠟樹脂，可使多餘的部分不會附著有細胞團。
圖5表示兔股骨遠側關節面的整體圖像。
圖5A是基於輸入計算機的三維數據製作的含有三磷酸鈣的兔股骨遠側關節面形狀的載體(細胞附著之前)。
圖5B、圖5C是細胞團附著後第二天的總體視圖。可知只在相當於軟骨的部分形成了細胞層。圖5D是細胞附著部分(圖5B、C)的放大圖。融合至幾個細胞團的邊界還可分清的程度。
產業實用性本發明提供軟骨和人工關節的製作方法。本發明所提供的技術是通過大量製備細胞團塊，將它們融合，這樣，無需利用聚合物等載體，即可由來自自身的細胞單獨製作關節軟骨層。並且不需要移植到用於使關節成熟的動物體內，因此可不經由其它種動物即可製作任意形狀的軟骨層。
權利要求
1.軟骨的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於加工成目標形狀的載體的表面，在誘導分化為軟骨組織的條件下培養上述細胞團。
2.人工關節的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於加工成目標關節形狀的載體的表面，在誘導分化為軟骨組織的條件下培養上述細胞團。
3.權利要求1或2的方法，其中關節面由細胞、細胞所產生的基質或它們的組合形成。
4.權利要求1或2的方法，其中載體具有微孔。
5.權利要求1或2的方法，其中細胞為間充質幹細胞或軟骨細胞。
6.權利要求1或2的方法，其中培養是在機體外且在生長因子或增生因子存在下進行的。
全文摘要
本發明涉及軟骨的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於加工成目標形狀的載體的表面，在可分化為軟骨組織的條件下培養上述細胞團。還涉及人工關節的製作方法，其特徵在於使細胞團附著於加工成目標關節形狀的載體的表面，在可分化為軟骨組織的條件下培養上述細胞團。
文檔編號A61L27/38GK1859933SQ20048002842
公開日2006年11月8日 申請日期2004年8月2日 優先權日2003年7月31日
發明者巖本幸英, 中山功一, 田仲和宏, 松田秀一 申請人:巖本幸英, 中山功一