基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法和裝置的製作方法
2023-07-07 14:32:56 1
專利名稱：基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及顯微鏡領域，尤其涉及一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法和裝置。
背景技術：
與絕大部分光學成像一樣，自從顯微鏡被發明以來，阿貝衍射極限也一直制約著顯微系統解析度的提高。早期的顯微系統均為寬場成像系統，成像分辨能力有限。這一情況直到共聚焦顯微系統(Confocal Microscope)發明後才得到一定的改善。共聚焦顯微的基本概念在1957年由M. Minsky等人提出M. Minsky等MicroscopyApparatus,美國專利3013467,但直到1978年該技術才真正得以儀器化C. Cremer等Considerations on a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field。雷射共聚焦掃描顯微鏡用雷射作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的雷射與螢光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描雷射的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由於雷射束的波長較短，光束很細，所以共焦雷射掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統經一次調焦,掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。與傳統的寬場顯微系統相比，共聚焦顯微系統採用掃描成像的方式，在與成像物面共軛的焦平面上放置一個針孔(Pinhole)對非成像點周圍的雜散光進行遮擋，從而有效地限制了系統的有效點擴散函數。通過系統的光學傳遞函數分析可以證明，使用共聚焦方法，能夠在系統的極限解析度提高約I. 4倍。一般而言，常規的光束通過顯微物鏡聚焦後，將在焦平面上產生一個有限尺度的實心聚焦光斑，而聚焦光斑的大小將直接決定共聚集顯微系統的分辨能力。受制於工作波長、數值孔徑等因素的限制，共聚焦顯微系統的極限分辨能力一般不超過150納米。
發明內容
本發明提供了一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，以進一步改善共聚焦顯微系統的分辨能力。一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，包括以下步驟I)雷射光束經位相編碼後轉換為圓偏振光；2)將所述圓偏振光通過顯微物鏡聚焦到待測樣品上形成聚焦光斑並激發螢光；3)對所述待測樣品的表面進行掃描並收集激發螢光，獲取不同位置的光強度信息，並計算得到相應的顯微圖像。作為優選，所述步驟I)中的位相編碼為O 2 π渦旋位相編碼。O 2 π潤旋位相編碼是指對於一個橫截面中心對稱的圓形入射光束，以光束中心點為圓心，對橫截面內的光束產生O 2 的渦旋位相延遲，位相延遲量僅與截面內特定點的角向大小有關，而與該點到到圓心的距離無關。可用如下公式加以表示
權利要求
1.一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)雷射光束經位相編碼後轉換為圓偏振光； 2)將所述圓偏振光通過顯微物鏡聚焦到待測樣品上形成空心聚焦光斑並激發螢光； 3)對所述待測樣品的表面進行掃描並收集激發螢光，獲取不同位置的光強度信息，並計算得到相應的顯微圖像。
2.如權利要求I所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，其特徵在於，所述步驟I)中的位相編碼為O 2 31渦旋位相編碼。
3.如權利要求2所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，其特徵在於，所述顯微物鏡的數值孔徑NA = O. 95 I. 4。
4.如權利要求3所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，其特徵在於，所述顯微物鏡的數值孔徑NA = I. 4。
5.如權利要求I所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，其特徵在於，對所述步驟3)的光強度信息進行反卷積運算。
6.一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微裝置，包括雷射器和放置待測樣品的樣品臺，其特徵在於，還包括沿所述雷射器的光路依次布置的位相編碼器、偏振態轉換器和用於將光束聚焦到所述待測樣品上的顯微物鏡，所述待測樣品發出的激發螢光被顯微物鏡收集；並設有探測所述顯微物鏡收集的激發螢光的光強度信息的探測成像系統。
7.如權利要求6所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微裝置，其特徵在於，所述探測成像系統包括 用於將所述顯微物鏡收集的激發螢光進行聚焦的凸透鏡； 位於所述激發螢光聚焦的焦點處並用於遮擋理想焦點外螢光散射噪聲的針孔； 用於感應穿過所述針孔光強度信號的光電感應器件； 用於集成控制並進行反卷積運算的計算機。
8.如權利要求7所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微裝置，其特徵在於，所述偏振態轉換器由沿所述雷射器的光路依次布置的二分之一玻片和四分之一玻片組成。
9.如權利要求7所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微裝置，其特徵在於，所述顯微物鏡應為浸沒式顯微物鏡，其浸沒液為折射率為I. 518的浸沒油。
10.如權利要求7所述的基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微裝置，其特徵在於，所述樣品臺為二維移動平臺，所述偏振態轉換器與顯微物鏡之間設有二維掃描振鏡。
全文摘要
本發明公開了一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微方法，包括以下步驟1)雷射光束經位相編碼後轉換為圓偏振光；2)將所述圓偏振光通過顯微物鏡聚焦到待測樣品上形成空心聚焦光斑並激發螢光；3)對所述待測樣品的表面進行掃描並收集激發螢光，獲取不同位置的光強度信息，並計算得到相應的顯微圖像。本發明還公開了一種基於空心聚焦光斑激發的共聚焦顯微裝置。本發明的顯微方法和裝置可以實現更高的系統極限解析度；且系統改動小，結構簡單；成像速度與原有共聚焦系統相當。
文檔編號G01N21/64GK102830102SQ201210297189
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月21日 優先權日2012年8月21日
發明者匡翠方, 郝翔, 李暘暉, 顧兆泰, 李帥, 劉旭 申請人:浙江大學