Smc的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品的製作方法

2023-04-25 06:16:16

Smc的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品的製作方法
【專利摘要】本發明公開SMC的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，其中，將SMC用於製備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。SMC是一個具有很好的抗氧化、抗炎症、抗惡性細胞增殖的作用的化合物，同時具有低毒性，結構明確，含量穩定、人體內代謝機理清晰等優點。因此，SMC能用於開發一種新型治療和預防AD的藥物或保健品。
【專利說明】SMC的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫療保健領域，尤其涉及一種SMC的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品。
【背景技術】
[0002]阿爾茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一組病因尚未明確的原發性退行性腦變性疾病。目前全球已經有超過3500萬的AD患者。隨著社會人口老齡化逐步加劇，AD發病率呈逐漸上升趨勢，65歲人群中發病率大約為10%，而85歲人群中這一比例可高達50%。中國這方面情況更為嚴重，目前60歲以上的人口已達1.78億，預測到2050年將達到
4.37億，屆時AD將成為老年人的第一殺手。由於AD的致殘率較高，對人類健康造成嚴重危害。同時，對AD的醫療和照料還耗費了大量人力和財力，因此AD已成為除心腦血管病、糖尿病、癌症外嚴重影響人類健康的第4號殺手，成為一個棘手的社會和醫療衛生問題。AD的病理特徵主要包括兩方面:一是神經細胞外以澱粉樣蛋白(Αβ)沉積為核心形成老年斑(senile plaques, SP), SP 是 A β 前體(amyloid precursor protein, APP)異常降解形成的不溶解性Αβ 42斑塊，對神經元有毒性作用；另一方面則是神經細胞內Tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結 (NFT)。AD的發病機理十分複雜，可能是多種因素相互作用的結果，迄今為止其確切的發病機制尚不清楚。
[0003]近年來對AD的治療研究已取得一定的進展，研發出不少新的藥物，歸納目前臨床上常用的藥物主要有以下幾類:影響膽鹼系統功能藥物(包括膽鹼酯酶抑制劑、Ach受體激動劑)；腦血循環改善劑；腦代謝激活劑；糾正鈣穩態失調、抗氧化、抗炎藥物；神經營養因子等。這些藥物多存在療效不確切或毒副作用大、口服吸收差的缺點，並且它們均是依據相應發病機理假說而進行的嘗試，都是一些「治標」的方法，不能有效防止AD的迅速發展。正處於臨床研究中的具有防治AD作用的降脂藥、激素類物質則由於特異性不強或不易透過血腦屏障而預測不到良好的應用前景。
[0004]硒作為一種微量元素，其抗癌作用已被廣泛研究。硒在自然界以有機硒和無機硒兩種形式存在。實驗證明，無機硒化合物具有蓄積性毒性和致突變作用，而有機硒化合物因為其經過甲基化等脫毒過程，不但能夠更好地發揮硒的抗癌作用，而且在激發免疫反應上也比無機硒顯著。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine, SMC)屬於天然有機硒化物，廣泛存在於多種食物中，能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖、誘導其凋亡，並能抑制多種癌基因的表達，因而是一較好的腫瘤化學預防劑。

【發明內容】

[0005]鑑於上述現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種SMC的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，旨在提供一種新的防治阿爾茨海默病的藥物和保健品。
[0006]本發明的技術方案如下:
SMC的應用，其中，將SMC用於製備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。[0007]—種用於防治阿爾茨海默病的藥物，其中，所述用於防治阿爾茨海默病的藥物的組成成分包括SMC。
[0008]所述的用於防治阿爾茨海默病的藥物，其中，所述用於防治阿爾茨海默病的藥物將SMC和藥學上可接受的載體製成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
[0009]一種用於防治阿爾茨海默病的保健品，其中，所述用於防治阿爾茨海默病的保健品的組成成分包括SMC。
[0010]有益效果:本發明所提供一種SMC的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，在本發明中，將SMC用於防治AD疾病的開發與研究，並在原代神經細胞和AD模型鼠兩個水平上驗證了 SMC對AD的預防和治療效果。因此，本發明中提供一種SMC的新應用，將SMC用於製備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發明實施例1中以CCK-8法檢測SMC對神經細胞活力的影響的結果。
[0012]圖2是本發明實施例2中SMC抑制神經細胞內活性氧自由基(ROS)水平的結果。
[0013]圖3是本發明實施例3中SMC促進原代神經細胞生長的結果。
[0014]圖4是本發明實施例3中SMC促進原代神經細胞突觸後蛋白的表達水平的結果。 [0015]圖5是本發明實施例3中SMC促進原代神經細胞突觸前蛋白的表達水平的結果。
[0016]圖6是本發明實施例3中SMC抑制原代神經細胞tau蛋白磷酸化(PS404)水平的結果。
[0017]圖7是本發明實施例4中SMC抑制原代神經細胞tau蛋白磷酸化(PS396)水平的免疫印跡實驗結果。
[0018]圖8是本發明實施例4中SMC抑制原代神經細胞tau蛋白磷酸化(PS396)水平的
定量結果。
[0019]圖9是本發明實施例4中SMC抑制原代神經細胞APP蛋白水平的免疫印跡實驗結
果O
[0020]圖10是本發明實施例4中SMC抑制原代神經細胞APP蛋白水平的定量結果。
[0021]圖11是本發明實施例5中SMC提高AD模型小鼠的空間探索和記憶能力的結果。
【具體實施方式】
[0022]本發明提供一種SMC的應用及用於防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0023]AD作為公認的發病率及危害性最高的老年性疾病之一，目前尚無有效的治療藥物。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine, SMC)是一種新型硒源類的食品營養強化劑，與無機硒相比具有更低的生物毒性，而與其它有機硒相比，具有結構明確，含量穩定、人體內代謝機理清晰等優點。富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白、富硒食用菌粉等產品中硒的含量不是固定的，因為硒的有效補充劑量與中毒計量比較接近，所以富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白、富硒食用菌粉的食用安全性存在一定的風險。SMC與硒代蛋氨酸是自然界僅有的兩種含硒胺基酸，與硒代蛋氨酸相比，SMC具有較高的食用安全性。SMC在過去一直作為抗癌藥物作為研究以及開發。
[0024]而本發明中，則將SMC用於防治AD疾病的開發與研究。在原代神經細胞和AD模型鼠兩個水平上驗證了 SMC對AD的預防和治療效果。發現:(I) SMC促進原代神經細胞生長，並降低細胞內的氧化壓力；(2)SMC提高突觸相關蛋白的表達水平；(3)SMC抑制tau蛋白的磷酸化；(4) SMC降低APP的蛋白水平；(5) SMC提高小鼠的學習記憶能力。因此，SMC可在多靶點抑制AD的發生，發展，有望成為一種穩定、安全、有效的AD治療藥物。因此，本發明中提供一種SMC的新應用，將SMC用於製備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。
[0025]本發明中還提供一種用於防治阿爾茨海默病的藥物，所述用於防治阿爾茨海默病的藥物的組成成分包括硒甲基硒代半胱氨酸。所述用於防治阿爾茨海默病的藥物可以將硒甲基硒代半胱氨酸和藥學上可接受的載體製成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
[0026]本發明中還提供一種用於防治阿爾茨海默病的保健品，所述用於防治阿爾茨海默病的保健品的組成成分包括硒甲基硒代半胱氨酸。
[0027]以下通過實施例對本發明做進一步說明。
[0028]實施例1:以CCK-8法(細胞活性與增殖檢測試劑盒)檢測SMC對神經細胞活力的影響
CCK-8試劑中含水溶性四唑鹽-WST-8，它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臢染料，該物質生成量與活細胞的數量成正比。細胞增殖越多越快，則顏色越深，細胞毒 性越大，則顏色越淺。因此可直接用於細胞增殖和毒性分析，具體步驟如下:
(1)取對數生長期N2A細胞消化成單細胞懸液，調節細胞濃度為5X IOVmL,按每孔100UL接種於96孔細胞培養板中，37°C，5 % CO2培養箱中培養24 h ；
(2)棄去舊的培養液，用無血清培養基重複洗三次，再分別加入200UL含有各藥物濃度梯度的無血清DMEM培養基，使SMC終濃度分別為O μ mol/L、l μ mol/L、3 μ mol/L、5 μ mol/L、7 μ mol/L、10 μ mol/L，每組3個復孔。不含PBS無血清DMEM培養基作為對照組，繼續培養24 h ；
(3)每孔加20μ L的CCK-8試劑，放入培養箱培養2-4 h (分別在0.5、1、2、4 h檢測)後，用酶標儀于波長為450 nm及650 nm測定各孔吸光度值(OD)；
(4)細胞活力定義:以450nm的光吸收值/650 nm的光吸收值，作為細胞活力。
[0029]檢測結果如圖1所示，檢測範圍內的各濃度SMC對細胞的存活率均有一定的促進作用，其中以3 μ mol/L的作用效果最好。說明SMC對神經細胞的生長具有一定的促進作用。
[0030]實施例2:以流式細胞技術檢測SMC對神經細胞內活性氧自由基(ROS)水平的影響 活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用突光探針
DCFH-DA來進行活性氧的檢測的試劑盒。DCFH-DA探針本身是不能發螢光的，但是可以自由穿過細胞膜。而細胞內的酯酶能夠將進入細胞內DCFH-DA探針水解生成DCFH。產生的DCFH不能自由透過細胞膜，因此該探針很容易被裝載到細胞內。而在細胞內，ROS可以將無螢光的DCFH氧化生成有螢光的DCF。因此可以通過檢測細胞內DCF的螢光強度來檢測細胞內ROS水平。具體操作步驟如下:
(1)取對數 生長期的N2a細胞消化成單細胞懸液，調節細胞濃度為2.5 X 105/mL,按每孔2 mL接種於6孔細胞培養板中，37°C，5% CO2培養箱中培養24h ;
(2)棄去舊的培養液，用無血清培養基重複洗三次，再分別加入2mL含有各藥物濃度梯度的無血清DMEM培養基，使SMC終濃度分別為O μ mol/L、I μ mol/L,3 μ mol/L,5 μ mol/L、7 μ mol/L、10 μ mol/L每組3個復孔，繼續培養24 h ；
(3)用無血清DMEM培養基按照1:1000比例稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μ m/L。去除培養皿裡的細胞培養液，加入2 mL稀釋好的DCFH-DA。然後在37°C細胞培養箱內，孵育20 min,再用無血清的DMEM培養基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA ；
(4)胰酶消化後收集細胞，1000rpm，4°C離心3 min，棄上清，用預冷的PBS洗滌3次。用PBS重懸細胞，400目細胞篩過濾，流式細胞儀進行檢測。使用488 nm激發波長，525 nm發射波長。
[0031]檢測結果如圖2所示，以檢測範圍內的各濃度SMC處理N2a細胞後，細胞內的ROS水平均明顯降低，說明SMC具有顯著抑制神經細胞內ROS水平的作用。
[0032]實施例3:以免疫螢光檢測SMC對原代神經細胞各AD相關蛋白表達水平的影響
a、原代細胞培養
本發明中所用的原代神經細胞取自3XTg AD模型小鼠，該小鼠轉入APPswe、PSlM146V和TauP301L三種AD相關基因，表現出典型的AD病理特徵。
[0033]從出生一天的3XTg AD胎鼠大腦中分別獲取上皮層組織，經過木瓜酶消化吹打後得到原代神經細胞，培養在放有細胞爬片的24孔板中。細胞培養到第七天後以終濃度為3μΜ的SMC處理24小時後進行免疫螢光檢測。以相同培養條件下無SMC處理的原代神經細胞作為對照組。
[0034]實驗前準備工作:製備4%PFA、0.2%Triton、10%山羊血清封閉液、DAP1、封片劑(甘油/PBS)、指甲油、Timer，PBS預冷，準備冰盒與冰袋。具體操作步驟如下:
(1)提前半小時將4%PFA解凍，60°C水浴溶解；
(2)加4%PFA固定15min，每孔1ml，冰上進行；
(3)預冷PBS洗3次,每孔lml，分別洗5min、10 min、15 min,冰上進行；
(4)0.2%Triton 透膜 lOmin，每孔 500 μ 1，冰上進行；
(5)封閉液封閉Ih以上，每孔300μ 1，置於4°C冰箱/冰上；
(6)加一抗4°C過夜，母液300μ I封閉液；
(7)一抗回收，PBS洗3次，每孔I ml，每次5min，冰上進行；
(8)加二抗1:200，母液300 μ I封閉液，常溫下避光放置Ih以上；
(9)回收二抗，？83洗3次，分別洗511^11、101^11、151^11，在冰上避光進行；
(10)5μ g/mlDAPI染色2min (1:500)，每孔500 μ 1，在冰上避光進行；
(11)PBS洗3次，分別洗5min、IOmin、15min,在冰上避光進行；
(12)甘油/PBS封片，指甲油固定；
(13)避光4°C保存，待拍片；
(14)最後在雷射共聚焦顯微鏡下觀察。
[0035]b.SMC對原代神經細胞生長狀況的影響以DAPI (4』，6-二脒基-2-苯基吲哚)染細胞核，以抗MAP-2抗體染神經細胞骨架，結果如圖3所示，該圖為紅色通道的顯微鏡下觀察的黑白示意圖，其只顯示MAP-2，而在顯微鏡下觀察的細胞為紅色，從圖3可以看出，原代神經細胞經SMC處理後，細胞絲更多更長，表明SMC促進了神經細胞的生長和神經絲的發育。
[0036]c.SMC提高原代神經細胞突觸蛋白的表達水平
突觸功能障礙及缺失是AD的重要神經病理改變之一，是與認知能力下降關係最為密切的病理變化。突觸前膜囊泡蛋白突觸素(synapsin)和突觸後膜蛋白PSD-95是突觸的代表性蛋白。突觸蛋白在調節神經遞質的釋放及參與神經元早期發育等方面起著重要的作用。在AD中，突觸蛋白表達水平降低，突觸傳遞和突觸可塑性受損。免疫螢光實驗表明，以SMC處理後，細胞的突觸後膜蛋白PSD-95 (如圖4，其為綠色通道的顯微鏡下觀察的黑白示意圖，只顯示PSD-95，而在顯微鏡下觀察的細胞為綠色)和突觸素(如圖5所示，該圖為綠色通道的顯微鏡觀察的黑白示意圖，只顯示突觸素，而在顯微鏡下觀察的細胞為綠色)表達水平均明顯升高，表明SMC可抑制突觸損傷，提高神經突觸地可塑性。
[0037]d.SMC抑制原代神經細胞tau蛋白磷酸化(PS404)水平
微管結合蛋白tau的結構功能異常是誘發阿爾茨海默症的一個重要因素。微管系統是神經細胞骨架的主要成分，在維持細胞功能上起了重要作用，微管由α、β微管蛋白和微管相關蛋白組成。tau蛋白是一種微管相關蛋白，可與微管相結合併保持微管的穩定性。AD病例狀態下，tau過度磷酸化，並與其它的tau蛋白纖維配對結合。這種過度結合最終會在神經細胞胞體內形成神經纖維纏結，進而導致神經細胞微管骨架系統瓦解。這不但會影響神經細胞間正常的信號傳導，最終必然還會引起神經細胞的死亡。關於AD病理狀態下，微管結合蛋白tau的細胞毒性的機理，目前主要有兩種觀點。一種認為是由於過度磷酸化的tau與微管骨架分離從而 失去其生理功能；另一種認為過度磷酸化tau組成的神經纖維纏結會破壞正常tau蛋白的生理功能，並直接成為胞漿運輸的障礙。因此抑制tau蛋白的過度磷酸化，是抑制AD發展的一個重要策略。
[0038]從圖6 (該圖為綠色通道的顯微鏡下觀察的黑白示意圖，只顯示PS404，而在顯微鏡下觀察的細胞為綠色)中可以看出，SMC處理後，原代神經細胞tau蛋白在其Ser404位點的磷酸化水平顯著降低，表明SMC可抑制tau蛋白在該位點的過度磷酸化，抑制神經纖維纏結的形成，維護神經細胞微管骨架的穩定性，保護神經細胞。
[0039]實施例4:以免疫印跡(western blot)檢測SMC對原代神經細胞各AD相關蛋白表達水平的影響
蛋白質印跡法即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測三個部分組成。第一步是做SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質轉移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉移的方法多用電泳轉移，它又有半乾法和溼法之分，現在大多用溼法。第二步是用特異性的抗體檢測出已經印跡在膜上的所要研究的相應抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的。現在多用間接免疫酶標的方法，在用特異性的第一抗體雜交結合後，再用酶標的第二抗體(鹼性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗第一抗的抗體)雜交結合，再加酶的底物顯示或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術被廣泛應用於蛋白表達水平的檢測中。具體步驟如下:
1、組織蛋白樣品的製備:
I)以濃度為3 μ M的SMC處理24小時後的細胞為實驗組，以無SMC處理的細胞為對照
組；
2)提蛋白，按一定比例加入RIPA裂解液，並加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑；
3)超聲破碎細胞，按照超聲IS停1S，超聲2min；
4)4°C、12000rpm離心lh，取上清蛋白，分裝其餘樣品凍存置_80°C冰箱；
5)在蛋白中加入適量蛋白4Xloading buffer,沸水煮5min使蛋白變性。樣品制好後，保存於_20°C備用。
[0040]2、蛋白定量:
1)標準曲線的製作:取一塊酶標板，按下表加入試劑 表2-5:蛋白的濃度梯度
【權利要求】
1.SMC的應用，其特徵在於，將SMC用於製備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。
2.一種用於防治阿爾茨海默病的藥物，其特徵在於，所述用於防治阿爾茨海默病的藥物的組成成分包括SMC。
3.根據權利要求2所述的用於防治阿爾茨海默病的藥物，其特徵在於，所述用於防治阿爾茨海默病 的藥物將SMC和藥學上可接受的載體製成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
4.一種用於防治阿爾茨海默病的保健品，其特徵在於，所述用於防治阿爾茨海默病的保健品的組成成分包括SMC。
【文檔編號】A61P25/28GK103976991SQ201410207086
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】都秀波, 鄭友標, 劉瓊 申請人:深圳大學