高危型人乳頭瘤病毒檢測方法及試劑盒的製作方法
2023-04-25 01:27:31 1
專利名稱：高危型人乳頭瘤病毒檢測方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，更具體地說，涉及一種高危型人乳頭瘤病毒檢測方法及試劑盒。
背景技術：
子宮頸癌是嚴重威脅婦女生命的惡性腫瘤，一旦發生，其存活和治癒率均非常低。科學研究證實，人乳頭瘤病毒(HPV)是引發宮頸癌的必要條件，99.7％的宮頸癌病例中都發現有高危型HPV病毒的感染。由於引發宮頸癌病變的高危型HPV病毒為一類弱病毒，如能及時發現感染，及時調理治療，病毒可被控制或清除，達到防治宮頸癌的目的。因此，控制宮頸癌的發生，重在預防，關鍵在早期篩查。我國人口眾多，經濟發展不均衡，特別是在廣大農村開展HPV病毒感染的篩查，急需設備簡單、操作簡便、經濟實用的檢測技術。
HPV感染是一種通過性生活傳播的傳染病。HPV病毒有100多種亞型，在婦女生殖道中發現的有35種，能引起與宮頸癌的高危型HPV有13種16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，其中HPV 16和18型感染率最高。在撿出的所有型別中，HPV 16佔50％，HPV 18佔14％，HPV 45佔8.4％，HPV 31佔5.3％，HPV 33佔2.8％。
人乳頭狀病毒(HPV)是微小的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒直徑約60nm，無包膜，分子量為5000kD，包殼為由72個殼微粒組成對稱偏斜的20面體，中間是含有7900bp的雙鏈環狀DNA。主要病毒殼蛋白基因位於L1片段。
HPV病毒感染鱗狀上皮後，首先潛伏於基底細胞，其病毒DNA游離於宿主的細胞核內，但複製受到限制。隨著基底細胞的分化成熟上移至表皮中淺層，解除了對病毒的抑制，於是發生了複製性感染。病毒在細胞內大量複製使細胞核增大，細胞變性引起線粒體腫脹、破壞或糖原溶解消失，形成空泡細胞，最終導致細胞死亡，形成宮頸糜爛潰瘍。這種有病毒寄生、繁殖的上皮細胞並不發生惡變。HPV高危型病毒感染上皮後，其DNA則可能整合而使細胞基因發生突變，細胞異型性更為顯著，不典型增生的程度加重，範圍向表皮中淺層擴展，當累及表皮全層時便轉變為原位癌，並可進一步發展為浸潤癌。
依據高危病毒感染途徑和其DNA可能與被感染細胞基因組整合而使細胞基因發生突變的特點，採用核酸檢測技術檢測病毒基因是檢測HPV高危型病毒的唯一選擇，而衡量檢測方法的最關鍵指標是檢測技術的靈敏度和特異度。
目前比較成熟的病毒檢測技術是利用核酸探針直接與靶DNA進行分子雜交，然而在該方案中如果被檢靶DNA信號較弱，則靈敏度和特異度均較低。PCR技術也被應用於病毒檢測，但普通PCR技術由於只進行一次特異性選擇放大，因此檢測特異度不高，會出現較高比例假陽性；此外由於該技術過於靈敏，導致檢測結果不十分穩定。
最近發展的利用信號捕捉技術來檢測HPV病毒的技術，是將標記的HPVRNA探針與被檢測樣品中的靶DNA雜交，雜合體信號被抗雜合體抗體捕捉，再通過螢光或酶標系統進行放大，用發光測定儀測定發光信號，以信號強度來確定靶DNA的含量。該技術操作自動化程度比較高，但由於所有信號的放大是基於RNA探針與被檢測樣品中的靶DNA直接雜交，檢測特異度和靈敏度受到限制。
由於高危型HPV病毒多達13種亞型，因此近年來發展起來的DNA晶片技術也被用於HPV病毒的檢測。該技術的原理也是基於病毒探針與樣品中的病毒靶基因進行雜交，然後標記螢光發光，然而如果靶信號不強，其檢測的靈敏度和特異度不高。同時由於技術和條件的限制，高密度DNA晶片穩定性還得不到保證。
發明內容
本發明要解決的技術問題在於，針對上述現有PCR技術檢測特異性低、假陽性結果以及低密度DNA晶片技術不穩定性以及其為直接引物雜交，靶信號弱、背景幹擾強、解析度低的缺陷，提供一種新的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法及試劑盒。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是構造一種高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，包括以下步驟(a)採用一步法巢式PCR技術對被檢測樣品的靶DNA進行二次特異性放大；(b)採用低密度DNA晶片技術將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA與HPV高危型病毒特異片段進行雜交選擇分型。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法中，在所述步驟(a)中，還包括設計合成特異引物NP1、NP2、NP3和NP4，增加被檢樣品中病毒靶DNA的單鏈DNA擴增的比例，使被檢樣品中病毒靶DNA信號得到有效的特異性放大，其中NP3和NP4為標記引物，包括螢光標記、生物素標記、地高辛標記中的一種或多種。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法中，所述特異引物的序列分別為NP15』-aataaaccttattggttaca-3』，NP25』-actgttgttgatac-3』，NP35』-gtaaatcatattcctc-3』，NP45』-tgaaaaataaactgtaaatca-3』。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法中，所述特異引物NP1與NP4的Tm值顯著高於NP2與NP3的Tm值；且NP1、NP4，NP2、NP3均與多種高危型HPV病毒的特異序列具有高度同源性。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法中，所述步驟(b)包括將高危型HPV病毒特異片段探針固定在低密度DNA晶片上，將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA特異片段反應物與與高危型HPV病毒特異片段探針進行特異雜交選擇，檢測樣品螢光，若發光則為陽性；或者所述步驟(b)包括將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA特異片段反應物轉移到低密度DNA晶片上，與高危型HPV病毒特異片段探針進行選擇性特異結合，加相應酶反應底物後檢測樣品顯色，若顯色則為陽性。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法中，所述高危型HPV病毒片段探針5』端用氨基和8-12個胸腺嘧啶T修飾和/或加手臂分子以減少雜交時的空間位阻，所述高危型HPV病毒片段探針基因序列為
HPV165』-CATATCTACTTCAGAAAC-3』或5』-GCCATATCTACTTCAGAAACTA-3』；HPV185』-TACACAGTCTCCTGTACC-3』或5』-TCTACACAGTCTCCTGTACCTG-3』；HPV585』-AGTAPPPACTAAGGAAGG-3』或5』-GAAGTAPPPACTAAGGAAGGTA-3』HPV315』-AATTGCAAACAGTGATAC-3』或5』-GCAATTGCAAACAGTGATAC-TA3』；HPV455』-TACACAAAATCCTGTGCC-3』或5』-TCTACACAAAATCCTGTGCCAA-3』；HPV515』-CACTGCTGCGGTTTCCCC-3』或5』-GCCACTGCTGCGGTTTCCCCAA-3』；HPV525』-GGTPPPTAAAAAGCAAAG-3』或5』-GAGGTPPPTAAAAAGCAAAGCA-3』；HPV335』-AAGTAACTAGTPPPGACA-3』或5』-ACAAGTAACTAGTPPPGACACT-3』；HPV355』-TGTGTCTTCTAGTGACAG-3』或5』-GCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA-3』；HPV395』-TATAGAGTCTTCCATACC-3』或5』-TCTATAGAGTCTTCCATACCTT-3』；HPV565』-TACAGAACAGTPPPTAAG-3』或5』-GCTACAGAACAGTPPPTAAGTA-3』；HPV595』-TACTACTTCTTCTATTCC-3』或5』-TCTACTACTTCTTCTATTCCTA-3』；HPV685』-TACTGAATCAGCTGTACC-3』或5』-ACTACTGAATCAGCTGTACCAA-3。
本發明還提供一種高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒，包括有將待檢樣品進行擴增的裝置及試劑、低密度晶片、進行雜交的試劑和裝置以及酶聯和/或螢光檢測的試劑和裝置。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒中，所述將待檢樣品進行擴增的裝置及試劑包括使用一步法巢式PCR技術對被檢測樣品病毒靶DNA進行兩次特異性放大的裝置和試劑、以及合成的特異引物NP1、NP2、NP3和NP4；所述低密度晶片監控系統包括由空白點、陽性內參照、陰性內參照組成；所述進行雜交的試劑和裝置包括各種反應緩衝液、洗滌液、標記產物、高危型HPV病毒探針、高危型HPV病毒靶DNA檢測標準品、DNA晶片固相載體基片、快捷雜交系統；所述酶聯和/或螢光檢測的試劑和裝置包括螢光檢測設備和/或酶聯反應底物、各種反應緩衝液、洗滌液、顯色液。
在本發明所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒中，所述高危型HPV病毒為多種病毒亞型包括HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV45、HPV51、HPV52、HPV33、HPV35、HPV39、HPV56、HPV59、HPV68。
本發明的高危型HPV病毒檢測方法採用一步法巢式PCR技術，可同時擴增13種高危型病毒特異靶DNA片段，一次反應可檢測出多種病毒亞型。此外，本發明將被檢測樣品的靶DNA信號通過兩次特異選擇性放大，大大提高了陽性樣品的靶信號。
通過精密設計、大量實驗，本發明針對普通PCR檢測方法和DNA晶片檢測技術應用於檢測13種高危型HPV病毒存在的問題，大大的降低了背景信號的幹擾，克服了普通PCR的不足；採用低密度DNA晶片技術，不但能將特異選擇的多種高危型HPV病毒進行亞型鑑定，並可同時測定多個樣品，為了提高雜交反應靈敏度，在第二次將靶DNA信號進行放大時，採用不平衡引物技術，調整NP2與NP3引物加量的比例，使第二次特異選擇放大時，(標記的)特異性單鏈靶DNA片段分子數大幅度增加，大幅度提高其檢測的靈敏度。採用螢光和酶聯兩種標記雜交顯色技術來鑑定多種病毒亞型，可適應不同用戶的需要，適應人群篩查和不同檢測條件的需要，經濟實用。
具體實施例方式
本發明為一種巢式PCR(Nest PCR)技術與低密度晶片技術相結合的高危型人乳頭瘤病毒(HPV)檢測方法，克服了普通PCR檢測特異性低，假陽性結果多等不足及高密度DNA晶片技術檢測結果不穩定性、背景幹擾強等缺陷，具有高靈敏度、高特異度、穩定性好等優點。
本發明首先採用一步法巢式PCR技術對被檢測樣品的靶DNA進行二次特異性放大，同時採用不對稱引物及其標記技術，增加被檢樣品中病毒靶DNA的單鏈DNA擴增的比例，使被檢樣品中病毒靶DNA信號得到有效的特異性放大。然後採用低密度DNA晶片技術，將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA與多種HPV高危型病毒特異片段進行雜交選擇分型，既提高了靈敏度和特異度，又簡便實用。
在本發明中，可選擇特異設計的NP1、NP2、NP3和NP4引物與被檢測樣品靶DNA進行特異選擇擴增(其中NP3和NP4為標記引物，可以為螢光或生物素標記)。特異引物NP1、NP2、NP3和NP4合成時，NP1與NP4的Tm值顯著高於NP2與NP3的Tm值，NP1、NP4，NP2、NP3均與多種高危型HPV病毒的特異序列具有高度同源性。例如，特異引物NP1、NP2、NP3和NP4序列可分別為NP15』-aataaaccttattggttaca-3』；NP25』-actgttgttgatac-3』；NP35』-gtaaatcatattcctc-3』；NP45』-tgaaaaataaactgtaaatca-3』。
在本發明中，可將兩對特異設計的引物同時加樣，並通過設定反應條件，使兩次特異選擇在同一反應中完成。此外，還可通過調整NP2與NP3引物加量的比例，使選擇特異性單鏈靶DNA片段分子數大幅度增加，並同時對該單鏈片段進行標記。
在使用低密度DNA晶片進行雜交選擇分型時，可採用信號選擇識別及放大系統(A)將高危型HPV病毒特異片段探針固定在雜交膜或微孔板上，將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA特異片段反應物與與高危型HPV病毒特異片段探針進行特異雜交選擇。洗滌去除未結合的反應物後，檢測樣品螢光，發光為陽性，不發光為陰性。其中高危型HPV病毒特異片段探針5』端用氨基和8-12個胸腺嘧啶T修飾和/或加手臂分子以減少雜交時的空間位阻，所述高危型HPV病毒片段探針基因序列為HPV165』-CATATCTACTTCAGAAAC-3』或5』-GCCATATCTACTTCAGAAACTA-3』；HPV185』-TACACAGTCTCCTGTACC-3』或5』-TCTACACAGTCTCCTGTACCTG-3』；HPV585』-AGTAPPPACTAAGGAAGG-3』或5』-GAAGTAPPPACTAAGGAAGGTA-3』；HPV315』-AATTGCAAACAGTGATAC-3』或5』-GCAATTGCAAACAGTGATAC-TA3』；HPV455』-TACACAAAATCCTGTGCC-3』或5』-TCTACACAAAATCCTGTGCCAA-3』；HPV515』-CACTGCTGCGGTTTCCCC-3』或5』-GCCACTGCTGCGGTTTCCCCAA-3』；HPV525』-GGTPPPTAAAAAGCAAAG-3』或5』-GAGGTPPPTAAAAAGCAAAGCA-3』；
HPV335』-AAGTAACTAGTPPPGACA-3』或5』-ACAAGTAACTAGTPPPGACACT-3』；HPV355』-TGTGTCTTCTAGTGACAG-3』或5』-GCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA-3』；HPV395』-TATAGAGTCTTCCATACC-3』或5』-TCTATAGAGTCTTCCATACCTT-3』；HPV565』-TACAGAACAGTPPPTAAG-3』或5』-GCTACAGAACAGTPPPTAAGTA-3』；HPV595』-TACTACTTCTTCTATTCC-3』或5』-TCTACTACTTCTTCTATTCCTA-3』；HPV685』-TACTGAATCAGCTGTACC-3』或5』-ACTACTGAATCAGCTGTACCAA-3。
低密度DNA晶片的固相載體基片可為雜交膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、玻璃片、矽片和凝膠中的一種。
此外，在使用低密度DNA晶片進行雜交選擇分型時，還可採用信號選擇識別及放大系統(B)將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA特異片段反應物轉移到雜交膜上，與高危型HPV病毒特異片段探針進行選擇性特異結合，洗滌去除未結合的反應物，加相應酶反應底物，檢測樣品顯色。若顯色則為陽性，而不顯色則為陰性。
以下是上述HPV病毒檢測方法實施例實施例一(一)晶片的製備選擇玻片為晶片載體，用去離子水將高危型HPV病毒探針稀釋，溶解在500mmol/L pH9.0的Na2CO3/NaHCO3溶液中製成終濃度為10nmol/L的樣品，將樣品加於點樣板中，室溫下固定48～72h，晾乾備用。晶片監控系統由空白點、陽性內參照和陰性內參照組成。陽性的螢光信號平均值超過陰性點信號的三倍以上判定為陽性的標準。
(二)DNA製備採用DNA提取試劑盒進行，4℃保存。
(三)待檢樣品擴增1、取0.2mlEP管，在冰浴條件下依次加入無菌雙蒸水16.5ul，10倍PCR反應緩衝液2.5ul，dNTP 0.5ul，特異引物NP1、NP2、NP3和NP4各1ul，待檢HPV標準品1ul，Taq酶0.5ul，其中引物NP3、NP4為螢光標記引物。不加模板的擴增體系做陰性對照。
2、混勻後放入PCR儀進行擴增，擴增產物4℃保存。
(四)雜交1、取0.2ml EP管，依次加入雜交液10ul，螢光標記產物2ul，混勻，滴於晶片表面，蓋上蓋玻片。
2、置於溼雜交盒內，40-50℃下雜交1小時。
4、雜交後晶片用SSC、SDS溶液洗5分鐘，再用無菌雙蒸水衝洗乾淨。
5、室溫乾燥。
(五)掃描檢測將雜交乾燥後的晶片插入陣列掃描儀(例如GMS418 Array Scanner)掃描，以檢測結果。其中掃描發光為陽性，否則為陰性。
本發明可檢測出高危型HPV病毒的多種病毒亞型，具體包括HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV45、HPV51、HPV52、HPV33、HPV35、HPV39、HPV56、HPV59、HPV68等。
本發明的檢測方法對應的試劑盒包括有將待檢樣品進行擴增的裝置及試劑；低密度晶片以及進行雜交的試劑和裝置。在使用螢光標記時，還包括對低密度晶片進行掃描的裝置。
上述的將待檢樣品進行擴增的裝置及試劑包括使用一步法巢式PCR技術對被檢測樣品病毒靶DNA進行兩次特異性放大的裝置和試劑。此外，上述的將待檢樣品進行擴增的試劑還包括特異引物NP1、NP2、NP3、NP4、反應緩衝液、Tap酶等。
所述低密度晶片監控系統包括由空白點、陽性內參照、陰性內參照組成。
而進行雜交的試劑和裝置則包括雜交液、洗滌液、標記產物以及高危型HPV病毒探針、高危型HPV病毒靶DNA檢測標準品、DNA晶片固相載體基片、快捷雜交系統等。
所述酶聯和螢光檢測的試劑和裝置包括螢光檢測設備、酶聯反應底物、各種反應緩衝液、洗滌液、顯色液。對低密度晶片進行掃描的裝置可以為陣列掃描儀(例如GMS418 Array Scanner)。
應用本發明提供的高危型HPV病毒檢測方法製備的新型高危型HPV病毒檢測試劑盒採用組合式加樣及快速、簡便雜交系統，使經兩次特異選擇性放大的靶DNA信號快速與多種高危型HPV病毒探針進行雜交反應，使檢測程序簡便、快速。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應該以權利要求的保護範圍為準。
權利要求
1.一種高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟(a)採用一步法巢式PCR技術對被檢測樣品的靶DNA進行二次特異性放大；(b)採用低密度DNA晶片技術將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA與HPV高危型病毒特異片段探針進行雜交選擇分型。
2.根據權利要求1所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，在所述步驟(a)中，還包括設計合成特異引物NP1、NP2、NP3和NP4，增加被檢樣品中病毒靶DNA的單鏈DNA擴增的比例，使被檢樣品中病毒靶DNA信號得到有效的特異性放大，其中NP3和NP4為標記引物，包括螢光標記、生物素標記、地高辛標記中的一種或多種。
3.根據權利要求2所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，所述特異引物的序列分別為NP15』-aataaaccttattggttaca-3』，NP25』-actgttgttgatac-3』，NP35』-gtaaatcatattcctc-3』，NP45』-tgaaaaataaactgtaaatca-3』。
4.根據權利要求2所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，所述特異引物NP1與NP4的Tm值顯著高於NP2與NP3的Tm值；且NP1、NP4，NP2、NP3均與多種高危型HPV病毒的特異序列具有高度同源性。
5.根據權利要求1所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，所述步驟(b)包括將高危型HPV病毒特異片段探針固定在低密度DNA晶片上，將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA特異片段反應物與探針進行特異雜交選擇，檢測樣品螢光，若發光則為陽性。
6.根據權利要求1所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，所述步驟(b)包括將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA特異片段反應物轉移到低密度DNA晶片上，與高危型HPV病毒特異片段探針進行選擇性特異結合，加相應酶反應底物後檢測樣品顯色，若顯色則為陽性。
7.根據權利要求5或6所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，所述高危型HPV病毒片段探針5』端用氨基和8-12個胸腺嘧啶T修飾和/或加手臂分子以減少雜交時的空間位阻，所述高危型HPV病毒片段探針基因序列為HPV165』-CATATCTACTTCAGAAAC-3』或 5』-GCCATATCTACTTCAGAAACTA-3』；HPV185』-TACACAGTCTCCTGTACC-3』或 5』-TCTACACAGTCTCCTGTACCTG-3』；HPV585』-AGTAPPPACTAAGGAAGG-3』或 5』-GAAGTAPPPACTAAGGAAGGTA-3』；HPV315』-AATTGCAAACAGTGATAC-3』或 5』-GCAATTGCAAACAGTGATAC-TA3』；HPV455』-TACACAAAATCCTGTGCC-3』或 5』-TCTACACAAAATCCTGTGCCAA-3』；HPV515』-CACTGCTGCGGTTTCCCC-3』或5』-GCCACTGCTGCGGTTTCCCCAA-3』；HPV525』-GGTPPPTAAAAAGCAAAG-3』或5』-GAGGTPPPTAAAAAGCAAAGCA-3』；HPV335』-AAGTAACTAGTPPPGACA-3』或5』-ACAAGTAACTAGTPPPGACACT-3』；HPV355』-TGTGTCTTCTAGTGACAG-3』或5』-GCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA-3』；HPV395』-TATAGAGTCTTCCATACC-3』或5』-TCTATAGAGTCTTCCATACCTT-3』；HPV565』-TACAGAACAGTPPPTAAG-3』或5』-GCTACAGAACAGTPPPTAAGTA-3』；HPV595』-TACTACTTCTTCTATTCC-3』或5』-TCTACTACTTCTTCTATTCCTA-3』；HPV685』-TACTGAATCAGCTGTACC-3』或5』-ACTACTGAATCAGCTGTACCAA-3。
8.一種高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒，其特徵在於，包括有將待檢樣品進行擴增的裝置及試劑、低密度晶片、進行雜交的試劑和裝置以及酶聯和/或螢光檢測的試劑和裝置。
9.根據權利要求8所述的高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒，其特徵在於，所述將待檢樣品進行擴增的裝置及試劑包括使用一步法巢式PCR技術對被檢測樣品病毒靶DNA進行兩次特異性放大的裝置和試劑、以及合成的特異引物NP1、NP2、NP3和NP4；所述低密度晶片監控系統包括由空白點、陽性內參照、陰性內參照組成；所述進行雜交及結果檢測的試劑和裝置包括各種反應緩衝液、洗滌液、標記產物以及高危型HPV病毒探針、高危型HPV病毒靶DNA檢測標準品、DNA晶片固相載體基片、快捷雜交系統；所述酶聯和/或螢光檢測的試劑和裝置包括螢光檢測設備和/或酶聯反應底物、各種反應緩衝液、洗滌液、顯色液。
10.一種高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，其特徵在於，所述高危型HPV病毒為多種病毒亞型包括HPV16、HPV18、HPV58、HPV31、HPV45、HPV51、HPV52、HPV33、HPV35、HPV39、HPV56、HPV59、HPV68。
全文摘要
本發明涉及一種高危型人乳頭瘤病毒檢測方法，包括以下步驟(a)設計合成合適的特異引物，採用一步法巢式PCR(Nest PCR)技術對被檢測樣品的靶DNA進行二次特異性放大；(b)結合低密度DNA晶片技術將經兩次特異選擇放大的被檢測樣品靶DNA與HPV高危型病毒特異片段進行雜交選擇分型，採用螢光檢測或直接顯色信號識別。本發明還提供一種對應的試劑盒。本發明採用一步法巢式PCR技術與低密度晶片技術相結合，可同時擴增13種高危型病毒特異靶DNA片段，一次反應可檢測出多種病毒亞型，具有快速高效、靈敏度特異度高、經濟實用等優點，適用於高危型HPV病毒感染檢測和人群HPV感染篩查使用。
文檔編號C12Q1/68GK101082064SQ20061006104
公開日2007年12月5日 申請日期2006年6月2日 優先權日2006年6月2日
發明者張春發, 鄧柳紅 申請人:深圳市隆陽生物科技有限公司