一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌及其應用的製作方法

2023-04-25 01:46:31 6

專利名稱：一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株硫桿菌及其應用，尤其涉及一株具有較高亞鐵氧化能力的基因工 程菌嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其構建與應用。
背景技術：
嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)是在細菌浸礦過程中 起關鍵作用的菌種之一。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在Fe2+基質中生長時，Fe2+被快速氧化成 Fe3+提供電子進入細菌呼吸鏈，而Fe3+作為一種強氧化劑在生物浸礦等過程中起著關鍵的 作用。因此，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化Fe2+離子的能力是衡量其浸礦能力的一項重要指標。 經檢索目前還沒有任何關於以轉基因的方式來提高嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Fe2+離子氧化能 力的報導。

發明內容
針對現有技術中對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌Fe2+離子氧化能力遺傳改良方法的空白， 本發明要解決的問題是通過轉基因的方法將氧化亞鐵電子傳遞鏈蛋白CYCl基因導入嗜酸 氧化亞鐵硫桿菌提供一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌以提高其氧化Fe2+離子的能力， 使嗜酸氧化亞鐵硫桿菌更高效地發揮生物冶金的功能。本發明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌為高亞鐵氧化活性 A. ferrooxidanspTCYCl,該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已於2009年12月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(中國科學院微生物研究所，中國北京)，保藏中心編號為CGMCC NO. 3549。本發明的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)經鑑定，具有 如下生物學特徵革蘭氏陰性，有鞭毛，好氧，嗜酸，為化能自養細菌，短杆狀，大小為(0. 3 0. 5) μπιΧ (1 2) μπι ；能夠以二價鐵、元素硫或者還原態硫複合物作為能源，在含有硫酸亞鐵 和硫代硫酸鈉的固體培養基上能生長；菌落形態不規則，凹陷，邊緣呈鋸齒狀，酒紅色，不透 明；生長最適溫度為25-30°C，生長最適pH為1.5 2. 5。本發明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的構建及在亞鐵培養基中的生長及 應用，涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC 19859 (Acidithiobacillus ferrooxidansATCC19859) ； ff 胃 DH5a (Escherica coli DH5 α )。(2)氧化亞鐵電子傳遞鏈蛋白CYCl高效表達載體的構建CYC1蛋白編碼基因克隆 自嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859染色體DNA，所用引物為上遊弓丨物cyclEU(GTACGAATTCAGGAGCCGATGCCATGACGACATACTT)，下遊弓丨物 eye IXD (CCTCTCTAGATTA GTGGTGGTGGTGGTGGTG CAACGATGAAAGATAAGCCGCCACA)。上遊引物引入EcoR I酶切位點，下遊引物引入Xba I酶切位點以及6XHis標籤以方便檢測cycl基因在細胞內的表達情況。將擴增產物進行EcoR I和Xba I雙酶切，回 收744bp大小的片段；同時對可移動性的質粒載體PJRD215進行EcoRI和XbaI雙酶切，回 收約IOkb的載體片段；用T4連接酶將這兩個片段連接，以連接液轉化大腸桿菌DH5 α，在 含有100yg/ml鏈黴素(Sm)的LB固體平板上37°C靜置培養，進行轉化子的篩選，挑取轉化 子進行質粒提取、酶切驗證，構建出中間質粒PCYCl。以質粒 pMMB24DNA 為模板，設計引物 Ptae-I (5，-GTACAAGCTTATCGACTGCACGGTGCAC C-3，)和 Pta。-2 (5，-GTACGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3，)擴增不含調控區域的 Tac 啟動 子，命名為Ptac。擴增產物經HindIII和EcoR I雙酶切，連接至pCYCl質粒中cycl基因上 遊HindlIl-Ec0R I位點，連接液轉化大腸桿菌DH5 α。在含有Sm(100 μ g/ml)的LB固體平 板上37°C靜置培養，進行轉化子的篩選，挑取轉化子進行質粒提取、酶切驗證，同時對所插 入的外源基因Ptac以及cycl基因進行測序驗證，構建了可轉移質粒pTCYCl。從經測序驗 證準確無誤的轉化子中提取質粒PTCYC1，轉化至含RP4質粒的大腸桿菌DH5 α，命名為大腸 桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)，為下一步的接合轉移實驗作準備。(3)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的製備以大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)作 為供體菌，嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859作為受體菌在濾膜上進行接合轉移。供體菌和 受體菌分別離心收集菌體，洗滌液洗滌至少三次，用洗滌液分別懸浮供體菌和受體菌至相 同密度，然後按一定比例混合後取適量的菌懸液(0. 1 0. 3ml)加到無菌硝酸纖維素濾膜 上，濾膜置於接合平板上30 35°C培養24 72h，使之接合。取濾膜用Iml無機鹽洗滌 液洗下菌體，稀釋成一系列不同濃度=IoqUo-1UO-2UO-3UO-4UO-5UO-6UO-7,分別取100 μ 1 塗布含相應抗生素的2 2選擇平板及相應的不含抗生素的對照平板。同時在選擇性平板 上分別塗布供體菌和受體菌作為對照。放置25 30°C溫箱中培養7 10d，直至板上形成 明顯菌落。(4)接合子的種子培養挑取步驟(3)中選擇性平板上形成的接合子菌落，在無菌 條件下用接種環接於30mL 9K-FeS04培養基(Sm 300 μ g/ml)中，25_30°C條件下，160rpm震 蕩培養3 5d，製得種子液；(5)接合轉移子擴大培養以5 %體積比的接種量，將種子液接種於 200mL9K-FeS04 培養基(Sm 300 μ g/ml))中，25_30°C條件下，160rpm 振蕩培養 3 5d ；(6)接合轉移子的質粒提取驗證將步驟(5)所得的培養液真空抽濾出去培養液 中的高鐵沉澱；離心收集菌體，用9K無機鹽溶液洗滌至少3次直至菌泥中沒有可見的高鐵 沉澱，再用PBS緩衝液洗菌體2次，然後按照常規的鹼裂解法進行質粒抽提。質粒提取驗證結果陽性的接合子命名為A. ferrooxidans pTCYCl ；(7) A. ferrooxidans pTCYCl中重組質粒所攜帶cycl基因在嗜酸氧化亞鐵硫 桿菌中的表達將步驟(5)所得的培養液真空抽濾出去培養液中的高鐵沉澱；離心收集 菌體，用9K無機鹽溶液洗滌至少3次直至菌泥中沒有可見的高鐵沉澱，收集足夠量的 A. ferrooxidans pTCYCl菌體，洗滌後重懸於裂解緩衝液，超聲破碎細胞。經Bradford法測 定樣品中的蛋白濃度後，取等量蛋白與等體積的2XLaemmli緩衝液混合，煮沸5min後進行 Western blotting檢測，驗證質粒pTCYCl上所攜帶cycl基因是否能在嗜酸氧化亞鐵硫杆 菌中正常表達；(8)基因工程菌A. ferrooxidans pTCYCl亞鐵離子氧化活性測定將步驟(5)所得的培養液真空抽濾出去培養液中的高鐵沉澱；離心收集菌體，用TE緩衝液洗菌體三次後 將重懸於TE緩衝液中。取細菌懸浮液加入反應緩衝液中，30°C振蕩培養，在培養的不同時 間取培養液以鄰菲囉啉法測定培養液中剩餘Fe2+的濃度；(9)重組質粒pTCYCl在A. ferrooxidans ATCC19859的穩定性檢測在固體平板 上挑取A. ferrooxidans陽性接合轉移子菌落一個，接種到不含有篩選標記的9K_FeS04液 體培養基中，在沒有選擇壓力條件下30°C振蕩培養5d，然後按照1 1000的比例轉接，如 此連續轉接5次(> 50代)，稀釋後分別塗布含有抗生素的2 2選擇平板以及不含抗生 素的2 2固體平板，25-35°C培養10d。通過計算抗生素抗性菌落佔總菌落的比例，測出重 組質粒在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中的穩定性。其中，步驟(3)中所述的菌體接合培養時間優選是48h，接合培養溫度優選30°C ； 固體培養溫度優選是30°C，培養時間是7d ；其中，步驟(4)、(5)中所述的菌體培養溫度優選是30°C ；上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC 19859 (Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859)購自美國標準生物品收藏中心；大腸桿菌DH5a (Escherica coll DH5 α )購自 原平皓(天津)生物技術有限公司。上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的製備中，PJRD215質粒構建見Davison J, Heusterspreute Μ, Chevalier N, Ha-Thi V, Brunei F. Vectors with restriction site banks. V. pJRD215, a wide-host-range cosmid vector with multiple cloning sites. Gene. 1987, 51 (2-3) 275-80 ；pMMB24 M14I^lMB Miroslawa Μ. Bagdasarian, Egon Amann, Rudo1fLurz, Beate Ruckert and Michael Bagdasarian. Activity of the hybrid trp-lac(tac)promoter ofEscherichia coli in Pseudomonas putida. Construction of broad-host-range, controlled-expression vectors, 1983, Gene, 26 :273_282 ;RP4 質粒 I^jMB Datta, N. ， R. W. Hedges, Ε. J. Shaw, R. B. Sykes and M. H. Richmond. Properties of an R factor fromPseudomonas aeruginosa, 1971, J. Bacteriol,108 :1244_1249。上述質粒的構建中，培養大腸桿菌DH5 α使用的LB液體培養基，配方為每IOOOml蒸餾水中添加蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用2N NaOH溶液調pH 至7. O 7. 5，15磅/寸2高壓蒸汽滅菌20min，37°C培養。上述LB固體培養基為上述LB液體培養基中加入1. 8%瓊脂粉，pH 7. O 7. 5。在上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌培養使用的液體9K_FeS04無機鹽培養基，配方為每IOOOml 蒸餾水中添加(NH4) 2S043g，K2HPO4O. 5g，KCl 0. lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g， Ca(NO3)2O. 01 g，用濃 H2SO4 調 pH 2. 0，121°C條件下滅菌 20min ；配置 44. 8% 的 FeSO4. 7H20 濃 溶液，過濾除菌，使用前按按1 9的比例與9K無機鹽培養液混合。上述2 2固體培養基配方為A :2g Na2S2O3 · 5H20 溶解於 IOml 蒸餾水中；B :2g FeSO4. 7H20溶解於IOmlpH值預調為2. 0的酸性水中；C 4. 5g (NH4)2SO4jO. 15g KCl，0. 75g MgSO4 · 7H20 溶解於 500ml 蒸餾水中；D :6g瓊脂溶於480ml蒸餾水；其中，組分A與B過濾除菌，C與D 121°C條件下滅菌20min，待C與D組分冷卻至 45°C左右時，將四種組分混合，傾倒平板備用。
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上述2 2接合培養基為上述2 2固體培養基中加入0. 的酵母粉，pH 4. 8 5. 0。其中，步驟(3)中所述的菌體洗滌液為上述2 2培養基C組分中加入等體積的 蒸餾水作為菌體洗滌液。上述步驟(6)中的PBS緩衝液配方為每IOOOml 蒸餾水中添加=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4L 44g, KH2PO4O. 24g，用 HCl 調pH值至7. 4，加H2O定容至1L，15磅/cm2,滅菌20min。上述步驟(7)中的裂解液配方為每1000 毫升蒸溜水各成分含量為50mmol/L Tris-Cl (pH 8. 0), 150mmol/L NaCl, 100mg/L苯甲基磺醯氟(PMSF)。上述步驟(7)中2 X Laemmli緩衝液配方為4% SDS，29%甘油，10% β -巰基乙醇，0. 04%溴酚藍；0. 125Μ Tris-HCl ；上述步驟(8)中的TE緩衝液配方為10mM Tris-HCl, ImM EDTA0本發明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井水 的處理以及汙泥中重金屬的去除中的應用。實驗證實本發明所述的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌(A. ferrooxidans pTCYCl)與野生型嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(A. ferrooxidans ATCC19859)相比較，其氧化亞鐵 離子的能力提高了 13%，這對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在生物浸出中的應用有著重要的意義。 此外，因嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在除生物浸出以外其它方面的應用，如煙氣脫硫、酸性礦井水 的處理以及汙泥中重金屬的去除等，也是基於嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化二價鐵離子的能 力，因此該發明具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式實施例1 重組質粒pTCYCl的構建及鑑定。(1)將含有cycl基因以及6XHis標籤編碼基因與穿梭性質粒PJRD215連接後，轉 化大腸桿菌DH5 α，在含有Km的LB固體平板篩選得到含有Km抗性質粒的大腸桿菌DH5 α， 經提取質粒酶切驗證，轉化子中攜帶的質粒確實含有插入片段。(2)將Ptac基因片段與中間載體pCYCl連接後，轉化大腸桿菌DH5 α，在含有Km 的LB固體平板篩選得到含有Km抗性質粒的大腸桿菌DH5 α，經提取質粒酶切驗證，轉化子 中攜帶的質粒確實含有插入片段。將驗證過的陽性克隆進行測序，選取測序正確的克隆，提 取質粒，轉化至大腸桿菌DH5 α (RP4)在含有Sm的LB固體平板上篩選得到接合轉移所用的 供體菌大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)。上述LB篩選培養基中，卡那黴素(Km)或鏈黴素(Sm)的篩選濃度為100 μ g/ml。實施例2 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的構建及鑑定。(1)分別收集指數生長中期的大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl)作為供體菌，指數生 長中期的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859作為受體菌，無機鹽洗滌液洗滌3次，按相同菌體 濃度懸浮於洗滌液中備用。(2)按供體菌與受體菌的體積比為1 1，將懸浮液進行混合，取200 μ 1放於孔徑 為0.45 μ m的硝酸纖維素濾膜(光面朝上)上，30°C於接合平板上培養48h;lml洗滌液將濾膜上的菌體洗下，稀釋為10-1、10-2、10-3、10_4，分別取10(^1塗布2 2篩選平板，30°C靜 置培養10d。篩選平板中抗生素Km濃度為200 μ g/ml。(3)挑取篩選平板上的抗性菌落，接種於30ml9K-FeS04培養基(Km 300 μ g/ml) 中，30°C條件下，160rpm震蕩培養5d.，製得種子液；以5%體積比的接種量，將種子液接種 於200mL 9K-FeS04培養基(Km 300 μ g/ml))中，30°C條件下，160rpm震蕩培養4d後收集菌 液進行質粒提取驗證。(4)經質粒提取驗證，從篩選平板上挑取的接合子能夠提取出分子量大小正確的 質粒，而從作為對照的A. ferrooxidans ATCC19859中則未能提取出質粒。結果表明，重組質粒通過濾膜接合的方式成功地從大腸桿菌DH5 α (RP4/pTCYCl) 轉移至了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌ATCC19859中，提示已成功獲得了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因 工禾呈菌 A. ferrooxidans pTCYCl。實施例3 重組質粒pTCYCl所攜帶cycl基因在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中的表達(1)菌種選擇:A. ferrooxidans pTCYCl, A. ferrooxidans ATCC19859 ；(2)種子培養將A. ferrooxidans pTCYC 1 及A. ferrooxidans ATCCl9859在無菌 條件下用接種環接一環於30mL QK-FeSO4液體培養基中，30°C條件下，振蕩培養至穩定期， 製得種子液；(3)擴大培養以5 %的體積比的接種量，將兩株菌的種子液接種於 200mL9K-FeS0df體培養基中，30°C條件下，振蕩培養至穩定期(約4d)；(4)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白SDS-PAGE電泳將步驟(3)中得到的培養液抽濾 去除高鐵沉澱，離心收集菌體，將菌體重懸於裂解緩衝液中，超聲破碎細胞，待樣品中完整 細胞的數目不超過細胞總數的10%時(鏡檢確定)，停止超聲，13000rpm離心IOmin去除細 胞碎片。Bradford法測定 A. ferrooxidans pTCYCl 及 A. ferrooxidansATCC19859 樣品中蛋 白濃度後，取相同量的蛋白以15%的變性聚丙烯醯胺凝膠分離；(5)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白的Western-blotting檢測將步驟(4)中在聚丙 烯醯胺凝膠中得到有效分離的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白轉印至PVDF膜上，分別進行一 抗(Anti-His Antibody)及二抗(Poly Rabbit Anti-mouse immunoglobulins/HRP)孵育 後，進行ECL發光檢測；(6)經Western-blotting檢測驗證，質粒pTCYCl上所攜帶的cycl基因在嗜酸氧 化亞鐵硫桿菌中得到了有效的表達。實施例4 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的菌種鑑定及保藏信息。本發明構建的高亞鐵氧化活性A. ferrooxidans pTCYCl菌株已於2009年12月28 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國科學院微生物研究所，中 國北京)，保藏中心編號為=CGMCC N0. 3549。上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，經鑑定，具有如下生物學特徵革蘭氏陰性，有鞭毛，好氧，嗜酸，為化能自養細菌，短杆狀，大小為(0. 3 0. 5) μπιΧ (1 2) μπι ；能夠以二價鐵、元素硫或者還原態硫複合物作為能源，在含有硫酸亞鐵 和硫代硫酸鈉的固體培養基上能生長；菌落形態不規則，凹陷，邊緣呈鋸齒狀，酒紅色，不透 明；生長最適溫度為25-30°C，生長最適pH為1.5 2. 5。實施例5 :A. ferrooxidans pTCYCl亞鐵離子氧化活性的測定
(1)菌種選擇:A. ferrooxidans pTCYCl, A. ferrooxidans ATCC19859 ；(2)種子培養將 A. ferrooxidans pTCYCl 及 A. ferrooxidans ATCC19859 在無菌 條件下用接種環接一環於30mL QK-FeSO4液體培養基中，30°C條件下，振蕩培養至穩定期， 製得種子液；(3)擴大培養以5 %的體積比的接種量，將兩株菌的種子液接種於 200mL9K-FeS0df體培養基中，30°C條件下，振蕩培養至穩定期(約4d)；(4)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌亞鐵氧化活性的測定將步驟(3)中得到的培養液抽濾 去除高鐵沉澱，離心收集菌體，用TE緩衝液懸浮至相同濃度，取一定量的細胞懸液抽提細 胞總蛋白，以bradford法進行蛋白定量。取相同體積懸浮接入3ml反應緩衝液中，在反應 不同時間從反應體系中取出0. 2ml反應液，12000g離心2min後，確定反應液中剩餘的Fe2+ 濃度，根據Fe2+濃度的變化確定嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的亞鐵氧化酶活性；(5)本實驗所構建的基因工程菌A. ferrooxidans pTCYCl較野生型 A. ferrOOXidansATCC19859，亞鐵氧化能力得到了一定的提高實驗所測得的基因工程菌 A. ferrooxidansATCC19859 亞鐵氧化活性為 5. 3ymol Fe2+ oxidized/mg Protein/min，而 基因工程菌亞鐵氧化活性為6. 0 μ mol Fe2+oxidized/mg Protein/min,相對於野生型，本實 驗所構建的基因工程菌亞鐵氧化活性提高了 13%。上述A. ferrooxidans pTCYCl在進行種子培養及擴大培養時，培養基中加入濃度 為300 μ g/ml的卡那黴素(Km)。
權利要求
一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌，為高亞鐵氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特徵在於該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，菌株已於2009年12月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心編號為CGMCC NO.3549。
2.權利要求1所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井 水的處理以及汙泥中重金屬的去除中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌，為高亞鐵氧化活性A.ferrooxidans pTCYC1；其特徵在於該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)，菌株已於2009年12月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心編號為CGMCC NO.3549。本發明的基因工程菌較野生型的氧化亞鐵硫桿菌在亞鐵氧化活性方面有一定的提高，且性能穩定，在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井水的處理以及汙泥中重金屬的去除等領域具有很大的應用前景。
文檔編號C22B3/18GK101935621SQ20101010537
公開日2011年1月5日 申請日期2010年2月4日 優先權日2010年2月4日
發明者劉瑋, 劉相梅, 林建強, 林建群, 顏望明 申請人:山東大學