針對人tweak的抗體及其應用的製作方法
2023-04-24 09:46:26
專利名稱：針對人tweak的抗體及其應用的製作方法
針對人TWEAK的抗體及其應用 本發明涉及針對人TWEAK的抗體(TWEAK抗體)，用於製備它們的方法，包含所述抗體的藥物組合物，及其應用。
背景技術：
人TWEAK (UniProtKB 043508，程序性細胞死亡的TNF-相關弱誘導物)是一種細胞表面相關的II型跨膜蛋白質。在Chich印ortiche，Y.等，J. Biol. Chem. (生物化學雜誌)272 (1997) 32401-32410 ；Marsters, S. A.等，Curr. Biol.(目前生物學)8 (1998) 525-528 ；Lynch, C. N 等，J. Biol. Chem.(生物化學雜誌)274 (1999) 8455-8459 中對TWEAK進行了描述。TWEAK的活性形式是可溶的同源三聚體。人和鼠TWEAK在受體結合結構域中顯示93%的序列同一性。TWEAK受體而14(成纖維細胞生長因子可誘導的 HkDa蛋白)是1 個胺基酸的I型跨膜蛋白，其由在配體結合結構域中的一個單一富含半胱氨酸的結構域組成。TWEAK的信號傳導通過NF-KB途徑激活發生。TWEAK mRNA在多種組織中表達並且在大多數重要器官如心臟、腦、骨骼肌和胰腺，與免疫系統相關的組織如脾、淋巴結和胸腺中都有發現。已經在心臟、腦、肺、胎盤、血管EC和平滑肌細胞中檢測到 FnHmRNA0無TWEAK和無而14_的敲除小鼠是有活力的，健康的和能育的，具有更多天然殺傷細胞，並且顯示增強的先天炎性反應。TWEAK涉及程序性細胞死亡、增殖、血管發生、缺血半影區(ischemic penumbra)、腦水腫、多發性硬化。抗-TffEAK抗體在 WO 1998/005783，WO 2000/042073，WO 2003/086311，WO 2006/130429， WO 2006/130374, WO 2006/122187， WO 2006/089095, WO 2006/088890, WO 2006/052926 中提及。發明概述本發明包括結合於人TWEAK的抗體，其特徵在於包含選自由SEQ ID而8，16或對組成的組中的⑶R3區(⑶R3H)作為重鏈可變結構域。本發明包括包含SEQ ID NO :1的可變輕鏈和SEQ ID NO :5的可變重鏈的抗體的嵌合的、人源化的或T細胞表位缺失變體，含有SEQ ID NO 9的可變輕鏈和SEQ ID NO 13的可變重鏈的抗體的嵌合的、人源化的或T細胞表位缺失變體，或含有SEQ ID NO 17的可變輕鏈和SEQ ID NO 21的可變重鏈的抗體的嵌合的、人源化的或T細胞表位缺失變體。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 6的CDR1H，SEQ ID NO 7的CDR2H和 SEQ ID NO 8 的 CDR3H。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 14的CDR1H，SEQ ID NO 15的CDR2H 和 SEQ ID NO 16 的 CDR3H。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 22的CDR1H，SEQ ID NO 23的CDR2H 和 SEQ ID NO 24 的 CDR3H。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 22的CDR1H，SEQ ID NO 74的CDR2H 和 SEQ ID NO 24 的 CDR3H。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 22的CDR1H，SEQ ID NO 75的CDR2H 和 SEQ ID NO 24 的 CDR3H。
優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO :6的CDR1H，SEQ ID NO :7的CDR2H， SEQ ID NO 8 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 2 的 CDR1L，SEQ ID NO 3 的 CDR2L，SEQ ID NO 4 的 CDR3L。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 14的CDR1H，SEQ ID NO 15的CDR2H， SEQ ID NO :16 的 CDR3H和 SEQ ID NO 10 的 CDR1L，SEQ ID NO :11 的 CDR2L，SEQ ID NO 12 的 CDR3L。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 22的CDR1H，SEQ ID NO 23的CDR2H， SEQ ID NO :24 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 18 的 CDR1L，SEQ ID NO 19 的 CDR2L，SEQ ID NO 20 的 CDR3L。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 22的CDR1H，SEQ ID NO 74的CDR2H， SEQ ID NO :24 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 18 的 CDR1L，SEQ ID NO 19 的 CDR2L，SEQ ID NO 20 的 CDR3L。優選地，所述抗體特徵在於包含SEQ ID NO 22的CDR1H，SEQ ID NO 75的CDR2H， SEQ ID NO :24 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 18 的 CDR1L，SEQ ID NO 19 的 CDR2L，SEQ ID NO 20 的 CDR3L。優選地，所述抗體特徵在於包含選自由SEQ ID NO :1，9，17，32，33，34，35，44，45， 46，47，55，56，57，58，59，或60組成的組中的序列作為輕鏈可變結構域序列。優選地，所述抗體特徵在於包含選自由SEQ ID NO :5，13，21，36，37，38，39，40，41， 42，43，48，49，50，51，52，53，54，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，或 73 組成的組
中的序列作為重鏈可變結構域序列。優選地，所述抗體特徵在於包含選自由SEQ ID NO :1，32，33，34，35組成的組的序列作為輕鏈可變結構域序列和選自由SEQ ID NO 5，36，37，38，39，40，41，42，43組成的組的序列作為重鏈可變結構域序列。優選地，所述抗體特徵在於包含選自由SEQ ID NO :9，44，45，46，47組成的組的序列作為輕鏈可變結構域序列，和選自由SEQ ID NO 13，48，49，50，51，52，53，54組成的組的序列作為重鏈可變結構域序列。優選地，所述抗體特徵在於包含選自由SEQ ID NO :17，55，56，57，58，59，60組成的組中的序列作為輕鏈可變結構域序列，和選自由SEQ ID NO :21，61，62，63，64，65，66，67， 68，69，70，71，72，73組成的組中的序列作為重鏈可變結構域序列。優選的是選自由下列各項組成的組的輕鏈和重鏈可變鏈的組合1/5，1/36，1/37， 1/381/39，1/40，1/41，1/42，1/43，32/5，32/36，32/37，32/38，32/39，32/40，32/41，32/42， 32/43，33/5，33/36，33/37，33/38，33/39，33/40，33/41，33/42，33/43，34/5，34/36，34/37， 34/3834/39，34/40，34/41，34/42，34/43，35/5，35/36，35/37，35/38，35/39，35/40，35/41， 35/42,35/43 ；9/13，9/48，9/49 ；9/50，9/51，9/52，9/53，9/54，44/13，44/48，44/49 ；44/50， 44/51,44/52,44/53,44/54,45/13,45/48, 45/49 ；45/50,45/51,45/52,45/53,45/54, 46/13,46/48,46/49 ；46/50,46/51,46/52,46/53,46/54,47/13,47/48,47/49 ；47/50, 47/51,47/52,47/53,47/54 ； 17/21,17/61,17/62,17/63,17/64,17/65,17/66,17/67, 17/68，17/69，17/70，17/71，17/72，17/73，55/21，55/61，55/62，55/63，55/64，55/65， 55/66，55/67，55/68，55/69，55/70，55/71，55/72，55/73，56/21，56/61，56/62，56/63，56/64，56/65，56/66，56/67，56/68，56/69，56/70，56/71，56/72，56/73，57/21，57/61， 57/62，57/63，57/64，57/65，57/66，57/67，57/68，57/69，57/70，57/71，57/72，57/73， 58/21，58/61，58/62，58/63，58/64，58/65，58/66，58/67，58/68，58/69，58/70，58/71， 58/72，58/73，59/21，59/61，59/62，59/63，59/64，59/65，59/66，59/67，59/68，59/69， 59/70,59/71,59/72,59/73,60/21,60/61,60/62,60/63,60/64,60/65,60/66,60/67, 60/68，60/69，60/70，60/71，60/72，60/73(例如，47/52 意為包含 SEQ ID NO :47 的可變輕鏈和SEQ ID NO 52的可變重鏈的抗體)。尤其優選的是根據本發明的抗體，其包含選自由下列各項組成的組中的可變鏈組合SEQ ID NO 57和SEQ ID NO 68的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 57和SEQ ID NO 69的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 57和SEQ ID NO 70的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID N0:57和SEQ ID NO :71的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID N0:57禾口 SEQ ID NO 72的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 57和SEQID NO 73的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 68的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 58和 SEQ ID NO 69的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO :58和SEQ ID NO 70的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 71的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈；SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 72的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈，SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 73的輕鏈可變鏈和重鏈可變鏈。本發明的另一個實施方案是選自由SEQ ID NO :32，33，34，35，36，37，38，39，40， 41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65， 66，67，68，69，70，71，72，73的可變重鏈或輕鏈組成的組中的可變重鏈或輕鏈。將所述可變重鏈或輕鏈用作產生根據本發明的抗體的中間體。優選地，結合TWEAK並且特徵在於上述胺基酸序列和胺基酸序列片段的抗體是人 IgGl同種型。根據本發明所述的抗體顯示通過Biacore測量的，在25°C，可溶性人TWEAK(胺基酸99-249)和抗體之間的複合物的半衰期為53分鐘以下(優選地，20分鐘以下，尤其優選地，10-20分鐘)。尤其優選將顯示這樣的低半衰期的抗-TWEAK抗體用於治療腫瘤疾病。根據本發明的抗體特異性結合於人TWEAK並且抑制人TWEAK和而14之間的相互作用，IC5tl值為15ng/ml以下。所述抗體優選地是人IgGl同種型。優選地，所述抗體是人源化的抗體或人抗體。用於本文時，IC5tl意為阻斷人TWEAK和而14之間50%的相互作用的抗體的量。根據本發明的抗體優選地顯示通過Biacore測量的，在25°C，可溶性鼠TWEAK(胺基酸81-22 和抗體之間的複合物的半衰期為70分鐘以下(優選地40-70分鐘)，結合鼠 TWEAK,並且抑制鼠TWEAK和而14之間的相互作用，IC50值為40ng/ml以下。本發明的另一個實施方案是包含本發明所述的抗體的藥物組合物。本發明的另一個實施方案是本發明所述的抗體用於製備藥物組合物的應用。本發明的另一個實施方案是將本發明所述的抗體用於治療癌症，優選地用於治療結腸癌、肺癌或胰腺癌的應用。本發明的另一個實施方案是用於製備包含根據本發明的抗體的藥物組合物的方法。
本發明的另一個實施方案是編碼根據本發明的抗體的重鏈可變結構域和/或輕鏈可變結構域的核酸。本發明還提供包含本發明的核酸的表達載體，其能夠在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達所述核酸，以及包含所述載體用於重組產生所述抗體的宿主細胞。本發明還包括含有本發明的載體的原核宿主細胞或真核宿主細胞。本發明還包括用於生產根據本發明的重組人抗體或人源化抗體的方法，其特徵在於在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達根據本發明的核酸並且從所述細胞或細胞培養上清液中回收所述抗體。本發明還包括可通過所述重組方法獲得的抗體。根據本發明的抗體對於需要TWEAK靶向治療的患者顯示益處。根據本發明的抗體具有新的和創造性的性質，導致對於患有腫瘤疾病的患者，尤其是患有結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者的益處。本發明還提供用於治療患有癌症，尤其是結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者的方法，所述方法包括向診斷患有所述疾病(並且因此需要所述療法)的患者施用有效量的結合根據本發明的TWEAK的抗體。所述抗體優選地在藥物組合物中進行施用。本發明的另一個實施方案是用於治療患有癌症的患者，尤其是患有結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者的方法，所述方法特徵在於向患者施用根據本發明的抗體。本發明還包括根據本發明的抗體用於治療患有癌症，尤其是患有結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者的應用，和用於製備根據本發明的藥物組合物的應用。此外，本發明包括用於製備根據本發明的藥物組合物的方法。本發明還包括藥物組合物，所述藥物組合物包含根據本發明的抗體，其任選地與用於配製藥用目的的抗體的緩衝劑和/或佐劑一起。本發明還提供在藥用載體中包含根據本發明的抗體的藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物可以包含在制品或試劑盒中。發明詳述術語「抗體」涵蓋抗體結構的各種形式，包括但不限於，完整的抗體，雙特異性抗體和抗體片段。根據本發明所述的抗體優選地是人源化的抗體、嵌合抗體或進一步遺傳改造的抗體，只要其仍舊保留了根據本發明的抗體的特徵性性質。「抗體片段」包括全長抗體的部分，優選地包括其可變結構域，或至少其抗原結合位點。抗體片段的實例包括雙抗體、單鏈抗體分子和形成自抗體片段的多特異性抗體。scFv 抗體例如描述在 Houston，J. S. ,Methods in Enzymol (酶學方法).203 (1991) 46-88 中。此外，抗體片段包括具有Vh結構域特徵的單鏈多肽，即能夠與\結構域組裝在一起形成功能性抗原結合位點，或結合於TWEAK的\結構域的特徵的單鏈多肽，即能夠與Vh結構域組裝在一起形成功能性抗原結合位點。術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」用於本文時指單胺基酸組成的抗體分子的製劑。術語「人源化抗體」指這樣的抗體，其中與母體免疫球蛋白相比，構架和/ 或「互補決定區」(⑶R)已經被修飾為包括不同物種的免疫球蛋白的⑶R。在優選的實施方案中，將倉鼠CDR移植到人抗體的構架區中以製備「人源化的抗體」。見，例如 Riechmann, L.，等，Nature (自然)332 (1988) 323-327 ；和 Neuberger，Μ. S.，等，Nature (自然)314 (1985068-270。術語「嵌合抗體」指一種單克隆抗體，其包括來自小鼠的可變區，即結合區，以及源自不同來源或物種的恆定區的至少一部分，其通常通過重組DNA技術進行製備。嵌合抗體包括例如小鼠可變區和人恆定區。所述小鼠/人嵌合抗體是被表達的免疫球蛋白基因的產物，所述基因包含編碼大鼠免疫球蛋白可變區的DNA區段和編碼人免疫球蛋白恆定區的 DNA區段。本發明包括的20種「嵌合抗體」的其他形式是其中類別或亞類已經從初始抗體進行修飾或改變的那些抗體。也將這種「嵌合」抗體稱作「類別轉換抗體」。製備嵌合抗體的方法包括目前在本領域眾所周知的常規重組DNA和基因轉染技術。見，例如，25 Morrison, S. L.，等，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；美國專利號 5，202，238 和 5，204，244。術語「T細胞表位缺失抗體」指這樣的抗體，其已經通過去除人T細胞表位(蛋白質中的肽序列，具有結合II類MHC分子的能力)被修飾去除或減少了免疫原性。通過這種方法，鑑定了肽的胺基酸側鏈和具有II類MHC結合槽的特異性結合袋之間的相互作用。將鑑定的免疫原性區進行突變以消除免疫原性。將這樣的方法一般描述在例如WO 98/52976 中。「可變結構域」(輕鏈的可變結構域，重鏈(Vh)的可變結構域)用於本文中時， 表示直接參與抗體與抗原結合的每對輕鏈和重鏈結構域對。可變輕鏈和重鏈的結構域具有相同的一般結構且每個結構域包括4個構架(FR)區，所述構架區的序列普遍保守，其通過3 個「高變區」(或互補性決定區，⑶Rs)相連接。構架區採用β-摺疊構象且⑶R可以形成連接摺疊結構的環。每條鏈中的⑶R通過構架區以其三維結構保持並與來自另一條鏈的CDR—起形成抗原結合位點。抗體重鏈和輕鏈CDR3區在按照本發明的抗體的結合特異性/親和力方面發揮特別重要的作用並因此提供本發明的另一個目的。用於本文時，術語「抗體的抗原結合部分」指負責抗原結合的抗體的胺基酸殘基。 抗體的抗原結合部分包括來自「互補決定區」或「CDRs」的胺基酸殘基。「構架」或「FR」區是除本文中定義的高變區殘基之外的那些可變結構域區域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結構域從N端到C端包括結構域FRl，CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的 CDR3是最有助於抗原結合的區域並且限定抗體的性質。CDR和FR區域按照Kabat等，免疫目的的蛋白質序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公眾健康服務，國家健康研究所(Public Health Service,National Institutes of Health), Bethesda, MD. (1991))的標準定義確定和/或是來自「高變環」的那些殘基。術語「⑶R1H」指根據Kabat計算的重鏈可變區的⑶Rl區域。⑶R2L，⑶R3H等意為來自重鏈(H)或輕鏈(L)的各個區域。例如特徵在於包含SEQID NO 6的⑶RlH的抗體意為在其可變重鏈中包含該胺基酸序列作為重鏈可變鏈CDRl區域的抗體。例如，特徵在於包含 SEQ ID NO 6 的 CDR1H，SEQ ID NO 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 的抗體意為在其重鏈中包含SEQ ID NO 6作為⑶Rl的序列，包含SEQ ID NO 7作為⑶R2序列和包含SEQ ID NO :8作為CDR3序列的抗體。術語「核酸」或「核酸分子」用於本文時意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優選地是雙鏈DNA。用在本申請中的術語「胺基酸」指天然存在的羧基α -胺基酸的組，其包括丙氨酸(三字母代碼ala，一字母代碼A)，精氨酸(arg，R)，天冬醯胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)， 半胱氨酸(cys，C)，穀氨醯胺(gln，Q)，穀氨酸(glu，Ε)，甘氨酸(gly，G)，組氨酸(his，H)， 異亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，賴氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，Μ)，苯丙氨酸(phe， F)，脯氨酸(pro，P)，絲氨酸(ser，S)，蘇氨酸(thr，Τ)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)和纈氨酸(val，V)。當核酸在被置於與另一個核酸的功能關係中，是「可操作地連接的」。例如，前序列或分泌前導序列的DNA與多肽的DNA可操作地連接，條件是其表達為參與多肽分泌的前蛋白；啟動子或增強子與編碼序列可操作地連接，條件是其影響序列的轉錄；或核糖體結合位點與編碼序列可操作地連接，條件是其被定位為促進翻譯。一般地，「可操作地連接的」意指被連接的DNA序列是共線性的，且在分泌前導序列的情形中，是連續的且在可讀框中。然而，增強子不必須是連續的。連接通過在方便的限制性位點處的連接來實現。如果所述位點不存在，則合成的寡核苷酸適體或接頭根據常規實踐使用。用於本文中時，表述「細胞」、「細胞系」和「細胞培養物」可交替使用，且全部這些名稱都包括子代。因此，詞語「轉化體」和「轉化的細胞」包括原代受試細胞和由其來源的培養物，而不考慮轉移的次數。還理解所有的子代的DNA含量可能不精確一致，這歸因於有意或無意的突變。包括在最初轉化的細胞中篩選的具有相同功能或生物學活性的變異子代。抗體的「Fe部分」不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示不同的效應子功能。「抗體的Fc部分」是技術人員眾所周知的術語並且基於抗體的木瓜蛋白酶裂解而限定。取決於它們重鏈的恆定區的胺基酸序列，抗體或免疫球蛋白被分為下列種類IgA，IgD, IgE, IgG 和IgM，其中一些可以進一步分為亞類(同種型)，例如IgGl，IgG2，IgG3和IgG4，IgAl和 IgA2。根據重鏈恆定區，將免疫球蛋白的不同種類分別稱為α、δ、ε、Y和μ。抗體的Fc 部分直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用)和基於補體激活的CDC(補體依賴的細胞毒性)，Clq結合和Fc受體結合。補體激活(CDC)由補體因子Clq與大多數IgG 抗體亞類Fc部分結合而起始。因為抗體對於補體系統的影響依賴於某些條件，因此抗體與 Clq的結合由Fc部分中的限定的結合位點所導致。所述結合位點是現有技術中已知的，並例如由 Boakle，R. J.等.,Nature (自然)282 (1979) 742-743 ；Lukas，T. J.等，J. Immunol (免疫學雜誌)· 127(1981)2555-2560 ；Brunhouse, R.和 Cebra，J. J.，Mol. Immunol(分子免疫學).16(1979)907-917 ;Burton，D. R 等，Nature (自 M )288(1980)338-344 ； Thommesen, J. E.等，Mol. Immunol (分子免疫學)· 37 Q000) 995-1004 ；Idusogie, Ε. E.等， J. Immunol (免疫學雜誌)· 164(2000)4178-4184 ；Hezareh, M 等，J. Virology (病毒學雜誌)75 (2001) 12161-12168 ；Morgan, Α.等，Immunology(免疫學)86 (1995)319-324 ;EP 0307434 進行描述。所述結合位點例如是 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 和(根據Kabat的EU索引進行編號，見下)。亞類IgGl，IgG2和IgG3的抗體通常顯示補體激活和Clq和C3結合，而IgG4不激活補體系統，並且不結合於Clq和C3。根據本發明的抗體優選地包括人起源的Fc部分，其是IgGl亞類的人抗體的Fc部分。根據本發明的抗體特徵在於恆定鏈是人起源的。所述恆定鏈是現有技術中公知的，並且例如由Kabat描述(見例如Johnson, G.和ffu, Τ. T.，Nucleic Acids Res (核酸研 ^).28(2000)214-218) ο例如，有效的人重鏈恆定區包含SEQ ID NO :27或觀的胺基酸序列。例如，有效的人輕鏈恆定區包含SEQ ID NO :25的κ-輕鏈恆定區的胺基酸序列。還優選倉鼠起源的抗體，其包含根據Kabat的倉鼠抗體的抗體可變序列構架(見，例如kquences of Proteins of Immunological Interest ( g S), Kabat, Ε. Α. ，H 5 片反， DIANE 出版(1992))。本發明包括用於治療需要所述治療的患者的方法，其特徵在於向所述患者施用治療有效量的根據本發明的抗體。本發明包括根據本發明的抗體用於治療的應用。本發明包括根據本發明的抗體用於製備治療癌症的藥物的應用。本發明包括根據本發明的抗體用於治療炎性疾病的應用，優選地用於治療癌症， 尤其是結腸癌、肺癌或胰腺癌的應用。本發明的另一個實施方案是用於產生針對TWEAK的抗體的方法，其特徵在於將編碼根據本發明的抗體的重鏈的核酸序列和編碼所述抗體的輕鏈的核酸序列插入一個或兩個表達載體中，所述載體被插入真核宿主細胞中，所述編碼的抗體被表達並且從所述宿主細胞或上清液中回收。根據本發明所述的抗體優選地由重組方式產生。所述方法是現有技術中廣泛已知的並且包含在原核細胞和真核細胞中的蛋白表達，以及隨後的抗體多肽分離和通常純化為藥用純度。對於蛋白表達，將編碼輕鏈和重鏈或其片段的核酸通過標準方法插入表達載體中。在適合的原核或真核宿主細胞如CHO細胞，NSO細胞，SP2/0細胞，HEK293細胞，COS細胞，酵母，或大腸桿菌細胞中進行表達，並且將所述抗體從細胞(上清液或裂解後的細胞) 中回收。重組生產抗體是現有技術中公知的，並且例如在Makrides，S. C.，Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse，S.，等，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ；Kaufman, R. J.，分子生物技術(Mol. Biotechnol.) 16 (2000) 151-160 ；Werner, R. G.，Drug Res (藥物研究).48 (1998) 870-880的綜述文章中描述。抗體可以存在於完整細胞中，細胞裂解物中，或以部分純化形式，或基本純化形式存在。通過標準技術，包括鹼/SDS處理，CsCl分級(CsCl banding)，柱層析法，瓊脂糖凝膠電泳，和其它本領域公知的技術，進行純化從而消除其他細胞成分或其它汙染物，例如其它細胞核酸或蛋白。見Ausubel，F.，等，編輯，現代分子生物學中的方法(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing 禾口 Wiley Interscience, New York(1987)。在NSO細胞中的表達記述在，例如，Barnes, L. Μ.，等.，細胞技術學 (Cytotechnology) 32 (2000) 109-123 ；Barnes, L. Μ.，等.，生物技術和生物工程(Biotech. Bioeng. )73(2001)261-270 中。瞬時表達記述在，例如，Durocher，Y.，等·，核酸研究(Nuc 1. Acids. Res. )30 (2002) E9中。可變結構域的克隆記述在Orlandi，R.，等.，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 86 (1989) 3833-3837 ；Carter, P.，等.，美國國家科學院學報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 89 (1992) 4285-4289 ；和 Norderhaug，L.，等.，免疫學方法雜誌(J. Immunol. Method) 204 (1997) 77-87中。優選的瞬時表達系統(HEK 293)記述在 Schlaeger, E. -J.，和 Christensen, K.，在細胞技術學(Cytotechnology) 30 (1999) 71-83 中和 khlaeger，Ε. -J.，在免疫學方法雜誌(J. Immunol. Methods) 194 (1996) 191-199 中。單克隆抗體適當地從培養基中通過常規免疫球蛋白純化方法分離，所述純化方法如，例如蛋白A-瓊脂糖，羥基磷灰石層析法，透析或親和層析法。編碼所述單克隆抗體的 DNA和RNA容易地使用常規方法進行分離和測序。雜交瘤細胞可以充當所述DNA和RNA的來源。一旦被分離，可以將DNA插入表達載體中，所述表達載體接著被轉染到不另外產生免疫球蛋白的宿主細胞如HEK 293細胞，CHO細胞，或骨髓瘤細胞中，從而在宿主細胞中獲得重組單克隆抗體的合成。編碼抗-TWEAK抗體的胺基酸序列變體的核酸分子通過現有技術中已知的多種方法進行製備。這些方法包括，但不限於從天然來源分離(在天然存在的胺基酸序列變體的情形中)，或通過寡核苷酸-介導的(或位點定向)的誘變，PCR誘變和人源化的抗-TWEAK 抗體的早期製備的變體或非變體形式的盒誘變進行製備。根據本發明的重鏈和輕鏈可變結構域與啟動子序列、翻譯起始序列、恆定區序列、 3'未翻譯區序列、聚腺苷酸化序列和轉錄終止序列組合以形成表達載體構建體。可以將重鏈和輕鍊表達構建體組合在單一載體中，共同轉染，連續轉染，或分別轉染到隨後將融合形成表達兩條鏈的單一宿主細胞的宿主細胞中。在另一方面中，本發明提供組合物，例如藥物組合物，其包含與藥物載體一起配製的本發明的單克隆抗體或其抗原結合部分的一種或組合。用於本文時，「藥物載體」包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲試劑和吸附/再吸收延緩試劑等。優選地，所述載體適合注射或輸注。本發明的組合物可以通過本領域已知的多種方法進行施用。如技術人員所理解的，施用的路徑和/或方式取決於需要的結果是可變的。藥物載體包括無菌水溶液或分散體和用於製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。這些介質和藥劑用於藥物活性物質的應用是本領域已知的。除了水之外，所述載體可以例如是等滲的緩衝鹽溶液。不管所選擇的施用路徑為何，可以以適合的水合形式使用的本發明的化合物，和/ 或本發明的藥物組合物通過本領域技術人員已知的常規方式配製到藥用劑型中。在本發明的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以變化從而獲得這樣的活性成分的量，其對於特定的患者、組合物和施用方式有效獲得需要的治療反應，而不會對於患者具有毒性(有效量)。選定的劑量水平將取決於多種藥物代謝動力學因素包括所用的本發明的特定組合物的活性、或其酯、其鹽或其醯胺、施用路徑、施用時間、使用的特定化合物的排洩速率、與所用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、待治療的患者的年齡、性別、體重、病症、一般健康和以前的醫療病史，以及醫療領域已知的類似因
ο本發明包括根據本發明的抗體用於治療患有癌症、尤其是結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者的應用。本發明還包括用於治療患有所述疾病的患者的方法。本發明還提供用於製備藥物組合物的方法，所述藥物組合物包含有效量的根據本發明的抗體以及藥物載體，和根據本發明的抗體用於所述方法的應用。本發明還提供有效量的根據本發明的抗體，優選地與藥物載體一起用於製備藥劑的應用，所述藥劑用於治療患有癌症，尤其是結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者。
本發明還提供有效量的根據本發明的抗體，優選地與藥物載體一起用於製備藥劑
的應用，所述藥劑用於治療患有癌症，尤其是結腸癌、肺癌或胰腺癌的患者。序列描述表1
抗體202
倉鼠輕鏈SEQ ID NO: 1
CDRlLSEQ ID NO:2
CDR2LSEQIDNO:3
CDR3LSEQ IDNO:4
倉鼠重鏈SEQIDNO:5
CDRlHSEQIDNO:6
CDR2HSEQIDNO:7
CDR3HSEQ ID NO:8
輕鏈202-LC1的人源化變體SEQ ID NO:32
輕鏈202-LC2的人源化變體SEQ ID NO:33
輕鏈202-LC3的人源化變體SEQ ID NO:34
輕鏈202-LC4的人源化變體SEQ ID NO:35
重鏈202-HC1的人源化變體SEQ ID NO:36
重鏈202-HC2的人源化變體SEQ ID NO:37
重鏈202-HC3的人源化變體SEQ ID NO:38
重鏈202-HC4的人源化變體SEQ ID NO:39
重鏈202-HC5的人源化變體SEQ ID N0:40
重鏈202-HC6的人源化變體SEQ ID NO:41
重鏈202-HC7的人源化變體SEQ ID NO:42
重鏈202-HC8的人源化變體SEQ ID NO:43表2
權利要求
1.結合於人TWEAK的抗體，所述抗體特徵在於包含選自由SEQID NO :8，16或M組成的組中的⑶R3H作為重鏈可變結構域。
2.下述抗體的嵌合的、人源化的或T-細胞表位缺失的變體包含SEQID N0:1的可變輕鏈和SEQ ID NO :5的可變重鏈的抗體，包含SEQ ID NO :9的可變輕鏈和SEQ ID NO: 13的可變重鏈的抗體或包含SEQ ID NO 17的可變輕鏈和SEQ ID NO 21的可變重鏈的抗體。
3.根據權利要求1所述的抗體，其特徵在於包含SEQID N0:6的⑶R1H，SEQ ID NO: 7 的 CDR2H，SEQ ID NO 8 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 2 的 CDR1L，SEQ ID NO 3 的 CDR2L，SEQ ID NO 4 的 CDR3L，或特徵在於包含 SEQ ID NO 14 的 CDR1H，SEQ ID NO 15 的 CDR2H，SEQ ID NO 16 的 CDR3H 禾口 SEQ ID NO 10 的 CDR1L，SEQ ID NO 11 的 CDR2L，SEQ ID NO 12 的 CDR3L，或特徵在於包含 SEQ ID NO :22 的 CDR1H，SEQ ID NO :23 的 CDR2H，SEQ ID NO :24 的 CDR3H 禾口 SEQ ID NO 18 的 CDR1L,SEQ ID NO 19 的 CDR2L, SEQ ID NO 20 的 CDR3L，或特徵在於包含 SEQID NO 22 的 CDR1H，SEQ ID NO 74 的 CDR2H，SEQ ID NO 24 的 CDR3H 和 SEQ ID NO 18 的 CDR1L, SEQ ID NO 19 的 CDR2L, SEQ ID NO 20 的 CDR3L，或特徵在於包含 SEQ ID NO 22 的 CDR1H，SEQ ID NO 75 的 CDR2H，SEQ ID NO 24 的 CDR3H 禾口 SEQ ID NO 18 的 CDR1L, SEQ ID NO 19 的 CDR2L，SEQ ID NO 20 的 CDR3L。
4.根據權利要求1所述的抗體，其特徵在於選自由下列各項組成的組的可變輕鏈序列 /可變重鏈序列的組合SEQ ID NO:1/SEQ ID NO :5，1/36，1/37，1/381/39，1/40，1/41，1/42，1/43，32/5， 32/36，32/37，32/38，32/39，32/40，32/41，32/42，32/43，33/5，33/36，33/37，33/38，33/39， 33/40，33/41，33/42，33/43，34/5，34/36，34/37，34/3834/39，34/40，34/41，34/42，34/43， 35/5，35/36，35/37，35/38，35/39，35/40，35/41，35/42，35/43 ；9/13，9/48，9/49 ；9/50， 9/51，9/52，9/53，9/54，44/13，44/48，44/49 ；44/50，44/51，44/52，44/53，44/54，45/13， 45/48,45/49 ；45/50,45/51,45/52,45/53,45/54,46/13, 46/48, 46/49 ；46/50,46/51, 46/52,46/53,46/54,47/13,47/48, 47/49 ；47/50,47/51,47/52,47/53,47/54 ； 17/21, 17/61，17/62，17/63，17/64，17/65，17/66，17/67，17/68，17/69，17/70，17/71，17/72， 17/73，55/21，55/61，55/62，55/63，55/64，55/65，55/66，55/67，55/68，55/69，55/70， 55/71，55/72，55/73，56/21，56/61，56/62，56/63，56/64，56/65，56/66，56/67，56/68， 56/69，56/70，56/71，56/72，56/73，57/21，57/61，57/62，57/63，57/64，57/65，57/66， 57/67,57/68,57/69,57/70,57/71,57/72,57/73,58/21,58/61,58/62,58/63,58/64, 58/65,58/66,58/67,58/68,58/69,58/70,58/71,58/72,58/73,59/21,59/61,59/62, 59/63，59/64，59/65，59/66，59/67，59/68，59/69，59/70，59/71，59/72，59/73，60/21， 60/61,60/62,60/63,60/64,60/65,60/66,60/67,60/68,60/69,60/70,60/71,60/72, 60/73。
5.可變重鏈或可變輕能其選自由下列各項組成的組中SEQID NO :32，33，34，35，36， 37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61， 62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73 的可變重鏈或可變輕鏈。
6.藥物組合物，其特徵在於包含根據權利要求1-4的抗體。
7.根據權利要求1-4的抗體用於製備藥物組合物的應用。
8.根據權利要求1-4的抗體用於治療癌症的應用。
9.根據權利要求1-4的抗體用於治療結腸癌、肺癌或胰腺癌的應用。
10.編碼結合於TWEAK的抗體的重鏈的核酸，其特徵在於所述抗體包含根據權利要求1 的重鏈⑶R3區。
11.表達載體，所述表達載體特徵在於包含根據權利要求10的核酸，其用於在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達結合TWEAK的抗體。
12.原核宿主細胞或真核宿主細胞，其包含根據權利要求11的載體。
13.用於生產根據權利要求1-4的重組抗體的方法，所述方法特徵在於在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達根據權利要求10的核酸並且從所述細胞或細胞培養上清液中回收所述抗體。
14.用於治療患有癌症的患者的方法，其特徵在於向所述患者施用根據權利要求1-4 的抗體。
15.權利要求3的抗體，所述抗體包含具有SEQID N0:22的胺基酸序列的⑶R1H，具有SEQ ID NO 23的胺基酸序列的⑶R2H，具有SEQ ID NO 24的胺基酸序列的⑶R3H，具有 SEQ ID NO 18的胺基酸序列的⑶R1L，具有SEQ ID NO 19的胺基酸序列的⑶R2L和具有 SEQ ID NO 20的胺基酸序列的CDR3L。
16.權利要求3的抗體，所述抗體包含具有SEQID NO 14的胺基酸序列的⑶R1H，具有SEQ ID NO 15的胺基酸序列的⑶R2H，具有SEQ ID NO 16的胺基酸序列的⑶R3H，具有 SEQ ID NO 10的胺基酸序列的⑶R1L，具有SEQ ID NO 11的胺基酸序列的⑶R2L和具有 SEQ ID NO 12的胺基酸序列的CDR3L。
全文摘要
結合於TWEAK的抗體，其特徵在於結合TWEAK，其特徵在於包含選自由SEQ ID NO8，16或24組成的組的CDR3H作為重鏈可變結構域。
文檔編號C07K16/28GK102369219SQ201080014384
公開日2012年3月7日 申請日期2010年3月30日 優先權日2009年4月2日
發明者亨德裡克·諾伊特根, 延斯·涅沃納, 莫妮卡·貝納 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司