同時富集鐵鋅微量元素菌體的製造方法

2023-04-24 21:56:41

專利名稱：同時富集鐵鋅微量元素菌體的製造方法
技術領域：
本發明涉及富集微量元素的微生物菌體的製備方法。
鐵鋅微量元素缺乏會引起人和動物，特別是兒童及幼畜營養的不良。據我國營養學會發表資料表明，人體必需的微量元素鐵、鋅、硒、碘等在我國均較缺乏，長期攝入不足。礦物質微量元素預混劑中鐵鋅是主要成分之一，是國內生產量較大，使用較普遍的飼料添加劑。目前國內使用的鐵鋅微量元素主要以硫酸亞鐵、硫酸鋅等無機形態存在，其共同特點是易使載體著色，與食品及飼料中其它成分協同配伍性差。硫酸亞鐵難以解決仔豬缺鐵性貧血症狀，其局限性已被養殖業所證實。有關有機鐵鋅能提高生物組織吸收利用率、降低飼料中其它成分的損失方面的報導很多(Madson等1989,stuart等1986,Scholmerich等1987)。國內報導奶牛日糧中添加600ppm的蛋白鋅，產奶量比添加同樣劑量的無機鋅鹽提高25.4％(趙洪亮等1992)，富鋅金針菇中鋅的生物利用率是硫酸鋅的207％(莫寶慶等1990)。採用微生物富集微量元素以求其有機形態顯示出明顯的優點。一般用來作微量元素載體的微生物均屬對人畜無毒安全的菌種，這種載體不僅能提供人及動物所必需的微量元素，同時菌體本身又含有豐富的營養，菌種一般屬食品及飼料工業常用菌種，生產工藝也比較成熟。如日本公開特許公報(特開平5-176758,1993)公開了一種富集鐵的酵母的製造方法，是在培養基中加入一定濃度的鐵離子，使鐵在酵母中積累。鐵富集量達到8000ppm以上。又如林稚蘭等(微生物學報，1992)公開了一種製備高鋅酵母的方法。但這些方法均是一種微生物富集一種微量元素。當需要向飼料中加入多種微量元素時，就需要進行不同的培養以富集不同的元素。這就不可避免地造成成本過高，操作煩瑣，生產周期長。
本發明的目的是提供一種採用一種微生物在同一種培養基和同一發酵條件同時富集兩種微量元素的方法以達到在食品及飼料中添加本發明的產品可同時滿足人及動物對鐵鋅的需要。
本發明提供了一種富含鐵鋅的微生物菌體的製造方法，包括在適當的培養基中培養微生物菌體，並在適當的培養階段在培養基中添加一定濃度的無機鐵和無機鋅離子溶液，使鐵鋅離子在菌體內穩定地積累。
所用的微生物是米麴黴(Aspergillus oryzae)，黑麴黴(Aspergillus niger)，香菇(Letinus edode)，金針菇(Flammulinevelutipes)，或酵母菌屬(Sacchromyces)、假絲酵母屬(Candida)、擬內孢黴屬(Endomycopsis)的菌種。
優選的微生物是米麴黴(Aspergillus oryzae)。
所用的鐵鹽可以是硫酸亞鐵、氯化亞鐵、三氯化鐵、乳酸亞鐵或檸檬酸亞鐵，鋅鹽是硫酸鋅、氧化鋅、碳酸鋅或乙酸鋅。優選的鐵鹽是硫酸亞鐵，在培養基中的濃度為60-90ppm，鋅鹽是硫酸鋅，在培養基中的濃度為60-90ppm。
培養基中的碳源可以是選自玉米粉、小米粉、普通麵粉、土豆粉及其混合物的物質。
所用的無機鐵和無機鋅的加入是在發酵培養開始後6-12小時進行的。
通過對本方法富集的鐵鋅離子的菌體進行透射電鏡觀察，結果可見富鐵鋅的微生物菌體細胞壁與對照組有明顯的不同。富鐵鋅的細胞不完整，細胞膜附近有堆積物，細胞內斑點加深等，說明本發明方法製造的鐵鋅離子不是以游離態存在，而是在代謝中與細胞內某些成分(蛋白質、細胞壁多糖)緊密結合，見附

圖1照片。該菌種可利用廉價的農副產品來源的培養基富集鐵鋅微量元素，製取的菌體細胞大利於收取，這無疑會降低飼料的成本。用本發明的方法研製的小試產品用於仔豬代謝試驗證明，富鐵鋅真菌產品的鐵鋅利用率較之無機鐵鋅有顯著提高(結果見實施例6)。本發明的產品可用於人也可用於畜禽及水產。
實施例本發明操作程序為
菌種→斜面活化→三角瓶液體種子培養→三角瓶液體培養基中培養→培養一定階段加一定濃度的鐵鋅離子溶液繼續培養→收取菌體→水洗三次→乾燥本發明所用培養基為(Ⅰ)鈄面培養基葡萄糖2g，蛋白腖1g，KH2PO40.1g,MgSO4·7H2O0.05g，水100ml。
(Ⅱ)三角瓶種子培養基玉米粉(過60目篩)2g,NaNO30.2g,KH2PO40.1g,MgSO4·7H2O0.05g，水100ml。
(Ⅲ)三角瓶發酵培養基(1)糖度為5％的麥芽汁，或者(2)同(Ⅱ)。實施例11．菌種的篩選將鈄面上經活化的菌種轉接到經121℃滅菌30分鐘的三角瓶培養基培養基(Ⅰ)、培養基(Ⅱ)中，在20-35℃培養10-24小時，按接種量5％轉接到滅菌的三角瓶液體培養基中，再加適當濃度的滅菌的鐵鋅離子溶液(鐵鋅離子濃度分別為30-150ppm)，培養16-48小時，微生物的生長情況用肉眼根據發酵液混濁度判斷++++極好，+++好，++良好，+一般，-不生長，部分結果見表1。
表1
測定方法用稱重法測定幹菌體重，用原子吸收法測定鐵鋅含量(中華人民共和國國家標準GB/T 13885-92)。2．鐵鋅的富集用上述1中選擇出的米麴黴Asp.Oryzae-F59進行鐵鋅的富集。
將在鈄面上培養4-7天的鈄面種子轉接入經高壓(121℃30分鐘)滅菌的三角瓶液體種子培養基中。25-35℃(最適28-32℃)振蕩培養16-30小時(最適18-20小時)，按5％接種量轉接入經高壓滅菌的三角瓶發酵培養基中，培養6-12小時，再添加經過濾滅菌的鐵鋅離子溶液(30-150ppm)，繼續培養10-18小時，過濾收取菌體，用水洗三次，菌體經乾燥箱烘至恆重。實施例2用不同的原料為培養基質，均可富集到較高含量的鐵鋅微量元素。本試驗培養基起始pH為6.0，所用無機鐵鋅離子濃度為60PPM，培養時間為24小時，其它條件同實施例1所述，結果見表2。
表2
實施例3用不同的無機鐵、鋅鹽(鐵、鋅離子濃度均為60PPM)，主要基質用過60目篩的玉米粉，培養條件同上，見表3。
表3<
結果證實用不同的無機鐵鹽和鋅鹽均可能富集高含量的有機鐵鋅，但富集含量及幹菌體產量不等，以硫酸亞鐵和硫酸鋅最好。實施例4用不同濃度的鐵鋅離子溶液(硫酸亞鐵和硫酸鋅，加入培養基中，其它條件同上，結果見表4)。
表4
結果證實，製備富含有機鐵鋅離子的真菌菌體Asp.Oryzae-F59，培養基中最適的無機鐵鋅離子濃度範圍為60-90ppm，在這個範圍內均可製取較高含量鐵鋅的微生物菌體，同時也能收取較多的幹菌體。實施例5在不同的培養時間添加無機鐵鹽鋅鹽，其它條件同上，結果見附圖3，圖3表明，在Asp.Oryzae-F59在培養對數生長期(6-12小時)添加鐵鋅離子，培養24小時後，收穫的菌體中鐵鋅含量較高，12小時後添加，兩指標顯著下降。實施例6將發酵培養基的起始pH用0.1N的NaOH和0.1N的HCL調成不同的pH，滅菌後再進一步調整，結果見附圖2。圖2表明用該菌種富集鐵鋅，在pH5.5-7.5範圍內，幹菌體收穫量及菌體內鐵鋅含量均較高。實施例7用本發明的方法製造的富含鐵鋅離子的菌體用於斷奶仔豬作為鐵鋅源為試驗組，用硫酸亞鐵及氧化鋅為對照組，基礎日糧參照1988年美國NRC飼料營養標準，試驗兩周後，兩組仔豬均發育正常。試驗組比對照組日增重提高7.14％，飼料利用率提高10％，說明在飼料中添加有機鐵、鋅微量元素相對於無機鐵鋅具有促生長並提高飼料利用率的作用。生理生化指標結果試驗前兩組基本一致。試驗後，試驗組的鹼性磷酸酶指標(此指標與鋅的吸收呈極相關性)與血紅蛋白指標(家畜體內的鐵有一半以上有存在於血紅蛋白中，測此指標可知機體對鐵的吸收利用情況)與試驗前差異顯著(P＜0.05)。試驗組鹼性磷酸酶指標和血紅蛋白指標分別為160.56miu和9.94g/100ml；對照組分別為105.24miu和7.18g/100ml。兩組免疫球蛋白指標雖差異不顯著，但試驗組有上升趨勢。
權利要求
1．一種富含鐵鋅的微生物菌體的製造方法，包括在適當的培養基中培養微生物菌體，並在適當的培養階段在培養基中添加一定濃度的無機鐵和無機鋅離子溶液，使鐵鋅離子在菌體內穩定地積累。
2．按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，該微生物是米麴黴(Aspergillus oryzae)、黑麴黴(Aspergillus niger)、香菇(Letinusedode)、金針菇(Flammuline velutipes)或酵母菌屬(Sacharomyces)、假絲酵母(Candida)和擬內孢黴(Eedomycopsis)的菌種。
3．按照權利要求2所述的方法，其特徵在於，該微生物是米麴黴(Aspergillus oryzae)。
4．按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，所用的鐵鹽是硫酸亞鐵、氯化亞鐵、三氯化鐵、乳酸亞鐵或檸檬酸亞鐵，鋅鹽是硫酸鋅、氧化鋅、碳酸鋅或乙酸鋅。
5．按照權利要求4所述的方法，其特徵在於，所用的鐵鹽是硫酸亞鐵，在培養基中的濃度為60-90ppm，鋅鹽是硫酸鋅，在培養基中的濃度為60-90ppm。
6．按照權利要求1所述的方法，其特徵在於該培養基中的碳源為選自玉米粉、小米粉、普通麵粉、土豆粉及其混合物的物質。
7．按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，無機鐵和無機鋅的加入是在發酵培養開始後6-12小時進行的。
全文摘要
本發明提供了一種同時富集鐵鋅微量元素菌體的製造方法，包括在適當的培養基中培養微生物菌體，並在適當的培養階段在培養基中添加一定濃度的無機鐵和無機鋅離子溶液，使鐵鋅離子在菌體內穩定地積累。本發明的產品可以用於人的鐵鋅補劑也可以廣泛應用於畜禽及水產，提高鐵鋅的生物利用率。
文檔編號C12N1/14GK1227869SQ98100588
公開日1999年9月8日 申請日期1998年3月2日 優先權日1998年3月2日
發明者李淑敏, 史秀雲, 丁宏標 申請人:中國農業科學院飼料研究所