一種以擬南芥寡核苷酸片段為探針檢測鈾汙染的方法
2023-04-24 21:30:01
專利名稱：一種以擬南芥寡核苷酸片段為探針檢測鈾汙染的方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學方法檢測環境汙染的技術領域，特別是涉及一種以擬南芥 特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針草鈾汙染的方法。
背景技術：
傳統的鈾汙染及環境中放射性物質的檢測通常採用放射性檢測儀檢測，採用的是 α、β、X、Y多功能射線檢測儀探頭來檢測放射劑量，這種檢測方法的缺點是(1)雖然能 夠檢測一定劑量的放射源，但是很難區分究竟是哪种放射性物質；(2)其靈敏度具有一定 局限性；(3)檢測時必須近距離接近汙染環境，對檢測人員的身體健康造成威脅。目前，採 用分子生物學方法檢測環境鈾汙染的方法是一個重要的研究方向。羽葉鬼針草(Bidens maximovicziana.)菊科，鬼針草屬，一年生草本。在中國某 地的鈾尾礦上生長著大量的羽葉鬼針草，表明其對鈾有某種耐受或富集機制。發明的發明 人通過研究，將模式生物擬南芥29K Arabidopsis Genome Array晶片與鈾尾礦區及非汙染 對照區中的羽葉鬼針草核酸雜交，發現了一系列在鈾誘導下特異上調表達的擬南芥同源基 因片段。因此，可以利用羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因為探針檢測 環境中羽葉鬼針草是否受到鈾汙染。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是安全準確地檢測鈾汙染，提供一種以擬南芥特異寡 核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針草鈾汙染的方法，這種方法可以遠離汙染環境進行安全 檢測，並且其靈敏度高且特異性專一。本發明採用的技術方案一種以擬南芥特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針 草鈾汙染的方法，其步驟包括(1)採集待檢測環境中及非汙染對照區的羽葉鬼針草，將整株羽葉鬼針草放置 於-196°C液氮冷藏待用；(2)將冰箱保存的羽葉鬼針草放置研缽中加液氮研磨，採用異硫氰酸胍法提取總 RNA (0D260/0D280 等於 1. 8-2. 0)；(3)對樣品RNA進行螢光標記(晶芯cDNA擴增標記試劑盒)(a)反轉錄合成 1-strand cDNA ；(b)合成 2-strand cDNA ；
(c)體外轉錄合成cDNA ；(d)隨機引物反轉錄；(e) cDNA 用 KLENOW 酶標記；(4)雜交與清洗；(5)晶片掃描；(6)晶片圖像的採集與數據分析；
4
(7)對 29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交信號進行分析；(8)尋找羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因，從而得知待檢測 環境中羽葉鬼針草是否遭到鈾汙染。所述羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因的確定方法如下(1)採集鈾尾礦區及非汙染對照區的羽葉鬼針草，將整株羽葉鬼針草放置 於-196°C液氮冷藏待用；(2)將冰箱保存的羽葉鬼針草放置研缽中加液氮研磨，採用異硫氰酸胍法提取總 RNA (0D260/0D280 等於 1. 8-2. 0)；(3)對樣品RNA進行螢光標記(晶芯cDNA擴增標記試劑盒)；(a)反轉錄合成 1-strand cDNA ；(b)合成 2-strand cDNA ；(c)體外轉錄合成cDNA ；(d)隨機引物反轉錄；(e) cDNA 用 KLENOW 酶標記；(4)雜交與清洗；(5)晶片掃描；(6)晶片圖像的採集與數據分析；(7)29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交信號進行分析；(8)確定羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因，以此作為鈾汙染 檢測的探針。所述的 29K Arabidopsis Genome Array 晶片共有 29110 條 70mer 長度的 Oligo DNA,來自於Operon公司的The Arabidopsis thaliana Genome Oligo SetVersion 3.0,共 代表了約26173個基因，28964個轉錄本。關於此Oligo庫的詳情，可參見Operon公司的網 站:http://www. Operon. com。所述羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因有33個gene_ id(TIGR_release_5) :At5g43370、At5g54080、Atlg75590、Atlg23030、At5g43410、 At5g57655、At3g02000、At5g26930、Atlg68530、At4gl0340、Atlg01620、Atlg47655、 At3g23840、Atlg54500、At2g29860、At4g00570、Atlg01610、Atlg44085、Atlg26890、 At2gl7840、Atlg62790、At5g64810、At4g01070、At5g29090、Atlgl5100、Atlgll860、 Atlg55060、Atlgl0990、At5g05030、Atlg42970、At3g02000、At3g63080、At2gl7840。所述羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因的核苷酸序列如序列 表所示。本發明的有益效果從鈾尾礦區及非汙染對照區的羽葉鬼針草提取的總RNA與 29K Arabidopsis Genome Array晶片雜交，確定特異表達的上調基因，作為鈾汙染檢測的 探針；從待檢測環境及非汙染對照區中的羽葉鬼針草提取的總RNA與29K Arabidopsis Genome Array晶片雜交，檢測是否有特異表達的擬南芥同源上調基因，從而得知待檢測環 境中羽葉鬼針草是否遭到鈾汙染，這種檢測方法可以遠離汙染環境進行安全檢測，並且其 靈敏度高且特異性專一，只針對鈾的汙染，解決了汙染區周邊環境鈾汙染難以準確檢測的 問題，可以準確確定汙染源及是否環境被汙染。
下面結合附圖和具體實施例對本發明作一步詳細說明。圖 1 :29Κ Arabidopsis Genome Array 晶片雜交圖；圖 2 :29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交圖；圖 3 :29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交圖散點圖；圖 4 :29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交圖散點圖。具體的實施方式羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因的製作1.採集鈾尾礦區及非汙染對照區的羽葉鬼針草，在-196°C液氮冷藏待用；2.將冰箱保存的羽葉鬼針草Ig放置研缽中加液氮研磨，採用異硫氰酸胍法提取 總 RNA(0D26。/0D28。等於 1. 8-2. 0)；3.對樣品RNA進行螢光標記(晶芯cDNA擴增標記試劑盒)；3. 1 反轉錄合成 1-strand cDNA以Total RNA或mRNA起始，含有T7啟動子序列的T701igo (dT) Primer為引物，使 用 CbcScript 酶合成 1-strand cDNA。3. 2 合成 2-strand cDNA用RNase H將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段為引物 延伸，合成2-strand cDNA,並純化雙鏈cDNA。 3. 3體外轉錄合成cDNA以 cDNA 為模板，利用 T7Enzyme Mix 合成 cDNA ；然後用 RNA Clean-upKit (MN)純 化。3. 4隨機引物反轉錄取2yg cDNA，用CbcScript II酶，Random Primer進行反轉錄，反轉錄產物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)純化。3. 5cDNA 用 KLENOW 酶標記取上述反轉錄產物，以Random Primer為引物進行KLENOW酶標記，標記產物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)純化，純化後抽乾。Cy5-dCTPCy3_dCTP (GE Healthcare Cat. No. PA 55021/PA 53021)。4雜交與清洗；標記的DNA 溶於 80μ 1 雜交液中(3 X SSC，0. 2 % SDS，5 XDenhart，s，25 % 甲醯 胺)，於42°C雜交過夜。雜交結束後，先在42°C左右含0. 2% SDS, 2X SSC的液體中洗5min， 而後在0. 2XSSC中室溫洗5min。玻片甩幹後即可用於掃描。5.晶片掃描；晶片用LuxScan IOKA雙通道雷射掃描儀(CapitalBio公司)進行掃描。6.晶片圖像的採集與數據分析；6. 1採用LuxSCan3. O圖像分析軟體(CapitalBio公司)對晶片圖像進行分析，如 圖1、圖2所示，把圖像信號轉化為數位訊號；6. 2片間校正根據cy5和cy3總體信號的global mean對各晶片進行片間線性校正，使得各張晶片的global mean相同；6. 3片內歸一化，如圖3、圖4所示；6. 3. ILowess 方法(Yang, Y. H. , et al. , space and intensity-dependantnormal ization, Nucleic Acids Research,2002, 30 :el5)歸一化。6. 3. 2線性歸一化6. 4根據信號強度和圖像質量對基因進行標記。S 飽和點，信號值> 60000B 壞點E 表達基因，信號值> 1500 (單張晶片)，信號值> 800 (螢光交換晶片)M 臨界表達基因，1500 >信號值> 800 (單張晶片)，800 >信號值> 400 (螢光交 換晶片)6. 5表達基因篩選刪除了螢光信號弱的基因(保留IV為E或M的數據)以及芯 片上的陰性對照、內標、外標等冗餘的數據。6. 6差異表達基因篩選6. 6. 1單張晶片，以2倍或1. 5倍標準篩選差異表達基因。6.6. 2螢光交換晶片，首先進行ratio值整合，ratio = (rati0l*rati02)a5，再以 2倍或1. 5倍標準篩選差異表達基因。6. 6. 3每個基因有三個以上重複ratio，即用SAM軟體進行分析(V. Tusher， R.Tibshirani, and G.Chu.Significance analysis of microarrays applied totranscriptional responses to ionizing radiation.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 98 5116-5121,2001), FDR控制在5%以內，再以2倍或1. 5倍標準篩選差異表達基因。6. 7數據整理all data 在此組樣品中晶片檢測的所有信號，包括表達有變化及 沒有變化的基因，其中Ratio值為lowess歸一化以後的結果；checked genes 檢測到的有 效基因；differentially expressed genes 差異表達基因。7.對 29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交信號進行分析；8.確定羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因gene_id(TIGR_ release_5) :At5g43370、At5g54080、Atlg75590、Atlg23030、At5g43410、At5g57655、 At3g02000、At5g26930、Atlg68530、At4gl0340、Atlg01620、Atlg47655、At3g23840、 Atlg54500、 At2g29860、 At4g00570、 Atlg01610、 Atlg44085、 Atlg26890、 At2gl7840、 Atlg62790、At5g64810、At4g01070、At5g29090、Atlgl5100、Atlgll860、Atlg55060、 Atlgl0990、At5g05030、Atlg42970、At3g02000、At3g63080、At2gl7840.檢測鈾汙染的方法1.採集待檢測環境及非汙染對照區中的羽葉鬼針草，在_196°C液氮冷藏待用；2.將冰箱保存的羽葉鬼針草Ig放置研缽中加液氮研磨，採用異硫氰酸胍法提取 總 RNA(0D26。/0D28。等於 1. 8-2. 0)；3.對樣品RNA進行螢光標記(晶芯cDNA擴增標記試劑盒)；3. 1 反轉錄合成 1-strand cDNA以Total RNA或mRNA起始，含有T7啟動子序列的T701igo (dT) Primer為引物，使 用 CbcScript 酶合成 1-strand cDNA。
3. 2 合成 2-strand cDNA用RNase H將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA Polymerase以RNA短片段為引物 延伸，合成2-strand cDNA,並純化雙鏈cDNA。3. 3體外轉錄合成cDNA以 cDNA 為模板，利用 T7Enzyme Mix 合成 cDNA ；然後用 RNA Clean-upKit (MN)純 化。3. 4隨機引物反轉錄取2yg cDNA，用CbcScript II酶，Random Primer進行反轉錄，反轉錄產物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)純化。3. 5cDNA 用 KLENOW 酶標記取上述反轉錄產物，以Random Primer為引物進行KLENOW酶標記，標記產物用PCR NucleoSpin Extract II Kit(MN)純化，純化後抽乾。Cy5-dCTPCy3_dCTP (GE Healthcare Cat. No. PA 55021/PA 53021)。4雜交與清洗；標記的DNA 溶於 80μ 1 雜交液中(3 X SSC，0. 2 % SDS，5 XDenhart，s，25 % 甲醯 胺)，於42°C雜交過夜。雜交結束後，先在42°C左右含0. 2% SDS, 2X SSC的液體中洗5min， 而後在0. 2XSSC中室溫洗5min。玻片甩幹後即可用於掃描。5.晶片掃描；晶片用LuxScan IOKA雙通道雷射掃描儀(CapitalBio公司)進行掃描。6.晶片圖像的採集與數據分析；6. 1採用LuxSCan3. 0圖像分析軟體(CapitalBio公司)對晶片圖像進行分析，把
圖像信號轉化為數位訊號。6. 2片間校正根據cy5和cy3總體信號的global mean對各晶片進行片間線性 校正，使得各張晶片的global mean相同。6. 3片內歸一化6. 3. ILowess 方法(Yang, Y. H. , et al. , space and intensity-dependantnormal ization, Nucleic Acids Research,2002, 30 :el5)歸一化。6. 3. 2線性歸一化6. 4根據信號強度和圖像質量對基因進行標記。S 飽和點，信號值> 60000B 壞點E 表達基因，信號值> 1500 (單張晶片)，信號值> 800 (螢光交換晶片)M 臨界表達基因，1500 >信號值> 800 (單張晶片)，800 >信號值> 400 (螢光交 換晶片)6. 5表達基因篩選刪除了螢光信號弱的基因(保留IV為E或M的數據)以及芯 片上的陰性對照、內標、外標等冗餘的數據。6. 6差異表達基因篩選6. 6. 1單張晶片，以2倍或1. 5倍標準篩選差異表達基因。6.6. 2螢光交換晶片，首先進行ratio值整合，ratio = (rati0l*rati02)a5，再以2倍或1. 5倍標準篩選差異表達基因。6. 6. 3每個基因有三個以上重複ratio，即用SAM軟體進行分析(V. Tusher， R.Tibshirani, and G.Chu.Significance analysis of microarrays applied totranscriptional responses to ionizing radiation.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 98 5116-5121,2001), FDR控制在5%以內，再以2倍或1. 5倍標準篩選差異表達基因。6. 7數據整理all data 在此組樣品中晶片檢測的所有信號，包括表達有變化及 沒有變化的基因，其中Ratio值為lowess歸一化以後的結果；checked genes 檢測到的有 效基因；differentially expressed genes 差異表達基因。7.對 29K Arabidopsis Genome Array 晶片雜交信號進行分析；8.尋找羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因gene_id(TIGR_ release_5) :At5g43370、At5g54080、Atlg75590、Atlg23030、At5g43410、At5g57655、 At3g02000、At5g26930、Atlg68530、At4gl0340、Atlg01620、Atlg47655、At3g23840、 Atlg54500、 At2g29860、 At4g00570、 Atlg01610、 Atlg44085、 Atlg26890、 At2gl7840、 Atlg62790、 At5g64810、 At4g01070、 At5g29090、 Atlgl5100、 Atlgll860、 Atlg55060、 Atlgl0990、At5g05030、Atlg42970、At3g02000、At3g63080、At2gl7840.9.做出結論。序列表At5g43370(gene-id) : (At30026197oligo_id)CATCATTGGAGCCTTCGGGTTCTTATATGCGGCTCAAMTCMGACMGGCTMGGTGGATGCAGGATACAt5g54080(gene-id) : (At30027420oligo_id)CCTGGCGGTGCMGTCTTCATAGCTGTATGACACCTCATGGTCCAGATACTACCACGTACGAGGCGACMAtlg75590(gene-id) : (A005091_01oligo_id)CTATTTCTTTATTGGTGAGGCGGCGAGTTTTATTGGTGGTGGCTCGGAGATGGCCGTGAMGGTGGGTGAAtlg23030(gene-id) :(A005513_01oligo_id)ACATTMCGGCAGGACAAAAMCAGTGGAGATATGTCGGTGATCCGGGCCTTGGTTCAGAGACTCTCMGAt5g43410(gene-id) : (A022832_01oligo_id)GTATMCATGGGGAGTGGTGTCTCTTCTTCCACCGCCATGGCTGGATCTTCCTCCGCCTCCGCCTCCGCTAt5g57655(gene-id) : (At30027824oligo_id)MGMGATTGGATTCAMGGCACGCTTTTMTCGAGCCCMGCCTCMGMCCCACCMGCACCAGTATGAt3g02000(gene-id) : (A010484_01oligo_id)MGATGAGCAGCTTAGGATTCGGCGGTTTGGGGATGGTGGCTGACACTGGTCTGCTTCGTATAGAGTCCCAt5g26930(gene-id) : (A005225_01oligo_id)AGATAMCCTATTATCATCATCACACGGTGGCGTGGCGGTGMGAMCGMGGAGTCTAMGGAGGMGAAtlg68530(gene-id) : (At30006101oligo_id)GTGMGCCCTCMGGCAMCATCACCACMTAGGTCCTTTGGTCCTACCGGCGTCAGMCMCTTCTCTTAt4gl0340(gene-id) : (A014996_01oligo_id)GCGAGATGGGCTATGTTAGGAGCAGCTGGTTTCATCATTCCTGMGCTTTAMCAMTATGGCGCTMCTAtlg01620(gene-id) : (At30000067oligo_id)TGCGGCTCTTTACCACCMCTTGTCATCAGAGCCATTCCATTCMGTCCAGATCCTGATTTGATTTCTTT
MGATGAGCAGCTTAGGATTCGGCGGTTTGGGGATGGTGGCTGACACTGGTCTGCTTCGTATAGAGTCCCAt3g63080(gene-id) :A012743_01(oligo-id)MGGGAMGTGCTGCTCGTCGTCMCGTCGCTTCTAMTGCGGATTCACGGAGTCCMTTACACCCAGCTAt2gl7840(gene-id) :A020005_01(oIigo—id)GTGGAGGATTATAGCGGGMGGCGGCGMGCTGATTGCMCTGGCTCAGGACATTTGATAAMGGGATTC
權利要求
一種以擬南芥特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針草鈾汙染的方法，其步驟包括(1)採集待檢測環境及非汙染對照區中的羽葉鬼針草，將整株羽葉鬼針草放置於 196℃液氮冷藏待用；(2)將冰箱保存的羽葉鬼針草放置研缽中加液氮研磨，採用異硫氰酸胍法提取總RNA；(3)對樣品RNA進行螢光標記(a)反轉錄合成1 strand cDNA；(b)合成2 strand cDNA；(c)體外轉錄合成cDNA；(d)隨機引物反轉錄；(e)cDNA用KLENOW酶標記；(4)雜交與清洗；(5)晶片掃描；(6)晶片圖像的採集與數據分析；(7)對29K Arabidopsis Genome Array晶片雜交信號進行分析；(8)尋找羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因；(9)作出結論待檢測環境中羽葉鬼針草是否遭到鈾汙染。
2.根據權利要求1所述的以擬南芥特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針草鈾汙 染的方法，其特徵是，所述羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因的確定方 法如下(1)採集鈾尾礦區及非汙染對照區的羽葉鬼針草，將整株羽葉鬼針草放置於-196°C液 氮冷藏待用；(2)將冰箱保存的羽葉鬼針草放置研缽中加液氮研磨，採用異硫氰酸胍法提取總RNA；(3)對樣品RNA進行螢光標記；(a)反轉錄合成1-strand cDNA ；(b)合成2-strand cDNA ；(c)體外轉錄合成cDNA；(d)隨機引物反轉錄；(e)cDNA 用 KLENOW 酶標記；(4)雜交與清洗；(5)晶片掃描；(6)晶片圖像的採集與數據分析；(7)29KArabidopsis Genome Array晶片雜交信號進行分析；(8)確定羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因，以此作為鈾汙染檢測 的探針。
3.根據權利要求1或2所述的以擬南芥特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針 草鈾汙染的方法，其特徵是，所述羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基 有 33 個 gene_id :At5g43370、At5g54080、Atlg75590、Atlg23030、At5g43410、At5g57655、 At3g02000、At5g26930、Atlg68530、At4gl0340、Atlg01620、Atlg47655、At3g23840、Atlg54500、At2g29860、At4g00570、Atlg01610、Atlg44085、Atlg26890、At2gl7840、 Atlg62790、 At5g64810、 At4g01070、 At5g29090、 Atlgl5100、 Atlgll860、 Atlg55060、 Atlgl0990、At5g05030、Atlg42970、At3g02000、At3g63080、At2gl7840。
4.根據權利要求3所述的以擬南芥特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針草鈾汙 染的方法，其特徵是，所述羽葉鬼針草鈾誘導下特異表達的擬南芥同源上調基因的核苷酸 序列如序列表所示。
全文摘要
本發明公開了一種以擬南芥特異寡核苷酸片段為探針來檢測羽葉鬼針草鈾汙染的方法，從鈾尾礦區和非汙染對照區的羽葉鬼針草提取的總RNA與29KArabidopsis Genome Array晶片雜交，確定特異表達的上調基因，作為鈾汙染檢測的探針；從待檢測環境及非汙染對照區中的羽葉鬼針草提取的總RNA與29KArabidopsis Genome Array晶片雜交，檢測是否有特異表達的擬南芥同源上調基因，從而得知待檢測環境中羽葉鬼針草是否遭到鈾汙染，這種檢測方法可以遠離汙染環境進行安全檢測，並且其靈敏度高且特異性專一，只針對鈾的汙染，解決了汙染區周邊環境鈾汙染難以準確檢測的問題，可以準確確定汙染源及是否環境被汙染。
文檔編號C12Q1/68GK101921825SQ200910044389
公開日2010年12月22日 申請日期2009年9月22日 優先權日2009年9月22日
發明者馮濤, 肖璐, 高利臣 申請人:湖南科技大學