體外診斷結直腸癌的蛋白質二硫化物異構酶測定方法

2023-04-24 17:32:51

專利名稱：體外診斷結直腸癌的蛋白質二硫化物異構酶測定方法
體外診斷結直腸癌的蛋白質二硫化物異構酶測定方法本發明涉及癌學領域。更特別地，本發明的主題是體外診斷人類患者中結直腸癌 的方法，通過確定取自這個患者的生物樣品中蛋白質二硫化物異構酶的存在進行診斷，所 述方法可以用於結直腸癌相關的早期診斷、篩查、治療隨診和預後以及用於復發診斷。結直腸癌(CRC)是主要的公眾健康問題。在1996年估計全世界有875，000例新 發病例^考慮到男女兩種性別，這是在西方國家最常見的癌症，其通常被分類為是由於癌 症所致死亡的前3名最常見疾病。所有階段都考慮在內，5年存活率在60%的範圍。唯有早期診斷可以幫助治療。然而目前還沒有早期血清學篩查檢測或者特異性診 斷檢測。目前在歐洲進行的結直腸癌篩查是用兩種不同方法進行首先，使用亞臨 床(paraclinical)檢測，其包括查找糞便中血液的存在(便潛血檢測，F0BT，例如以 Hemoccult⑩名稱銷售)。這種技術已經證實其臨床有效性。當在年齡為50-74歲的個體 中每兩年使用時，其可以使結直腸癌所致死亡率降低15-20% 2。為此，需要一半以上的人 群定期進行篩查以及對陽性檢測結果的個體進行結腸鏡檢，任選隨後進行適當治療。然而，這種篩查技術具有某些不利之處·這種檢測的主要缺點是其靈敏性一般，特別是對於腺瘤(癌前異常病變)，如果 其較大，通常導致1/10病例發生癌症。·這種檢測也不是非常特異性的。糞便中出現血液也許與非腫瘤病變相關潰瘍 性結腸炎、痔瘡、瘻管等。在這種情況中，必須進行結腸鏡檢查，其缺點在後文描述。·最後，Hemoccult檢測難以解釋，其必須在專業中心由專業人士解讀。也已經描述了特異於人血紅蛋白的免疫學檢測(Feca EIA . ,Heme Select; 等)。與Hemoccult. 相比其可能取得進展，但其基本上還存在相同的問題。因此，由 Enterix公司銷售的hSure 可以檢測87%的患有CRC的患者以及47%的具有癌前息肉 的那些患者。這是在糞便中檢測人血紅蛋白的一種檢測方法，更特別是檢測這個分子的球 蛋白部分。另一種篩查方法是在50歲以後系統進行結腸鏡檢，這樣在理論上可以降低結直 腸癌所致死亡率。然而，在健康個體中使用內窺鏡篩查以降低死亡率的這種檢驗的可接受 性太低(在設立這種篩查策略的歐洲國家的結腸鏡檢查的依從水平為大約2%)。不僅存 在一定的結腸穿孔和出血的危險(0. 1%。)和死亡危險(1/10000)，而且對於公共衛生事業 是非常昂貴的。此外，結腸鏡檢查需要非常限制性的提前結腸準備，這在很大程度上造成依 從性不佳。很久以來關於結直腸癌已經描述了可以通過免疫測定法測定的腫瘤標記物。這些 標記物特別是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。使用CEA用於隨診。其不可以用於篩查或者早期診斷結直腸癌，因為其靈敏性和 特異性不足。這是因為這種標記物也由其它類型癌症表達，在良性病變中也表達。儘管如 此，通過將CEA與另一腫瘤標記物如CA19-9或者CA72-4組合可以增加靈敏性而不喪失特 異性。
導致CA19-9發生生理變異的因素較罕見，但是其它良性病變(肝膽病變、胰腺病 變)或者惡性病變可誘導CA19-9增加。單獨的這種標記物因此對於診斷也是無意義的。盡 管如此，因為其血清濃度與腫瘤的大小和轉移癌的存在相關，因此其可用於治療隨診或者 早期證實復發。此外，已經提出一些可商購的檢測方法，如> Colopath /ColorectAlertMD，由Ambrilia銷售，這是針對CRC的一種快速且
相對非侵入性篩查檢測。Colopath 檢測具有結直腸病變的個體直腸粘液中縮醛磷脂(復 合脂質，是磷脂的一部分)，而ColorectAlert 檢測T-抗原，這是在直腸粘液中的一種複合 糖。Colopath /ColorectAlert 檢測包括將直腸粘液用於試紙條，基於khiff反應獲得 陽性或者陰性結果。Ambrilia研究了 1787名個體，證實Colopath /ColorectAlert 檢 測出M%的早期結直腸癌病例以及49%的所有階段病例。> COLARIS,由Myriad Genetics銷售，這是檢測血液中MLHl和MSH2基因突變的 一種檢測方法，用以篩查遺傳性非息肉型結腸癌(HNPCC症候群)。這個檢測的結果在3周 內獲得。Myriad使用目前可用的最靈敏及最具有特異性的測序技術。這種檢測方法很昂貴。>Di -70 ，由AMDL銷售，這是篩杳不同類型癌症(肺癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌、 胃癌等)的一種檢測方法。因此其對於CRC是非特異性的。所述檢測方法的原理基於雙夾 心ELISA技術(測定DR-70抗原)。通過酶反應揭示(抗體與生物素或者與鏈黴抗生物素 蛋白結合)。顯色反應表示存在癌症。蛋白質二硫化物異構酶標記物(Swiss Prot No. P07237,也稱作EC5. 3. 4. 1，PDI， 脯氨醯4-羥化酶亞基β，細胞甲狀腺激素結合蛋白，PDI Al或者是一種多功能蛋白 質，其催化分子內二硫鍵的形成、破壞和重排。在細胞表面，其發揮還原酶作用並裂解附著 於細胞的蛋白質的二硫鍵。在細胞內部，其是位於內質網腔內的可溶的分子，在此其形成並 重排新合成的蛋白質的二硫鍵。其包含具有特徵性CX)(C基序的硫氧還蛋白(thioredoxin) 類型的2個催化結構域。在高濃度，PDI作為伴侶蛋白，其抑制不正確摺疊的蛋白質的聚集。 在低濃度，其具有拮抗作用並促進所述聚集。PDI還形成不同酶的結構亞基，如脯氨醯羥化 酶，其催化前膠原pro α鏈的脯氨酸殘基的羥化。已經發現PDI在癌細胞表面特別富集3。 Tomonaga等4在結腸癌病例中觀測到翻譯後修飾。Stierum等5示出Caco-2結腸癌細胞系 的分化伴隨PDI的細胞濃度增加。在專利申請EP17M586中，PDI被描述為作為某些癌症 的診斷標記物，如結腸癌。然而，僅舉例說明了前列腺癌，由此目前為止還沒有使用PDI作 為標記物診斷結直腸癌的靈敏性和特異性診斷方法。最後，專利申請AT 500 719A示出與 PDI A3不同，PDI不是結腸癌的標記物。本申請人現在令人驚奇地證實結腸腫瘤不僅特異性分泌PDI，而且特別從癌組織 中釋放，正如後文更詳細證實的那樣，對其實施本發明方法的生物樣品中的PDI濃度與在 健康個體中確定的參考值相比是增加的，且使用特殊的抗-PDI單克隆抗體可以提供診斷 結直腸癌的、靈敏且特異性的方法。因此，本發明的第一個主題是體外診斷結直腸癌的方法，特徵在於使用針對PDI 表位的至少一種抗-PDI單克隆抗體確定取自懷疑患有結直腸癌的患者的生物樣品、優選 遠離腫瘤的生物樣品中蛋白質二硫化物異構酶的存在，所述表位選自序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三維結構中與之接近的芳族胺基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表 位。本發明還涉及這種方法在結直腸癌的早期診斷、篩查、治療隨診和預後以及在結 直腸癌復發診斷中的應用。本發明的方法因此可以通過一種簡便檢測方法特異性和早期診斷結直腸癌，所述 檢測方法包括在取自患者的生物樣品、優選遠離可能的腫瘤的生物樣品中搜索PDI的存在。確定可能遠離或者未遠離腫瘤的生物樣品中PDI的存在可以推斷查找的病變。本 發明方法的一個優勢也在於使用遠離潛在腫瘤的樣品作為診斷樣品，從而可以簡便且非侵 入性地診斷，而組織診斷需要侵入性的活組織檢查。事實上，例如組織切片上組織標記物的 研究(免疫組織化學)感興趣的是預後，但是對於篩查或者診斷結直腸癌無意義。短語「確定腫瘤標記物的存在」是指使用PDI表位的至少一種抗-PDI單克隆抗體 確定所述蛋白質的存在，所述表位選自序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三維結 構中與之接近的芳族胺基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表位。術語「表位」是指至少具有SEQ ID No. 1_3所示序列的肽，且至多有10、8、6或者 4個額外胺基酸均勻或者不均勻地分布在該序列的任一側，或者僅在一側，以及所述肽的類 似物和同系物。通常地，術語「類似物」是指這樣的肽，與天然分子相比，其具有的序列呈現出一或 多個胺基酸添加、取代(通常為保守取代)和/或缺失，並具有天然多肽的結構，條件是上 述修飾不破壞抗原反應性。特別優選的類似物包括保守取代，即在胺基酸家族中發生的取代。特別地，胺基酸 通常被分為4個家族，S卩(1)酸性胺基酸，如天冬氨酸和穀氨酸，(2)鹼性胺基酸如賴氨酸、 精氨酸和組氨酸，( 非極性胺基酸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫 氨酸和色氨酸，以及(4)無電荷極性胺基酸如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨 酸、蘇氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時也分類為芳族胺基酸。例如，可以適 度地預測單獨地用異亮氨酸或者用纈氨酸置換亮氨酸、用穀氨酸置換天冬氨酸或者用絲氨 酸置換蘇氨酸，或者用結構相關的另一胺基酸置換胺基酸的相似的保守置換，對於生物活 性無明顯影響。本領域技術人員可容易地確定感興趣的肽分子可以耐受關於本領域熟知的 Hopp/ffoods 和 Kyte-Doolittle 圖的變化的區域。術語「同源」是指兩個肽分子之間的相同性百分比。當兩個肽分子的胺基酸序列 在一指定長度上呈現出至少60 %、優選至少75 %、更優選至少80-85 %、更優選至少90 %及 更優選至少95-98%或者更高的序列相同性時，這兩個胺基酸序列彼此是「基本同源的」。短語「SEQ ID No. 2和在PDI的三維結構中與之接近的芳族胺基酸所示的表位」是 指這樣的表位，其由從中衍生出該表位的蛋白質的兩個不同部分組成，即SEQ ID No.2以及 在蛋白質的三維結構中與之接近的芳族胺基酸所示的表位，識別這個表位的抗體需要識別 這兩部分。短語「在蛋白質的三維結構中接近的芳族胺基酸」是指任何這樣的芳族胺基酸，如 苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其由於PDI的三維結構而變得與SEQ ID No. 2接近。舉例而言， 這種合適的芳族胺基酸可以是在第209位的苯丙氨酸、在第206位的苯丙氨酸或者在第195位的酪氨酸。短語「由結腸腫瘤釋放」是指由腫瘤細胞自身或者由鄰近的非腫瘤細胞在由於腫 瘤發生導致細胞表型損傷或者修飾之後主動或者被動分泌或者釋放腫瘤標記物，無論機制 如何。短語「對其實施本發明方法的生物樣品」是指可含有感興趣的腫瘤標記物的任何 生物樣品。舉例而言，非遠離腫瘤的生物樣品是固體樣品，如源自病人的腫瘤、這個腫瘤的 活檢組織、淋巴結或者轉移癌的組織，或者純化自這些固體樣品的細胞。舉例而言，遠離腫 瘤的生物樣品是生物學液體如全血或者其衍生物，例如血清或者血漿、尿液、唾液和滲出 液，骨髓和糞便，以及純化自這些液體樣品的細胞。優選血液或者其衍生物以及糞便、滲出 物和純化自這些液體樣品的細胞。本發明的方法可以通過檢測除了 PDI之外的至少一種其它腫瘤標記物而改良，優 選所述其它腫瘤標記物也是由結腸腫瘤釋放至癌組織之外。因此，組合至少兩種標記物可 以改良診斷結直腸癌的檢驗的特異性和靈敏性。因此，本發明另一主題還包括確定選自如下兩組標記物的至少一種其它腫瘤標記 物的存在，所述標記物是單獨或者組合的-A組白細胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白(ezrin)、醯化胺基酸水解酶1、肝脂肪 酸結合蛋白、腸脂肪酸結合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AII和I-絲束蛋白，一些這些標記 物是由本申請人鑑別的新標記物，-B組具有額外的診斷意義的標記物，S卩β 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝 集素-3、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網蛋白、再生胰島衍生蛋白3 α、腫瘤相關的鈣信號轉導蛋 白1、角蛋白類型II細胞骨架8、角蛋白類型I細胞骨架18、角蛋白類型I細胞骨架19、 上皮鈣粘蛋白、CEA、絨毛蛋白、CA19-9、CA 242、CA 50、CA 72_2、睪酮、ΤΙΜΡ-1、Cripto_l、 htelectin-l、細胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、(前)防禦素-A5 ；檢測血液中那些 甲基化模式具有特異性改變的DNA片段，例如AXL4基因的甲基化DNAferistaless-like homeobox-4gene methylation)或者S印tin_9基因的甲基化DNA ；檢測糞便DNA片段中特 異性改變，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變；檢測人糞便 血紅蛋白。本發明的方法因此可通過檢測至少兩個標記物而改良，一個是PDI，另一個是選自 A組的的腫瘤標記物，即白細胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、醯化胺基酸水解酶1、肝脂肪 酸結合蛋白、腸脂肪酸結合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AII和I-絲束蛋白。「新描述的腫瘤標記物」是指蛋白質或者信使RNA或者相應基因的特異性修飾，如 突變或者甲基化。白細胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標記物(Swiss Prot No. P30740，也稱作LEI、 serpin Bi、單核細胞/嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑、M/NEI或者EI)在1992年測序6。 LEI通過形成在SDS作用下可以不解離的複合物而特異性抑制具有彈性蛋白酶類型或者糜 蛋白酶性質的蛋白酶7。LEI因此抑制由嗜中性粒細胞產生的三種主要的蛋白酶白細胞彈 性蛋白酶、蛋白酶-3以及組織蛋白酶G。這些蛋白酶使免疫系統通過細胞外或者吞噬的底 物蛋白酶解從而防禦生物體。然而，當這些蛋白酶過量存在時，其導致炎症反應。LEI因此 可具有調節和限制細胞蛋白酶誘導的炎症反應的作用。本申請人令人驚奇地部分揭示了這種蛋白質在取自患有結直腸癌的患者的生物樣品中是良好的標記物，所述樣品可能遠離腫瘤。所述埃茲蛋白標記物(Swiss Prot No. P15311，也稱作p81、cytovillin或者絨毛 蛋白- 是這樣的蛋白質，其提供細胞膜與細胞骨架的肌絲、特別是腸上皮細胞的微絨毛 之間的結合8。W. G.Jiang和S. Hiscox9已經揭示了白細胞介素IL-2、IL_8、IL-IO等可以 抑制埃茲蛋白在HD9人結直腸癌細胞系中表達。該作者「1揭示了抑制埃茲蛋白在HT115 和HRT18結直腸癌細胞系中的表達降低細胞之間的粘附並增加細胞的活動及侵入行為。已 經斷定埃茲蛋白通過與細胞粘附分子E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的相互作用而調節細胞 /細胞及細胞/基質粘附。推測埃茲蛋白在控制癌細胞的侵入潛力中起重要作用。此外， Τ. Xiao等11使用ELISA量化患有肺癌的患者的血漿埃茲蛋白。然而，與對照個體相比未觀 測到任何差異。本申請人令人驚奇地示出這種蛋白質在得自患有結直腸癌患者的生物樣品 中是良好的標記物，所述樣品可以遠離所述腫瘤。醯化胺基酸水解酶1標記物(Swiss Prot No. Q03154,也稱作EC3. 5. 1. 14，N-醯 基-L-胺基酸醯胺水解酶或者ACY-1)是醯化胺基酸水解酶家族的一部分。它們是催化醯 化胺基酸水解的酶，以提供脂肪酸和胺基酸12。醯化胺基酸水解酶酶活性的免疫化學測定 由K. Lorentz等在早如1975年揭示13，並用於測定不同的組織和血清14。研究表明醯化氨 基酸水解酶是在肝病變而不是在結腸癌中活性增加。此外，已經在染色體3p21. 1上鑑別醯 化胺基酸水解酶1基因15。在小細胞肺癌中，3p21. 1區域降低至純合性，在這種情況中醯化 胺基酸水解酶表達被抑制或者不可檢測16。相似地，S. Balabanov等17揭示了醯化胺基酸 水解酶表達在腎癌中被抑制。本申請人令人驚奇地揭示了這種蛋白質在取自結直腸癌患者 的生物樣品中是良好的標記物，所述樣品可以遠離所述腫瘤。肝脂肪酸結合蛋白標記物(SwissProt No. P07148，也稱作L_FABP、FABP1、FABPL、 Z-蛋白質或者留醇轉運蛋白)屬於FABP家族，該家族包含9個同種型。每個同種型根據首 先在其中檢測到該同種型的組織命名。這些特徵性具有共有的功能和相似的三維結構，但 是其序列同源性不高。L-FABP在1985年被測序18。其是15kDa的小蛋白質，在細胞溶質中 富集且具有結合游離脂肪酸以及膽紅素的能力。一些近來的研究似乎表明L-FABP蛋白質 表達的削弱可誘導腫瘤發生過程。對於前列腺癌，L-FABP在腫瘤活檢組織中的表達水平比 在正常組織中的表達水平高10倍19。對於結腸癌，一些研究小組已經鑑別了 L-FABP蛋白 質在腫瘤組織中表達與在正常結腸黏膜中的表達相比降低，使用二維電泳技術進行^1。這 個結果也已經通過免疫組織化學技術證實。此外，L-FABP蛋白質在結直腸癌轉移至肝的患 者中是預測肝切除的標記物21。本申請人令人驚奇地揭示了這個蛋白質在取自患有結直腸 癌的患者的生物樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離所述腫瘤。腸脂肪酸結合蛋白標記物(Swiss Prot No. P12104，也稱作I-FABP、FABP-2或者 FABPI)在1987年被測序22。這是15kDa的小蛋白質，在細胞溶質中富集，且具有結合游離 脂肪酸及結合膽紅素的能力。I-FABP蛋白質在小腸腸道細胞中表達，且佔這種細胞類型的 蛋白質含量的2%。在組織水平，十二指腸和空腸與結腸相比含有顯著較多量的I-FABP (空 腸4. 8μ g/g ；結腸0. 25μ g/g)23。I-FABP在健康個體的血漿樣品中可以檢測不到。另一方 面，在某些病理狀況如腸缺血、Crohn' s病或者原發性膽汁性肝硬化中，在某些個體中可以 證實血漿I-FABP濃度增加23。對於前列腺癌，已經示出I-FABP mRNA在腫瘤活檢組織中的表達水平比在正常組織中高7倍19。在用azoxymethane誘導結直腸腫瘤的大鼠模型中，當 該大鼠食用降低癌症發生的飲食(大豆蛋白或者乳清蛋白水解產物)時，I-FABP mRNA的 表達水平降低2. 92-3. 97倍「。本申請人令人驚奇地揭示了這個蛋白質在取自患有結直腸 癌的患者的生物樣品中是良好的標記物，所述樣品可以遠離所述腫瘤。載脂蛋白是由極性胺基酸組成的蛋白質家族，其通過稱作脂蛋白的親水性大分子 複合物的形成而可以在血液中轉運脂質。對於每種人血漿載脂蛋白，存在衍生自遺傳多態 性和/或翻譯後修飾的同種型，其在血液中的存在可以與某些病變相關^。載脂蛋白的血 漿濃度不是不明顯，為lmg/ml26。載脂蛋白AI 標記物(NCBI No. 490098，也稱作 Apo A-I, Apo AI 和 Apo Al)是具 有243個胺基酸的^kDa蛋白質。其基本上由肝和腸合成。這種蛋白質已經示出與在健康 個體中相比其在患有結直腸癌患者血清中不夠富集，通過SELDI-T0F測定27。然而，本文指 出通過組合Apo AI與其它蛋白質標記物可以區分患有CRC的患者與健康個體。此外，本 文指出通過由另一小組進行的濁度免疫測定分析Apo AI未證實這個蛋白質在患有CRC的 患者血清中不夠富集％。Hachem等在結直腸癌轉移之後患有肝癌的患者血清中測定Apo Al。本申請人令人驚奇地示出通過免疫測定進行測定可以證實這個蛋白質在患有結直腸癌 的患者中濃度降低，與先前Engwegen等27所述相反，Engwegen等能證實這種降低僅通過實 施SELDI-T0F技術實現。通過免疫測定在生物藥品中測定Apo AI是診斷結直腸癌的良好 方法，所述樣品遠離所述腫瘤，通過免疫測定進行的測定不是^iang等觀研究小組使用的濁 度測定法。載脂蛋白AII 標記物(Swiss Prot No. P02652,也稱作 ApoA II、Apo-AII 和 Apo A2)是17380-Da的蛋白質，由兩條多肽鏈組成，每條鏈具有77個胺基酸，通過二硫鍵連接。 與載脂蛋白AI相同，載脂蛋白AII基本上由肝和腸合成。Hachem等」除了 Apo AI之外， 也測定了在結直腸癌轉移後出現肝癌的患者血清中的Apo All。然而，結果不明顯，不能推 斷查找的病變。本申請人令人驚奇地揭示了這個蛋白質的濃度在結直腸癌患者中降低，使 其在取白患有結直腸癌的患者的生物樣品中是良好的標記物，所述樣品遠離所述腫瘤。I-絲束蛋白(plastin)標記物(Swiss Prot No. Q14651，也稱作小腸特異性絲束 蛋白或者絲束蛋白1)屬於人絲束蛋白家族，已知其三個代表性成員I-絲束蛋白、L-絲束 蛋白和T-絲束蛋白。一些作者將絲束蛋白(plastin)稱作「絲束蛋白(fimbrin)」，另一些 作者將絲束蛋白(fimbrin)命名為I-絲束蛋白。絲束蛋白是結合肌動蛋白以形成細胞骨 架(細胞骨架)的蛋白質。他們是70kDa蛋白質，在真核生物進化中相對保守。它們呈現出 強組織特異性，每次僅一種同種型存在於正常組織中3°。絲束蛋白關於癌症方面的應用在專 利US-A-5 360 715中描述，其提議一種確定細胞是否是血細胞生成或者瘤形成的細胞、即 癌性細胞的方法。這種方法主張在細胞水平測定L-絲束蛋白和T-絲束蛋白，更特別是測 定其mRNA。然而，儘管具有這些性質，但是先前未進行使用血清或者糞便樣品評估絲束蛋白 在診斷結直腸癌中的重要性。此外，從未設想I-絲束蛋白是潛在的癌症標記物31。本申請 人令人驚奇地揭示了這個蛋白質在取自患有結直腸癌患者的生物樣品中是良好的標記物， 所述樣品遠離或者未遠離所述腫瘤。選自A組的腫瘤標記物在實施本發明方法的生物樣品中的濃度與針對健康個體 確定的參考值相比增加或者降低。
本發明的方法也可以通過組合檢測PDI與選自B組的一種其它腫瘤標記物而改 良，所述B組標記物是β2-微球蛋白，蛋白酶體20S，半乳凝集素-3，L-乳酸脫氫酶B鏈， 鈣網蛋白，再生胰島衍生蛋白3α，腫瘤相關的鈣信號轉導蛋白1，角蛋白類型II細胞骨架 8，角蛋白類型I細胞骨架18，角蛋白類型I細胞骨架19，上皮鈣粘蛋白，CEA，絨毛蛋白， CA19-9, CA242, CA 50，CA 72-2，睪酮，ΤΙΜΡ-1，Cripto-1，Intelectin-Ι，細胞角蛋白 20，翻 譯控制的腫瘤蛋白質，(前)防禦素-A5，檢測血液中其甲基化模式具有特異性改變的DNA 片段，例如AXL4基因的甲基化DNA (aristaless-樣同源框-4基因甲基化)或者kptin-9 基因的甲基化DNA，檢測糞便DNA片段中特異性改變，如糞便DNA的特異性突變或者糞便 DNA的甲基化模式的特異性改變，以及檢測人糞便血紅蛋白。當然，本發明的方法也可以在 同一測定中實施PDI、選自B組的至少一種腫瘤標記物以及選自A組的至少一種其它腫瘤標 記物的檢測。β 2-微球蛋白標記物(Swiss Prot No. P61769，也稱作β 2_微球蛋白，β 2Μ)是 低分子量(ll_12kDa)蛋白質，在大多數人有核細胞的表面發現。在患有癌症的某些患者血 清中β 2-微球蛋白水平增加，這種增加不具有特異性或者與腫瘤的性質、疾病的階段或者 嚴重性相關。在其它疾病中也觀測到顯著增加，如在紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、乾燥綜合 徵、淋巴系統惡性腫瘤(多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或者AIDS) 以及在血友病患者中。由於β 2-微球蛋白通過腎小球過濾且由近曲小管重吸收，因此其在 血液中的濃度在腎病變情況中可以改變。因此測定β 2-微球蛋白是最常用於腎病變的診 斷或者獲得性免疫缺陷病毒感染的隨訪。然而，已知這種標記物是腫瘤標記物，特別是針對 結腸癌的標記物。蛋白酶體20S標記物(也稱作前體)是蛋白酶體的中心結構，其自身是與遍在蛋 白的細胞內降解相關的分子複合物32。蛋白酶體是700kDa的分子複合物，由觀個亞基組成， 7個亞基組成一個環，共4個環。在人體中，已知有7個α單位(α 1、α 2、α 3、α 4、α 5、 α 6 禾口 α 7)禾口 10 個 β 單位(β 1、β 2、β 3、β 4、β 5、β 6、β 7、β II、β 2i 禾口 β 5i)。通過 其催化性質，蛋白酶體在細胞增殖、生長、調控和凋亡及因此在癌化途徑中起重要作用。使 用BortezomiMVelcade)抑制蛋白酶體是一種公認的多發性骨髓瘤治療方法。對於血液癌 症或腫瘤正在進行II期或者III三期治療實驗。Lavabre-Bertrand等33揭示了蛋白酶體 的血清水平在某些病變中可以增高，特別是在癌症中(骨髓瘤、淋巴瘤和實體瘤)。所述半乳凝集素-3標記物(Swiss Prot No. P17931，也稱作feil-3，半乳糖特異性 凝集素3，MAC-2抗原，IgE-結合蛋白，35kDa凝集素，碳水化合物結合蛋白35，CBP 35，層 粘蛋白結合蛋白，凝集素L-四，L-31，半乳糖苷結合蛋白或者GALBP)是能結合N-乙醯乳糖 胺類型半乳糖苷結構的凝集素。其是具有參與多種生物功能的多功能蛋白質，所述功 能包括腫瘤細胞粘附、增殖、分化、血管發生、凋亡、轉移癌進展34。多項研究已經示出fel-3 可以與多種分子組成複合物CEA、IgE、層粘蛋白、粘蛋白、Mac-2BP、LAMPU LAMP2、纖連蛋 白等。Gal-3的血清測定已經由I. Iurisci等描述35。Gal-3被捕獲在用Mac-2-結合蛋白 (fel-3-結合蛋白)包被的微滴定平板上，然後用抗-Gal-3大鼠抗體揭示。這項研究表明 在胃腸道癌症、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤的情況中，Gal-3的血清水 平增加。L-乳酸脫氫酶B鏈標記物(Swiss Prot No. P07195,也稱作LDH-B，LDH心肌亞單位(heart unit)或者LDH-H)是可以形成同源四聚體形式複合物的蛋白質。這種蛋白質也 可以與L-乳酸脫氫酶A鏈蛋白質(Swiss Prot No. P00338，也稱作LDH-A，LDH肌單位或者 LDH-M)形成異源四聚體形式複合物。在一些實體瘤中，稱作LDH的四聚體複合物在血流中 的血清劑量和/或血清酶活性與腫瘤的大小成比例地增加。推薦其與人絨毛膜促性腺激素 (β-hCG)和胎盤鹼性磷酸酶組合用於精囊癌的治療隨診中。LDH被認為是預後淋巴瘤、白 血病和結腸癌的重要標記物％。鈣網蛋白標記物(SwissProt No. P27797，也稱作 CRP55，calregulin，HACBP， ERp60或者grp60)是一種多功能蛋白質。其是能與實際上內質網的所有單糖基化蛋白質 瞬時相互作用的凝集素。D. J. McCool等37因此揭示了鈣網蛋白參與結腸粘蛋白MUC2的成 熟。專利申請WO 03/065003中描述了一種診斷CRC的方法，該方法使用測定組織、糞便或 者體液中的鈣網蛋白。再生胰島衍生蛋白3α標記物(Swiss Prot No. Q06141，也稱作Reg ΙΙΙ-α，胰腺 炎-相關蛋白1或者胰腺炎相關蛋白I (PAP 1))是在健康胰腺中弱表達的蛋白質。其在急 性胰腺炎期間及在某些慢性胰腺炎患者中過表達。在這種情況中，其在胰液及在血流中出 現38。Y. Motoo等39通過ELISA示出血液中PAP 1的水平在某些患有結腸癌、胃癌、肝癌或 者胰腺癌的患者中增加，以及在腎功能不全的患者中也增加。為此，使用由Dynabio公司 (La Gaude，France)銷售的 ELISA (PANCEPAP)。腫瘤相關的鈣信號轉導蛋白1標記物(Swiss Prot No. P16422，也稱作主要胃腸 道腫瘤相關蛋白GA733-2，上皮細胞表面抗原，EpCAM,上皮細胞糖蛋白，EGP，腺癌相關抗原， KSA, KS 1/4抗原，細胞表面糖蛋白Trop-I或者⑶3 抗原)，在1979年由於其被結直腸 癌細胞的抗體識別的能力而被鑑定4°。這種蛋白質有許多如上述的名稱，但是最常用的是 EpCAM0其是在某些上皮和一些癌症的細胞基底外側表面表達的跨膜蛋白質41。在早如1982 年，Herlyn等42揭示了在結直腸癌患者中注射抗-EpCAM單克隆抗體可以抑制腫瘤生長。這 些結果使得可以基於稱作edrecolomab的抗-EpCAM抗體開發抗腫瘤治療方式。這種治療 方式以Panorex 名稱銷售。此外，Abe等43通過ELISA測定示出稱作MK-I的可溶形式的 EpCAM在進行研究的10%癌症患者的血流中增加。細胞角蛋白是組成上皮細胞細胞骨架的中間絲的蛋白質的一部分。目前已經鑑別 了超過20種人細胞角蛋白。細胞角蛋白8 (Swiss Prot No. P05787，也稱作細胞角蛋白-8， CK-8，角蛋白-8或者K8)、18(Swiss Prot No. P05783，也稱作細胞角蛋白-18，CK-18，角蛋 白-18或者K18)和19 (Swiss Prot No. P08727，也稱作細胞角蛋白_19、CK_19、角蛋白-19 或者K19)在上皮細胞中最富集，是診斷癌症病變的有效工具44。這種臨床重要性與細胞凋 亡或者增殖階段中上皮細胞釋放細胞角蛋白相關。在細胞凋亡中，這種釋放以可溶的片段 形式發生，其似乎在caspases的蛋白酶解作用下出現。血流中未降解的細胞角蛋白形式 從未描述。臨床最常用的三種細胞角蛋白測定是組織多肽抗原(TPA)測定，組織多肽特異 性抗原(TPS)測定以及CYFRA21-1測定。TPA是廣譜檢測，其測量細胞角蛋白8、18和19。 TPS和CYFRA21-1測定更具特異性，分別測量細胞角蛋白18和細胞角蛋白19的片段。這 三個測定檢測可能以自身或者蛋白質複合物形式存在的可溶的細胞角蛋白片段。TPA、TPS 或者CYFRA-21-1已經用於結直腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某 些ENT癌的治療隨診。測定血液中可溶的細胞角蛋白片段在篩查復發疾病或者評估所用治療(放療、化療、激素治療)的作用中具有臨床價值。定期測定特別可以評估腫瘤體進 展。可溶的血液細胞角蛋白的量對於腫瘤階段以及轉移的形成具有預測意義。目前最常用 的細胞角蛋白血液測定是CYFRA21-1。其被高度推薦為患有小細胞肺癌的患者的治療隨診 中。目前對於 TPA(AB Sangtec Medical Co.，Byk-Roland 等)、TPS(IDL Biotech AB,BEKI Diagnostics 等·)禾口 CYFRA-21-1 (Roche Diagnosiss, CIS Bio-International,Fujirebio Diagnostics等)有各種可商購的測定。此外，H. Kim等45已經示出測定糞便細胞角蛋白 19 (DiNonA he.)組合便潛血測定可用於篩查胃腸道疾病。最後，使用細胞角蛋白20 (Swiss Prot No.P35900，也稱作角蛋白，I型細胞骨架20，CK-20，角蛋白-20，K20或者IT蛋白)在 結直腸癌中作為標記物在專利申請US2002/0160382中描述。上皮鈣粘蛋白標記物(Swiss Prot No. P12830，也稱作E-鈣粘蛋白，uvomorulin， 鈣粘蛋白-1，CAM 120/80或者CD3M抗原)是一種跨膜蛋白，其介導鈣依賴性細胞粘附。其 在上皮細胞中特異性表達，在此其參與維持其表型。E-鈣粘蛋白的胞質結構域結合β-連 環蛋白，所述β-連環蛋白自身結合細胞骨架的肌動蛋白絲網。這種E-鈣粘蛋白/β-連 環蛋白結合在穩定上皮組織中細胞/細胞粘附中起重要作用。E-鈣粘蛋白的喪失因此可降 低細胞粘附並因此增加癌細胞的侵潤能力。E-鈣粘蛋白或者β -連環蛋白表達降低通常與 腫瘤特別是胃腸道癌症的更大的侵潤性和去分化相關。F. Roca等46因此示出患有結直腸 癌且低表達E-鈣粘蛋白的患者與具有正常表達水平的患者相比具有更不佳的預後。在早 如1983年，Damsky等47揭示了可溶形式的E-鈣粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌細胞系釋放。 這種可溶形式相應於E-鈣粘蛋白胞外部分的裂解。隨後，Katayama等48揭示了在癌症患 者中可溶形式的E-鈣粘蛋白可以被釋放進入血流中，Willmarms等49揭示了結直腸癌患者 血液中E-鈣粘蛋白的量增加與腫瘤階段相關。此外，Takara BioChemicals公司(Tokyo， Japan)提供了可商購的試劑盒。在1965年由P. Gold和S. Freedman5tl提議測定CEA(癌胚抗原)診斷結直腸癌，但 是在血液中測定這個標記物對於診斷相對未進展(nonadvanced)階段結直腸癌的靈敏性 不佳。因此特別推薦測定血清CEA以評估肝癌轉移的危險51以及治療隨診。此外，其對於 結直腸癌不是非常具有特異性的標記物；事實上其在許多其它癌症(肺癌、乳腺癌等)中也 增加。另一方面，測定糞便CEA看起來比測定血清CEA或者比測定便潛血更靈敏且更具特 異性52。然而，這種測定仍未被常規提議。反應性抗原性決定簇1116-NS-19-9，更通常被稱作CA19-9 (碳水化合物抗原 19.9)是由高分子量蛋白質攜帶53。測定血液中CA 19-9比CEA更具有特異性。在結直腸 癌、胰腺癌和肝癌(肝膽管型肝癌)中，血液CA 19-9水平增加，但是在一些非癌病變(膽 管炎)中也增加。在癌症診斷及病變治療隨診中推薦其與CEA組合使用。J.Holmgren等54揭示了在結直腸癌中血液CA 50抗原的量增加。CA 50抗原通過 其被特異性單克隆抗體識別的能力界定。關於CA 72標記物，T.L. Klug等55揭示了在結直腸癌中血清CA 72抗原的量增加。 CA 72抗原通過其被特異性單克隆抗體識別的能力界定。相似地，P. Kuusela等揭示了在結直腸癌中血清CA 242抗原的量增加。CA 242 抗原通過其被特異性單克隆抗體識別的能力界定。在男性中測定睪酮用以診斷結直腸癌已經由M. Holland等57提議。這些作者揭示了在結直腸癌中血液睪酮水平降低。關於TIMP-I，或者1型基質金屬蛋白酶的組織抑制劑標記物，專利申請US 2007/0020707描述了通過在體液中測定TIMP-I用以診斷結直腸癌。F. Model等在2006年7月在世界胃腸道癌症代表大會(World Congress on Gastrointestinal Cancer)期間提出可以檢測結直腸癌患者血漿中甲基化形式的 Septin-9 基因。M. P. Ebert等59揭示了 ALX4基因或者aristaless-樣同源框_4基因在結直腸癌 患者血清中比在對照血清中通常更甲基化(P < 0. 0001)。使用41. 4pg/mL閾值，獲得靈敏 性為83. 3%及特異性為70%。絨毛蛋白在專利申請FR2581456中被描述為是診斷結直腸癌的血液標記物。C. Bianco等6°揭示了在結直腸癌中血清Cripto-Ι的量增加。專利申請US2003/0082533 描述了測定 htelectin-1 (Swiss Prot No.Q8WWA0，也 稱作腸乳鐵蛋白受體，呋喃半乳糖-結合凝集素，內皮細胞凝集素HL-I或者omentin)診斷
結直腸癌。使用翻譯控制的腫瘤蛋白(Swiss Prot No. P13693，也稱作TCTP，p23，組胺釋放因 子，HRF或者fortiIin)以及前防禦素_A5 (Swiss Prot No. Q01523)在結直腸癌中作為標 記物分別在專利申請US 2003/0172388和US 2006/0179496中描述。術語「(前)防禦素」 是指前體，即裂解之前的前防禦素，前肽，即在前防禦素裂解之後的N-末端部分，成熟蛋白 質，即防禦素，相應於裂解之後C-末端部分。最後，測定人糞便血紅蛋白是一項已知技術，可以如先前所述實施。與針對健康個體確定的參考值相比，對其實施本發明方法的生物樣品中選自B組 的腫瘤標記物的濃度增加或者降低。優選地，B組腫瘤標記物選自標記物β 2-微球蛋白，蛋白酶體20S，半乳凝集 素-3，L-乳酸脫氫酶B鏈，鈣網蛋白，再生胰島衍生蛋白3α，腫瘤相關的鈣信號轉導蛋白 1，上皮鈣粘蛋白，CEA，CA19-9，睪酮，TIMP-I, Intelectin-l，細胞角蛋白20，翻譯控制的腫 瘤蛋白，(前)防禦素-A5，以及檢測人糞便血紅蛋白。當然，本發明的方法也可以包括檢測本領域技術人員已知的結直腸癌的任何其它 標記物。與總是以蛋白質形式被檢測的PDI相反，除了 PDI之外的感興趣的腫瘤標記物以 蛋白質形式或者以信使RNA形式檢測，或者通過相應DNA的改變(突變或者甲基化修飾) 而檢測。確定生物樣品中感興趣的「蛋白質」腫瘤標記物的存在可以通過本領域技術人員 已知的確定樣品中蛋白質存在的任何方法進行，例如生物化學檢測方法，包括免疫測定，或 者通過質譜分析。所述生物化學檢測可以是本領域技術人員已知的任何檢測，包括分子相互作用， 即所述腫瘤標記物與特異於或者非特異於所述腫瘤標記物的一或多個結合配體之間的反應。優選地，所述生物化學檢測是本領域技術人員已知的免疫測定，包括腫瘤標記物 (抗原)與一或多個更特異性的結合配體(即這種抗原的抗體)之間的免疫反應。
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特異於或者非特異於本發明方法中的腫瘤標記物的結合配體是能結合該標記物 的任何配體。當其能以高特異性或者甚至100%特異性結合這些標記物時，稱其為是特異性 的。當其結合這些標記物的特異性較低以及其能結合其它配體如蛋白質時，稱其為非特異 性的。例如，可以提及的是抗體、抗體部分、受體及能結合這種標記物的任何其它分子。所述結合配體抗體例如是多克隆抗體或者單克隆抗體。多克隆抗體可以通過用所述腫瘤標記物免疫接種動物，隨後回收純化形式的希望 的抗體，通過從所述動物中取血清，使所述抗體與其它血清組成成分分離，特別是在附著由 所述抗體、特別是所述標記物特異性識別的抗原的層析柱上通過親和性層析而分離。所述單克隆抗體可以通過雜交瘤技術獲得，這種技術的一般原理在後文複述。首先，用感興趣的腫瘤標記物對動物通常是小鼠進行免疫接種，然後所述動物的B 淋巴細胞能產生所述抗原的抗體。這些產生抗體的淋巴細胞隨後與「無限增殖化」的骨髓 瘤細胞(在實施例中是小鼠細胞)融合，以產生雜交瘤。使用由此獲得的細胞的異源混合 物，選擇能產生特定抗體及能無限繁殖的細胞。每個雜交瘤以克隆形式繁殖，導致單克隆抗 體產生，可以檢測所述腫瘤標記物識別性質，例如通過ELISA、一維或者二維Western印跡、 免疫螢光或者利用生物傳感器進行。隨後純化由此選擇的單克隆抗體，特別是根據上述親 和性層析技術進行。單克隆抗體也可以是利用本領域技術人員熟知的技術通過遺傳工程獲得的重組 抗體。抗蛋白質二硫化物異構酶抗體的實例是已知的，且特別可在Abcam目錄中獲 得，抗-PDI單克隆抗體，克隆RL77，Cat. No. Ab5484以及兔抗-PDI多克隆抗體，Cat. No.Ab3672。抗-白細胞彈性蛋白酶抑制劑抗體的實例是已知的，且特別可得自Abcam目錄，兔 抗-LEI多克隆抗體，Cat. No. Ab47731。抗-LEI單克隆抗體，克隆ELA-1，已經由^sumatsu
等61在文章中描述。抗-埃茲蛋白抗體的實例是已知的，且特別可得自Abcam目錄，抗-埃茲蛋白單克 隆抗體，克隆3C12，Cat. No. Ab4069,以及兔抗-埃茲蛋白多克隆抗體，Cat. No. Ab47418。抗-醯化胺基酸水解酶1抗體的實例是已知的，且特別可得自Abnova目錄，抗-醯 化胺基酸水解酶1單克隆抗體，克隆4F1-B7，Cat. No. H00000095-M01,以及Abcam目錄，雞 抗-醯化胺基酸水解酶1多克隆抗體，Cat. No. Ab261730抗-肝脂肪酸結合蛋白抗體的實例是已知的，且特別可得自Abcam目錄， 抗-L-FABP單克隆抗體，克隆6B6，Cat. No. Abl0059,以及兔抗-L-FABP多克隆抗體，Cat. No.Ab7807o抗-腸脂肪酸結合蛋白抗體的實例是已知的，且特別可得自R&D Systems目錄， 抗-I-FABP單克隆抗體，克隆323701，Cat. No. MAB3078，以及Abcam目錄，兔抗-I-FABP多 克隆抗體，Cat. No. Ab7805。抗-載脂蛋白AI抗體的實例是已知的，且特別可得自Biodesign Meridian Life Sciences目錄，抗-Apo AI單克隆抗體，克隆4A90，Cat. No. H45402M，以及山羊抗-Apo AI 多克隆抗體，Cat. No. K45252P。抗-載脂蛋白AII抗體的實例是已知的，且特別可得自US Biological目錄，抗-Apo AII 單克隆抗體，克隆 1402，Cat. No. A2299-31C，以及 Biodesign Meridian Life Sciences 目錄，山羊抗-Apo AII 多克隆抗體，Cat. No. K74001P。抗-I-絲束蛋白多克隆抗體的實例是已知的，且特別可得自Santa Cruz Biotechnology目錄。兔多克隆抗體H-300 (Cat. No. sc18531)與I-、L_和T-絲束蛋白反 應。本申請人揭示了抗I-絲束蛋白的單克隆抗體。抗-β 2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睪酮抗體的實例是已知的，且特 別是用於本申請人測定試劑盒中的那些，分別是Vidas β 2-微球蛋白、Vidas CEA、 Vidas CA19-9 和 Vidas 睪酮。抗-蛋白酶體20S抗體的實例是已知的，特別是Affinity Research Products目 錄中那些。抗-半乳凝集素-3、抗-L-乳酸脫氫酶B鏈、抗-鈣網蛋白、抗-腫瘤相關的鈣信 號轉導蛋白1、抗-角蛋白類型II細胞骨架8、抗-角蛋白類型I細胞骨架18、抗-角蛋白 類型I細胞骨架19、抗-上皮鈣粘蛋白、抗-絨毛蛋白以及抗-TIMP-I抗體的實例是已知 的，特別是Abcam目錄中那些。抗-再生胰島衍生蛋白3抗體的實例是已知的，特別是用於Dynabio測定試劑盒 (La Gaude，France)中的那些。抗-CA M2、抗-CA 50和抗-CA 72_4抗體的實例是已知的，特別是在Fujirebio 目錄中那些。抗-Intelectin-I抗體的實例是已知的，特別是Alexis Biochemicals目 錄，抗-Intelectin-I 單克隆抗體，克隆 Saly-I，Cat. No. ALX-804-850-C100，以及兔 抗-Intelectin-I 多克隆抗體，Cat. No. ALX-210-941。抗-細胞角蛋白20抗體的實例是已知的，且特別可得自Abcam目錄，抗-細胞角 蛋白20單克隆抗體，克隆Ks20. 8，Cat. No. Ab962，以及兔抗-細胞角蛋白20多克隆抗體， Cat. No. Ab367560抗-TCTP抗體實例是已知的，且特別可得自Abnova目錄，抗-TCTP單克隆抗體，克 隆 3C7，Cat. No. 157H00007178-M01 和抗-TCTP 多克隆抗體，Cat. No. 157H00007178-A01。抗-防禦素-A5抗體的實例是已知的，且特別可得自Santa Cruz Biotechnology 目錄，抗-防禦素-A5單克隆抗體，克隆8C8，Cat. No. sc-53997，以及Alpha Diagnosis International Inc.目錄，兔抗-防禦素 _A5 多克隆抗體，Cat. No. HDEFA51-A。特異於或者非特異於本發明方法中腫瘤標記物的結合配體可以用作捕獲試劑，作 為檢測試劑或者作為捕獲和檢測試劑。免疫反應，即腫瘤標記物/結合配體的結合，可以通過任何檢測方式觀測，如直接 或者間接方式。在直接檢測中，即不包含標記的檢測中，通過例如表面離子共振法或者通過在具 有傳導聚合物的電極上循環伏安法觀測所述免疫反應。間接檢測是通過「顯示試劑」結合配體或者感興趣的腫瘤標記物自身標記進行。在 後者中，這種方法被稱作競爭方法。術語「標記」是指能直接或者間接產生可檢測信號的標記試劑的附著。這些標記 試劑非限制性地包括
·酶，其產生可以例如通過比色、螢光或者發光檢測的信號，如辣根過氧化物酶、鹼 性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，·生色團，如螢光或者發光化合物或者染料，·放射性分子，如32P、35S或者1251，以及 螢光分子，如Alexa或者藻藍蛋白。也可以使用間接檢測系統，例如能與抗配體反應的配體。成對的配體/抗配體為 本領域技術人員熟知，可以是例如如下配對生物素/鏈黴抗生物素蛋白，半抗原/抗體、抗 原/抗體、肽/抗體、糖/凝集素、多核苷酸/與該多核苷酸互補的序列。在這種情況中，其 是攜帶結合配對體的配體。抗配體可以通過先前段落中描述的標記試劑直接檢測，或者可 以通過配體/抗配體自身檢測。這些間接檢測系統在一定條件下可以導致信號放大。這種信號放大技術為本領 域技術人員熟知，參見本申請人先前的專利申請FR98/10084或者W0-A-95/08000以及 Chevalier等62的文章。根據使用標記的類型，本領域技術人員加入試劑以可以觀測所述標記。舉例而言，上述免疫測定可以提及的是「夾心」方法，如ELISA、IRMA和RIA，「競爭」 方法和直接免疫檢測方法如免疫組織化學、免疫細胞化學、Western印跡以及斑點印跡。質譜分析也可以用於在生物樣品中檢測本發明方法中的腫瘤標記物。質譜分析的 原理為本領域技術人員已知，在例如I^atterson，S.63中描述。為此，使已經預處理或者未預處理的生物樣品經過質譜分析儀，並將獲得的質譜 與本發明方法中的腫瘤標記物的質譜對比。舉例而言，樣品預處理包括使其經過免疫捕獲 支持物，所述免疫捕獲支持物包含本發明方法中腫瘤標記物的結合配體之一，例如本發明 方法中腫瘤標記物的抗體。樣品預處理的另一實例可以是對所述生物樣品進行預分級分 離，以使樣品蛋白質彼此分離。在本領域技術人員熟知的技術中，樣品的主要蛋白質可例如 首先被耗竭。當本發明的方法是「夾心」方法時，可以使用兩種單克隆抗體或者一種單克隆抗體 和一種多克隆抗體。當然，在後者情況中，單克隆抗體至少是抗PDI表位的抗-PDI單克隆 抗體，所述表位選自序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三維結構中與之接近的芳 族胺基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表位。已知抗-蛋白質二硫化物異構酶抗體的實例，特別是Abcam目錄，例如兔抗-PDI 多克隆抗體，Cat. No. Ab3672。另一方面，抗-PDI抗體特異性結合選自序列SEQ ID No. 1、SE ID NO. 2或者SEQ ID No. 3所示的表位，由此其特異性結合PDI且不結合PDIs A3和A6，所述抗體是新的抗體， 且構成本發明的另一主題。根據本發明的一個實施方案，本發明的方法使用兩種單克隆抗體，優選序列SEQ ID No. 3所示表位的至少一種抗-PDI單克隆抗體以及選自序列SEQ ID No. 1以及SEQ ID No. 2和在PDI的三維結構中與之接近的芳族胺基酸所示PDI表位的至少一種其它單克隆抗 體。更優選地，本發明的方法使用序列SEQ ID No. 1所示表位的至少一種抗PDI抗體以及 序列SEQ ID No. 3所示表位的至少一種其它抗體。在生物樣品中確定感興趣的「mRNA」腫瘤標記物的存在可以通過確定樣品中mRNA存在的任何方法進行，即mRNA的直接檢測方法或者mRNA的間接檢測方法，或者通過確定樣 品中RNA存在的任何其它方法進行，這些方法為本領域技術人員已知。術語「mRNA的直接檢測」是指證實mRNA自身存在於所述生物樣品中。生物樣品中mRNA的直接檢測可以通過本領域技術人員已知的任何方式進行，例 如通過與特異於該mRNA的結合配體雜交，在適當情況中是在通過PCR或者NASBA技術擴增 之後進行。術語「雜交『是指這樣的過程，在此期間在合適條件下，兩個核苷酸片段彼此通過 穩定和特異性氫鍵結合，以形成雙鏈複合體。這些氫鍵在互補的鹼基腺嘌呤(A)與胸腺嘧 啶(T)(或者尿嘧啶(U))(稱作A-T鍵)之間形成，或者在互補的鹼基鳥嘌呤(G)與胞嘧啶 (C)(稱作G-C鍵)之間形成。兩個核苷酸片段的雜交可以是完全的(互補核苷酸片段或者 序列)，即在這個雜交期間獲得的雙鏈複合體僅包含A-T鍵和C-G鍵。這種雜交可以是部分 雜交(充分互補的核苷酸片段或者序列)，即獲得的雙鏈複合體包含可以形成雙鏈複合體 的A-T鍵和C-G鍵，但是也包含於互補鹼基不鍵合的鹼基。在兩個核苷酸片段之間的雜交 依賴於使用的運行條件，特別是嚴格性。所述嚴格性特別定義為與兩個核苷酸片段的鹼基 成分成函數關係，與兩個核苷酸片段之間的錯配程度也相關。所述嚴格性也依賴於反應參 數，如雜交溶液中存在的離子的濃度和類型，變性劑的性質和濃度和/或雜交溫度。所有這 些數據均為本領域技術人員熟知，且其可以確定合適的條件。通常地，根據希望雜交的核苷 酸片段的長度，雜交溫度在大約20-70°C之間，特別是在35-65°C之間，鹽溶液濃度為大約 0.5-1M。特異於或者非特異於mRNA的結合配體是能結合該mRNA的任何配體。例如可以提 及的是核酸探針、擴增引物，以及能結合該mRNA的任何其它分子。術語「雜交」探針是指包含5-100個核苷酸單位、特別是10-35個核苷酸單位的核 苷酸片段，在指定條件下具有雜交特異性以與特異於感興趣的靶基因的材料形成雜交複合 物。所述雜交探針可包含使其得以檢測的標記。對於本發明，術語「擴增引物」是指包含5-100個核苷酸單位、優選15-30個核苷 酸單位的核苷酸片段，使得酶聚合作用特別是如酶擴增反應起始。術語「酶擴增反應」是指 通過至少一種酶的作用而產生核苷酸片段的多個拷貝的過程。這種擴增反應為本領域技術 人員熟知，可特別提及的是如下技術-PCR (聚合酶鏈反應)，如專利 US 4 683 195、US 4 683 202 和 US4 800 159 所 述，-NASBA (基於核酸序列的擴增)，見專利申請WO 91/(^818所述，-TMA (轉錄介導的擴增)，見專利US 5 399 491所述。術語「檢測」是指物理方法，或者使用嵌入染料如STORGreen I或者溴化乙錠 的化學方法，或者使用標記的檢測方法。現有許多檢測核酸的檢測方法64。合適的標記如 上所述。對於本發明，雜交探針可以是「檢測，，探針。在這種情況中，「檢測，，探針通過使用 上述標記進行標記。藉助於這個標記的存在，可以檢測指定的檢測探針與被檢測的轉錄體 之間的雜交反應的存在。所述檢測探針可特別是「分子信標」檢測探針65。這些「分子信標」在雜交期間成 為螢光的。它們具有莖環結構，且含有螢光團和猝滅基團。特異性環序列與其互補靶核酸序列的結合導致所述莖的不摺疊，且在以合適波長激發期間發射螢光信號。所述雜交探針也可以是「捕獲」探針。在這種情況中，所述「捕獲」探針可以通過 任何適當方式即直接或者間接固定在或者可以固定在固體支持物上，例如通過共價或者吸 附方式固定。合適的固體支持物為本領域技術人員熟知，例如可以提及的是合成材料或者 天然材料、乳膠、磁性顆粒、金屬衍生物、凝膠等。所述固體支持物可以使微滴定平板形式， 如專利申請W0-A-94/12670所述的膜，或者顆粒。也可以將一些不同的捕獲探針固定在支 持物上，每個捕獲探針特異於靶轉錄體。特別地，可以使用其上固定了大量探針的生物晶片 作為支持物。探針固定在支持物上也為本領域技術人員已知，可以提及的是通過直接轉移、微 沉積、原位合成及光刻法(photolithography)固定探針。在生物樣品中證實編碼感興趣的腫瘤標記物的基因中的DNA修飾或者異常可以 通過確定樣品中DNA改變的任何方法進行，即直接檢測突變，或者證實感興趣的基因座的 甲基化模式的改變，或者確定樣品中DNA改變的任何其它方法，這些方法為本領域技術人 員已知。所述突變可包括一個核苷酸由另一核苷酸的點取代，缺失一或多個核苷酸以及插 入一或多個核苷酸。所述突變可位於感興趣的腫瘤標記物基因的編碼部分，或者在5』和3』 非編碼部分，如轉錄啟動子區域或者轉錄終止區域。證實突變的策略基於分子生物學技術，包括DNA提取、PCR擴增或者另一擴增技 術、雜交和/或測序步驟。在結直腸癌的情況中，如下方法已經成功用於檢測糞便DNA中的 突變通過沉澱濃縮DNA，使用捕獲寡核苷酸在磁珠上富集所述靶，通過PCR擴增感興趣的 基因，固相測序以鑑別點突變66。針對預期的參考片段與突變片段之間大小的不同鑑別缺 失。Imperiale等描述了位於K_ras、APC和p53基因中的一組21個突變，使得可以檢測 16/31的擴散的癌症。使用的其它DNA標記物是BAT-沈缺失，其是的微衛星DNA和稱作長DNA (L-DNA) 的可高度擴增的DNA的不穩定性的標誌，其不是特異性標記物，但是似乎反映結腸腔內脫 落的腫瘤細胞紊亂凋亡67。這些標記物在靈敏性或者特異性方面不令人滿意。如先前指出，DNA改變也可以相應於感興趣的腫瘤標記物的相應基因甲基化模式 的修飾。甲基化模式的修飾可相應於低甲基化(hypomethylation)(甲基化數目降低)或 者高甲基化(hypermethylation)(甲基化數目增加)。改變的單位可以位於感興趣的腫瘤 標記物基因的編碼部分，或者位於5』和3』非編碼部分，如轉錄啟動子區域或者轉錄終止區 域。DNA甲基化的分析可以使用基於定性和/或定量PCR技術進行，如MSP(甲基化特 異性PCR)，亞硫酸氫鹽測序，用甲基化敏感的限制酶消化結合PCR，COBRA (組合的亞硫酸氫 鹽限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感性單一核苷酸引物延伸)。對比參考所有這些技術， 在方法學文獻中詳細描述68。在文獻中，已經報導了結直腸癌基因中的一些高甲基化的基因。例如，可以提及的 是ALX4 (aristaless-樣同源框-4)基因59，TPEF/HHP1 (含有表皮生長因子的跨膜蛋白和卵 泡抑素(follistatin)結構域)基因69的啟動子區域或者kptin-9基因7°。在本發明方法中，當檢測至少兩個標記物時，可以通過單獨例如使用不同的免疫
17測定測量法或者同時在多元測定中證實。在本發明方法中，當檢測不同性質的兩個標記物時，例如蛋白質標記物和mRNA標 記物，可以使用選自上述那些方法的兩種不同檢測方法。也可以在同一檢測介質及在相同 反應條件下同時檢測，如專利申請WO 03/104490所述。本專利申請中描述的檢測方法包括 同時檢測樣品中雜交和免疫反應，所述樣品可含有由至少一種核酸及不同性質的至少一種 其它配體組成的靶分析物，所述方法的步驟包括(i)將在反應緩衝液中稀釋的已知體積量的樣品沉積在用所述靶分析物的捕獲配 體預包被的捕獲表面上，所述捕獲配體包含至少一種核酸探針和至少一種抗配體，(ii)在15°C -60°C溫度之間進行反應，以及(iii)觀測因此獲得的雜交和免疫反應。所述生物樣品可需要特殊處理，因為其也許含有本發明方法中的腫瘤標記物，或 者其也許含有具有本發明方法中的標記物的循環腫瘤細胞和/或能分泌本發明方法中的 標記物的循環腫瘤細胞。因此，根據本發明的一個實施方案，對所述生物樣品進行預處理以分離所述液體 中含有的循環腫瘤細胞。短語「分離循環腫瘤細胞」是指獲得富含循環腫瘤細胞的細胞組份。對所述生物樣品進行處理以分離循環腫瘤細胞可以通過在流式細胞儀中進行細 胞淘選、通過在Ficoll上富集、通過湧特異性抗體覆蓋的磁珠富集，或者通過本領域技術 人員已知的任何其它特異性富集方法進行。在血液作為生物樣品的情況中，循環腫瘤細胞可以通過在Ficoll上細胞分離技 術組合使用與磁珠結合的抗-CD45抗體耗竭血細胞而分離(Dynal Biotech ASA,Norway) 0然後可以進行本發明方法中的腫瘤標記物的檢測，使用分離自生物樣品的循環腫 瘤細胞進行，例如在通過細胞離心塗片器(cytospin)使循環腫瘤細胞沉積在載玻片上之 後，用本發明方法中的腫瘤標記物的抗體對這些細胞進行免疫細胞化學標記。本發明方法 中的腫瘤標記物的檢測也可以通過直接在循環腫瘤細胞中使用如M6t6zeaU等71所述流式 細胞計量術進行。在這些條件下，所述循環細胞可以在使本發明方法中的腫瘤標記物封閉的條件下 在所述細胞內部處理。這種處理如Mathieu等72所述。本發明方法中的腫瘤標記物的檢測在使得所述細胞膜通透之後進行，以使得特異 於本發明方法中的標記物的結合配體進入。基於循環細胞直接檢測本發明方法中使用的腫瘤標記物也可以通過ELISP0T方 法進行，例如通過由本申請人申請的專利申請WO 03/076942中描述的方法進行。這種方法 是檢測和/或量化生物樣品的循環腫瘤細胞的方法，所述循環腫瘤細胞在體外能釋放或者 分泌一或多種腫瘤標記物，所述方法包括如下步驟(i)使一定量的所述細胞沉積在附著了特異於所述腫瘤標記物的至少一種結合配 體的培養表面的底部，(ii)在使所述細胞釋放或者分泌所述腫瘤標記物的條件下培養所述細胞，所述腫 瘤標記物被免疫捕獲在培養表面的底部，(iii)通過洗滌除去所述細胞，
(iv)加入特異於所述腫瘤標記物的至少一種標記的綴合物，(ν)觀測由此獲得的標記。在腫瘤細胞中直接檢測本發明方法中使用的腫瘤標記物可以在使腫瘤細胞分泌 本發明方法中使用的腫瘤標記物的條件下培養所述腫瘤細胞，之後在所述細胞的培養基中 進行檢測。釋放或者表達所述腫瘤標記物的培養條件是常規條件，如37°C在溼潤環境及在 5% CO2 中。當生物樣品是固體樣品時，腫瘤標記物的存在也可以在體內、腫瘤原位示出。為了示出體內腫瘤標記物的存在，可以使用本領域技術人員已知的任何顯影方 法。為此，可以將所述腫瘤標記物的結合配體與顯影示蹤劑結合。術語「結合配體與顯影示蹤劑的結合」是指能通過本領域技術人員已知的任何顯 影方法檢測的以及能直接或者間接產生可檢測信號的示蹤劑的附著。因此，所述示蹤劑可 以是放射性示蹤劑如鎝-99。在這種情況中，具有原發癌或者轉移癌的器官將結合腫瘤標記 物及其示蹤劑。可以用專業相機例如-相機使該器官發射的射線成像。該設備收集由放射 性物質產生的閃爍(scintillations)，並因此可以觀測該器官。在本發明另一方法中，示蹤劑可包含發射正電子的放射性物質(氟18)。然後通過 正電子發射X線斷層攝影系統獲取圖像。在本發明的另一優選方法中，腫瘤標記物的配體可以與納米粒子結合，所述納米 粒子可以是超磁性(supramagnetic)納米粒子，例如用於直接細胞標記和通過核磁共振顯 影的體內檢測中的陰離子磁性納米粒子。它們也可以是金納米粒子。通過本發明的可以在體內檢測腫瘤標記物的方法，可以觀測到機體的結合腫瘤標 記物的結合配體的區域，產生腫瘤標記物的癌症、特別是結直腸癌，以及其遠離的轉移癌和 涉及的淋巴結。本發明的方法可用於結直腸癌的早期診斷及篩查、治療隨診、預後和復發診斷，因 為僅癌細胞分泌PDI，且這種產生依賴於癌症的階段，所述方法構成本發明的另一主題。此外，本申請書中描述的具有序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3的 表位是新的表位，構成本發明另一主題。本發明通過如下實施例以及附

圖1-22得以更清晰地理解，所述實施例只是舉例 說明本發明而無限制本發明之意，其中-圖1是通過ELISA測定PDI(Al)、PDI A3和PDI A6的示意圖，提供信號(OD)與 PDI (Al)、PDI A3 和 PDI A6 的濃度(ng/ml)相關。-圖2是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中PDI (ng/ml)的圖示。-圖3是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中LEI (ng/ml)的圖示。-圖4是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中埃茲蛋白(ng/ml)的圖示。-圖5是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中醯化胺基酸水解酶1 (ng/ml)的圖示。
-圖6是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中L-FABP(ng/ml)的圖示。-圖7是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中I-FABP(pg/ml)的圖示。-圖8是關於通過微量培養板ELISA(圖8A)或者使用LincopIex試劑盒(圖8B) 經ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的血清中載脂蛋白AI ( μ g/ ml)的圖示。-圖9是使用Lincomultiplex試劑盒測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個 體(CRC-)的血清中載脂蛋白AII (μ g/ml)的圖示。-圖10是通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的血清 中I-絲束蛋白(RFV，相對螢光值)的圖示。-圖11是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中β 2-微球蛋白(ng/ml)的圖示。-圖12是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中CEA(ng/ml)的圖示。-圖13是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中CA 19-9 (U/ml)的圖示。-圖14是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中睪酮(ng/ml)的圖示。-圖15是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中E-鈣粘蛋白(ng/ml)的圖示。-圖16是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中PAPl (ng/ml)的圖示。-圖17是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中半乳凝集素-3 (RFVl)的圖示。-圖18是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中LDH(ng/ml)的圖示。-圖19是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 血清中蛋白酶體20S(ng/ml)的圖示。-圖20是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 糞便中醯化胺基酸水解酶1 (ng/ml)的圖示。-圖21是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 糞便中半乳凝集素-3 (RFV)的圖示。-圖22是關於通過ELISA測定患有結直腸癌的患者(CRC+)及健康個體(CRC-)的 糞便中蛋白酶體20S(RFV)的圖示。-圖23通過ELISP0T測定LEI、埃茲蛋白和半乳凝集素_3的示意圖，單位是斑點 數目/IO6個Caco-2、HT-29和Η ^9_Β6細胞系的癌細胞。實施例1 編碼腫瘤標記物的基因的克隆及重組蛋白的表達1. cDNA擴增和克隆
Caco-2結直腸癌細胞系在不含FCS (胎牛血清)但含有2mM L-穀氨醯胺的DMEM 培養基(均Gibco)中培養。為克隆LEI、L-FABP 和 Gal_3 基因，用 Invitrogen FastTrack 2. O 試劑盒(Cat. No. 45-0019)根據廠商方案從108Caco-2細胞的沉澱中提取信使RNA。用Superscript III One Step RT-PCR System試劑盒(Invitrogen Cat. No. 12574-018)使用 Platinum Taq DNA 聚合酶根據廠商方案用450ng Cac0-2mRNA在單個步驟中進行逆轉錄和PCR步驟。用於基 因擴增的PCR引物在表1中給出。表權利要求
1.一種體外診斷結直腸癌的方法，特徵在於使用針對蛋白質二硫化物異構酶(PDI)表 位的至少一種抗PDI單克隆抗體確定取自懷疑患有結直腸癌的患者的生物樣品中PDI標記 物的存在，所述PDI表位選自SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和在PDI的三維結構中與之接近 的芳族胺基酸、以及SEQ ID No. 3所示的表位。
2.權利要求1的方法，特徵在於所述生物樣品是遠離腫瘤的樣品。
3.權利要求1或2的方法，特徵在於使用針對序列SEQID No. 3所示表位的至少一種 抗PDI單克隆抗體，以及針對PDI表位的至少一種其它單克隆抗體，所述PDI表位選自序列 SEQ ID No. 1、以及SEQ ID No. 2和在PDI的三維結構中與之接近的芳族胺基酸。
4.權利要求3的方法，特徵在於使用針對SEQID No. 1所示表位的至少一種抗PDI單 克隆抗體以及針對SEQ ID No. 3所示表位的至少一種其它抗體。
5.權利要求1-4任一項的方法，特徵在於其還包括確定選自如下標記物的至少一種其 它腫瘤標記物的存在白細胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、醯化胺基酸水解酶1、肝脂肪 酸結合蛋白、腸脂肪酸結合蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AII和I-絲束蛋白。
6.權利要求1-5任一項的方法，特徵在於其還包括確定至少一種其它腫瘤標記物的存 在，所述其它腫瘤標記物選自如下標記物β 2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝集素-3、 L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網蛋白、再生胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關的鈣信號轉導蛋白1、角蛋 白類型II細胞骨架8、角蛋白類型I細胞骨架18、角蛋白類型I細胞骨架19、上皮鈣粘蛋白、 CEA、絨毛蛋白、CA19-9、CA 242,CA 50,CA 72-2、睪酮、TIMP-l、Cripto_l、Intelectin-1、細 胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、(前)防禦素-A5 ；血液中甲基化DNA的檢測，優選AXL4 基因的甲基化DNA或者kptin-9基因的甲基化DNA的檢測；糞便DNA片段中特異性改變的 檢測，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變；以及糞便人血紅 蛋白的檢測。
7.權利要求1-6任一項的方法在結直腸癌早期診斷、篩查、治療隨診、預後以及復發診 斷中的應用。
8.序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 或者 SEQ ID No. 3 所示的表位。
9.抗-PDI抗體，其特異性結合權利要求8的表位。
全文摘要
本發明涉及體外診斷結直腸癌的方法，特徵在於使用針對PDI表位的至少一種抗PDI單克隆抗體確定取自懷疑患有結直腸癌的患者的生物樣品中蛋白質二硫化物異構酶腫瘤標記物的存在，所述PDI表位選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和在PDI的三維結構中與之接近的芳族胺基酸、以及SEQ ID No.3所示的表位。所述方法可用於對結直腸癌進行早期診斷、篩查、治療隨診和預後，以及與結直腸癌相關的復發診斷。
文檔編號G01N33/574GK102089663SQ200980126924
公開日2011年6月8日 申請日期2009年7月9日 優先權日2008年7月10日
發明者C·博利厄, D·羅蘭, G·肖凱-卡斯蒂勒夫斯基, J-P·沙裡耶, S·比瑟雷特, Y·阿塔曼-厄納爾 申請人:生物梅裡埃公司