一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒及其應用的製作方法
2023-04-24 16:14:36 1
一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，包括反應滴定微孔板和包含有陰性對照、陽性對照，樣品稀釋液，HRP-鼠抗人IgG,底物液、顯色液和終止液的檢測試劑，反應滴定微孔板上包被有0.2ug/ml~0.4ug/ml的rSFTSN蛋白,樣品稀釋液中含有5ug/ml~10ug/ml的rRVFN重組蛋白,HRP-鼠抗人IgG酶中含終濃度5ug/ml-10ug/ml的rRVFN重組蛋白。本發明還公開了該試劑盒在製備用於人群感染的流行病學觀察和疫苗免疫後抗體水平進行評估的診斷試劑中的應用。使用本試劑盒檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG，靈敏度可達99.8%；分析內精密度為2.5%（n=10），分析間精密度為4.5%（n=10）；特異性：99.5%。
【專利說明】一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其是涉及一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，本發明還涉及該試劑盒在製備用於人群感染的流行病學觀察和疫苗免疫後抗體水平進行評估的診斷試劑中的應用。
【背景技術】
[0002]布尼亞病毒科(Bunyaviride)是一類有包膜的負鏈RNA病毒，目前已知的病毒至少有350種,是蟲媒病毒中病毒數最多的一科,包括能感染人和動物的布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)、白嶺病毒屬(Phlebovirus)、奈洛比病毒屬(Nairovirus)、漢坦病毒屬(Hantavirus)和感染植物的番爺斑萎病病毒屬(Tospovirus)。其中白蛉病毒屬目前國際上公認分成兩大組，一組是致病性的白蛉熱組(Sandfly fever group),如立夫特谷熱病毒(Rift VallyFever Virus)等,另一組是非致病性的烏庫病毒組(Uuku_niemigroup),一般對人類不致病,如烏庫病毒(Uukunie-mi Virus)等。近年來,河南、江蘇、湖北、安徽、山東、遼寧、浙江等地相繼發生發熱伴血小板減少症候群(se-vere fever withthrombocytopenia Syndrome, SFTS)病例,經證實其病原體為一種新布尼亞病毒，被稱為發熱伴血小板減少症候群布尼亞病毒( severe fever with thrombocyto-penia Syndromebunyavirus, SFTSV )。新發現的SFTSV為白蛉病毒屬的第三組病毒。SFTSV電鏡下病毒顆粒呈球形或橢圓形，直徑約80 nm?100 nm，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個單股負鏈RNA片段組成。病人感染SFTSV後引起SFTS，主要表現為急性起病、發熱、噁心、嘔吐、腹瀉、乏力、全身不適、肌肉酸痛、頭痛、頭暈，WBC、PLT進行性下降等，可因多器官功能衰竭死亡。SFTSV可以通過蜱蟲叮咬傳播，也可通過接觸病人血液等傳播。
[0003]國家疾控中心對其進行了病原學、流行病學、臨床醫學等研究。目前該病毒序列已經闡明，基於RT-PCR的檢測標準已經建立，但是對SFTS的免疫學檢測試劑還未完善，使得評價該病毒感染缺乏一個對PCR結果的印證方法，也無法評估群體的既往感染水平及疫苗的保護作用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於針對上述現有技術存在的不足，提供一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，該試劑盒適用於流行病學調查，也可作為臨床診斷中發熱伴血小板減少症候群病毒感染的輔助診斷。
[0005]為實現上述目的，本發明可採取下述技術方案:
本發明所述的檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，包括反應滴定微孔板和包含有陰性對照、陽性對照，樣品稀釋液，HRP-鼠抗人IgG，底物液、顯色液和終止液的檢測試劑，所述反應滴定微孔板上包被有0.2 ug/ml?0.4ug/ml的rSFTSN蛋白，所述樣品稀釋液中含有5ug/ml?10ug/ml的rRVFN重組蛋白，HRP-鼠抗人IgG酶中含終濃度 5 ug/ml-10ug/ml 的 rRVFN重組蛋白。
[0006]所述rSFTSN蛋白的製備方法為:按照NCB1:4J4R_A中序列合成SFTSN蛋白讀框序列，將擴增後的序列插入PET30A構建PET30A-rSFTSN表達質粒，然後用PET30A_rSFTSN轉化BL21DE3，再採用常規IPTG誘導表達6HIS_rSFTSN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rSFTSN重組蛋白即可得到rSFTSN蛋白，並包被於反應滴定微孔板上。
[0007]所述rRVFN重組蛋白的製備方法為:按照NCBI:EU574085中序列合成RVFN蛋白讀框序列，將擴增後的序列插入PET30A構建PET30A-rRVFN表達質粒，然後用PET30A_rRVFN轉化BL21DE3，再採用常規IPTG誘導表達6HIS_rRVFN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rRVFN重組蛋白即可得到rRVFN重組蛋白，並添加到樣品稀釋液和酶稀釋液中。
[0008]本發明所述的試劑盒在製備用於人群感染的流行病學觀察和疫苗免疫後抗體水平進行評估的診斷試劑中的應用。
[0009]本發 明試劑盒適用於對人血清或血漿樣品中SFTSN-1gG抗體的定性檢測。由於機體受發熱伴血小板減少症候群病毒刺激時，SFTS-1gG抗體比SFTS-1gM抗體出現時間稍晚，在急性期過後，SFTS-1gM抗體較快下降，而SFTS-1gG抗體可能長時間存在。
[0010]本發明採用ELISA分析法對人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG進行檢測，微孔條上包被rSFTSN抗原，可與樣品中rSFTSN抗體反應，加入HRP標記的抗人IgG抗體後，將形成「包被抗原-抗體-酶標抗人IgG」複合物。加入底物劑，複合物上連接的HRP使顯色劑生成藍色產物，終止後變為黃色。顯色強度與rSFTSN-1gG抗體含量成正比，當待檢樣品中無rSFTSN-1gG抗體存在時，不顯色。
[0011]實驗表明，使用本發明試劑盒檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG，各項指標可達到:靈敏度:99.8% ;精密度:分析內精密度為2.5% (n=10)，分析間精密度為4.5%(n=10);特異性:99.5%。
[0012]本發明所述試劑盒的主要質量指標包括靈敏度、特異性、精密性、穩定性，試劑質量指標達到2010版《中國藥典》第三部，體外診斷類規程中的要求。
[0013]以本發明製備的試劑其檢測靈敏度:4mIU/ml ;特異性驗證:與其它同科布尼亞病毒IgG抗體無交叉反應；精密性驗證；試劑批間差異(CV%)不高於15%。
【具體實施方式】
[0014]本發明試劑盒的具體製備方法如下:
一、rSFTSN蛋白的表達和純化
參照NCBI (4J4R_A)中序列，合成其N蛋白的讀碼框並分別在5』添加酶切位點NdeI,3^添加酶切位點Xhol。採用常規分子生物學方法，將該閱讀框插入細菌表達質粒PET30A (novagen)的和之間，得到細菌表達質粒PET30A_rSFTSN。將該質粒常規轉化E.Coli BL21DE3 (novagen),按照廠商推薦的方法誘導表達rSFTSN重組蛋白，並用Hitrap (novagen)常規純化rSFTSN重組蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規蛋白定量備用。
[0015]二、rRVFN蛋白的表達和純化
參照NCBI (EU574085)中序列，合成其N蛋白的讀碼框並分別在5』添加酶切位點NdeI,3^添加酶切位點Xhol。採用常規分子生物學方法，將該閱讀框插入細菌表達質粒PET30A(novagen)的和之間，得到細菌表達質粒PET30A_rRVFN。將該質粒常規轉化E.ColiBL21DE3 (novagen)，按照廠商推薦的方法誘導表達rRVFN重組蛋白，並用Hitrap (novagen)常規純化rRVFN重組蛋白，SDS-PAGE檢測蛋白分子量和純度，常規蛋白定量備用。
[0016]三、HRP-鼠抗人IgG製備
抗體標記:取辣根過氧化物酶溶於三蒸水中，加入過碘酸鈉溶液活化，加入乙二醇反應，將反應混合物裝入透析袋，用醋酸緩衝液透析，加入待標記物(是鼠抗人IgG特異性抗體)混勻，碳酸緩衝液調pH至鹼性，加入NaHB4溶液反應後，裝入透析袋，用磷酸鹽緩衝液透析，分裝後加入蛋白保護劑(含終濃度50%的甘油)，-20度保存。
[0017]四、製備人發熱伴 血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒
檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，包括包被有0.2 ug/ml 0.4ug/ml rSFTSN蛋白的96孔酶免透明聚苯乙烯白色反應滴定微孔板，工作濃度為0.llPg/ml的辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG特異性抗體(含5ug/ml~10ug/ml rRVFN重組蛋白)；96孔酶免透明聚苯乙烯反應滴定微孔板包被rSFTSN重組蛋白:包被緩衝液採用pH9.6,0.05M碳酸鹽緩衝液；包被濃度0.2ug/ml~0.4μδ/πι1,包被量100μ1/孔，(TC ~4°C包被過夜；棄去孔內液體，使用PBS-Tween洗液洗板孔I次；用PH7.4 PBS-2% Casein (m/v)，100μ1/孔，室溫封閉2h。
[0018]樣品稀釋液:0.02 mo I PBS-2% Casein (m/v) PH7.4 (含 5ug/ml ~lOug/ml rRVFN重組蛋白)。
[0019]陽性對照製備:用樣品稀釋液稀釋，人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG陽性的血清，到OD值0.6左右。
[0020]陰性對照製備:正常人血清。
[0021 ] 五、本發明試劑盒的使用方法
本試劑盒於2-8°C保存，有效期6個月。使用前將試劑盒平衡至室溫(約30分鐘)。未用完的微孔板條須與乾燥劑及其用自封袋密封2-8°C保存。實驗前將液體試劑輕輕振蕩混勻，使用後立即密閉放回2-8°C保存。
[0022]適用儀器
加樣器、溫箱、洗板機、含波長450nm酶標儀。
[0023]樣本要求
I)本試劑使用人血清或血漿，含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用於本實驗。
[0024]2)不能檢測含懸浮纖維蛋白或聚集物、重度溶血的樣品。
[0025]3)樣品中應無微生物，無菌分離的樣品可在2_8°C存儲一周，長期儲存應低溫凍存，避免反覆凍融。
[0026]4)使用前請將樣品室溫平衡30分鐘以上，凍存樣品實驗前需混勻。
[0027]試驗前準備
I)取I包固體洗液用500ml蒸餾水溶解後備用。
[0028]2)取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復至室溫(18_25°C)。
[0029]3)將恆溫箱或水浴鍋調至反應溫度。
[0030]4)提前30分鐘將發光底物A、B液等比例混合至本次試驗所需體積。[0031]實驗步驟
O配液:將固體洗滌劑用蒸餾水或去離子水(5g固體洗滌劑/500ml蒸餾水或去離子水)倍稀釋。
[0032]2)編號:將樣品對應微孔板按序編號，每板應設陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照I孔(用雙波長檢測，可不設空白對照孔)。
[0033]3)加稀釋液:每孔加入樣品稀釋液lOOul，空白孔除外。
[0034]4)加樣:分別在相應孔中加入待測樣品或陰、陽性對照10ul，輕輕振蕩混勻。
[0035]5)溫浴:用封板膜封板後，置37°C溫育30分鐘。
[0036]6)洗版:小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌6遍，最後一次儘量扣幹。
[0037]7)加酶:每孔加入酶標試劑lOOul，空白孔除外，輕輕振蕩混勻。
[0038]8)溫浴:操作同5。
[0039]9)洗板:操作同6。
[0040]10)顯色:每孔加入底物液、顯色液各50ul輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色10分鐘。
[0041]11)測定:每孔加終止液50ul，輕輕振蕩混勻，10分鐘內測定結果。設定酶標儀波長於450nm處(建議用雙波長450nm/600nm檢測)，用空白孔調零點後測定各孔的值。
[0042]六、檢驗結果
O陰性對照的正常範圍:正常情況下，陰性對照孔A值< 0.10。(若有I孔陰性對照A值大於0.1應捨棄,若兩孔或兩孔以上陰性對照A值大於0.1,應重複實驗)。
[0043]2)陽性對照的正常範圍:正常情況下，陽性對照孔A值≥0.4。
[0044]3)臨界值(⑶T0FF)計算:臨界值=0.1+陰性對照孔評均值OD值陰性對照孔低於
0.05者按0.05計算)。
[0045]有效性判斷:陽性對照OD值≥0.4，陰性對照OD值≤0.1。
[0046]4)陰性判定:樣品A值<臨界值(⑶T0FF)者為發熱伴血小板減少症候群布尼亞病毒-1gG抗體陰性。
[0047]5)陽性判定:樣品A值≥臨界值(⑶T0FF)者為發熱伴血小板減少症候群布尼亞病毒-1gG抗體陽性。
[0048]6 )檢測標本情況(部分—據
【權利要求】
1.一種檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，包括反應滴定微孔板和包含有陰性對照、陽性對照，樣品稀釋液，HRP-鼠抗人IgG，底物液、顯色液和終止液的檢測試劑，其特徵在於:所述反應滴定微孔板上包被有0.2 ug/ml?0.4ug/ml的rSFTSN蛋白，所述樣品稀釋液中含有5ug/ml?10ug/ml的rRVFN重組蛋白，HRP-鼠抗人IgG酶中含終濃度5 ug/ml-10ug/ml的rRVFN重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，其特徵在於:所述rSFTSN蛋白的製備方法為:按照NCBI:4J4R_A中序列合成SFTSN蛋白讀框序列，將擴增後的序列插入PET30A構建PET30A-NP表達質粒，然後用PET30A-SFTSN轉化BL21DE3，再採用常規IPTG誘導表達6HIS_rSFTSN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rSFTSN重組蛋白即可得到rSFTSN蛋白。
3.根據權利要求1所述的檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒，其特徵在於:所述rRVFN重組蛋白的製備方法為:按照NCBI:EU574085中序列合成RVFN蛋白讀框序列，將擴增後的序列插入PET30A構建PET30A-rRVFN表達質粒，然後用PET30A-rRVFN轉化BL21DE3，再採用常規IPTG誘導表達6HIS_rRVFN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rRVFN重組蛋白即可得到rRVFN重組蛋白。
4.如權利要求1所述的檢測人發熱伴血小板減少症候群病毒抗體IgG的試劑盒在製備用於人群感染的流行病學觀察和疫苗免疫後抗體水平進行評估的診斷試劑中的應用。
【文檔編號】G01N33/569GK103954756SQ201410197677
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】趙巧輝, 黃學勇, 許汴利, 杜燕華, 李桂林, 付光宇, 吳學煒 申請人:鄭州伊美諾生物技術有限公司