一種嗜熱酸性普魯蘭酶的製備方法和應用的製作方法
2023-05-23 01:56:06
專利名稱：一種嗜熱酸性普魯蘭酶的製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種嗜熱酸性普魯蘭酶及其製備方法，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
嗜熱細菌是一類可以在55°C以上環境溫度中生長繁殖的微生物，根據其最適生長溫度的不同，可以分為嗜熱菌(55-80°C)和超嗜熱菌(80-110°C)。由於具有良好的熱穩定性和嗜熱性，來源於嗜熱細菌的酶被稱為嗜熱酶。嗜熱酶不僅具有高效的反應催化活性，而且在高溫下能夠保持很高的穩定性，對有機溶劑及變性劑也有很強的抗性，因此是生物催 化領域近年來發現重要的新型生物催化劑，廣泛應用於食品工業、環境保護、能源以及石油開採等工業生物技術方面。迄今已有嗜熱蛋白酶，澱粉酶，木聚糖酶，纖維素酶等嗜熱酶投入工業應用，尤其是來源於水生棲熱菌Thermus Aquaticus的DNA聚合酶(Taq酶)在PCR技術中的廣泛應用，使得該技術在生物研究和醫療領域都實現了新的飛躍。普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 41)屬於澱粉水解酶，能夠專一性水解普魯蘭多糖、糖原、澱粉、支鏈澱粉和相應低聚糖中α-1，6糖苷鍵的脫枝酶。普魯蘭酶與α-澱粉酶、β -澱粉酶或糖化酶共同作用可將澱粉徹底水解為葡萄糖，因此廣泛應用於以澱粉為原料的食品深加工、釀造、醫藥和新生物質能源等工業部門。根據水解的糖苷鍵差異分為I型(專一性水解普魯蘭的α-1，6_糖苷鍵)和II型(可水解普魯蘭的α-1，6_糖苷鍵以及其他多聚糖的^1-1，4_糖苷鍵)兩種。嗜熱細菌Iettingae ΤΜ0)是一類嗜高溫的、無芽孢的嚴格厭氧菌，其最適生長溫度為65°C,最適pH在7. O左右。T. Iettingae能夠分解和利用澱粉、纖維素和半纖維素等多聚糖，是嗜熱澱粉酶和纖維素酶的理想來源。目前已經有一些嗜熱酶從該菌中分離得到，比如葡聚糖酶，乙醇脫氫酶，肽酶等。這些酶在工業，紡織，食品以及生物工程領域都具有很好的應用前景。到目前為止，全世界上只有丹麥NOVO和美國傑能科兩家公司具備普魯蘭酶工業化生產能力，生產水平在100-400 U/mL(發酵液)。普魯蘭酶對於澱粉支鏈的水解具有重要作用，然而由於其特殊定位以及複雜的分泌系統，為工業化生產帶來障礙。
發明內容
本發明的目的是提供一種嗜熱溫酸性普魯蘭酶及其製備方法和應用。本發明的技術方案是一種嗜熱酸性普魯蘭酶的製備方法，它的步驟如下
(O設計併合成嗜熱酸性普魯蘭酶的引物，引物的序列如下
上遊引物 Pl :5' - GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3'；
下遊引物 P2:5' - GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3'；
(2)PCR擴增及重組質粒的構建
以嗜熱細菌全基因組序列為模板進行擴增，PCR擴增條件如下94°C預變性5 min；94°C 30 s，53°C 30 s，72°C 2 min，30個循環，用內切酶酶切後連接到經同樣內切酶酶切的pET15b上，連接產物轉化大腸桿菌疋coli DH5 α，篩選重組質粒，並進行雙酶切及測序驗證；
(3)基因的誘導表達與蛋白質的純化
將重組質粒轉化疋 coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入 O. 5-1 mo I/L IPTG 於 37°C繼續培養3-5 h，誘導表達的蛋白經過熱處理，鎳柱親和層析，得到純化的酶蛋白。嗜熱酸性普魯蘭酶酶在製備麥芽三糖中的應用。嗜熱酸性普魯蘭酶酶在製備單糖葡萄糖中的應用。本發明的有益效果是該酶活性最適酶活性為90°C，具有較為寬的酶適應溫度，在50-100°C之間具有很高的酶活性；該酶的最適酶活pH為5. 4，具有較好的耐酸性，在高溫70°C和酸性條件pH為5. O處理36小時，仍保持50%以上的活性。將該酶基因片段構建工程菌，優化發酵條件後，工程菌表達的普魯蘭酶活力達到150 U/mL以上。該酶的製備方 法，包括質粒、菌株與培養基的選擇，PCR擴增及重組質粒的構建，基因的誘導表達與蛋白質的純化，工程菌表達條件的優化。該酶具有良好的熱穩定性和耐酸性，適合用於以澱粉為原料的食品深加工、釀造、醫藥和新生物質能源等領域。耐高溫酸性普魯蘭酶應用於澱粉質原料水解，簡化了澱粉加工工藝，節約酸鹼化學試劑的消耗，減少工業生產對環境的汙染。本發明得到了嗜熱耐高溫酸性普魯蘭酶的基因序列和胺基酸序列，該酶是在》Iettingae TM 中發現並製備獲得的第一個普魯蘭酶；本發明獲得了一種不同於已發現普魯蘭酶的新型酶資源。該嗜熱普魯蘭酶具有不同的胺基酸序列和酶學特性；本發明獲得了目前已發現的耐酸性最強的嗜熱普魯蘭酶。
圖I是蛋白質表達的電泳照片，其中I.標準蛋白質分子量；2.細胞總提取物；3.經熱處理以後的粗酶提取液；4.經鎳柱親和層析純化的酶蛋白；
圖2是該酶的酶活與溫度變化關係曲線；
圖3是該酶的酶活與最適pH變化關係曲線；
圖4是該酶的酶活與耐酸性變化關係曲線。
具體實施例方式一種嗜熱酸性普魯蘭酶的製備方法，它的步驟如下
(O設計併合成嗜熱酸性普魯蘭酶的引物，引物的序列如下
上遊引物 Pl :5' - GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3'；
下遊引物 P2:5' - GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3'；
(2)PCR擴增及重組質粒的構建
以嗜熱細菌全基因組序列為模板進行擴增，PCR擴增條件如下94°C預變性5 min；94°C 30 s，53°C 30 s，72°C 2 min，30個循環，用內切酶酶切後連接到經同樣內切酶酶切的pET15b上，連接產物轉化大腸桿菌疋coli DH5 α，篩選重組質粒，並進行雙酶切及測序驗證；
(3)基因的誘導表達與蛋白質的純化
將重組質粒轉化疋 coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入 O. 5-1 mo I/L IPTG 於 37°C繼續培養3-5 h，誘導表達的蛋白經過熱處理，鎳柱親和層析，得到純化的酶蛋白。嗜熱酸性普魯蘭酶酶在製備麥芽三糖中的應用。嗜熱酸性普魯蘭酶酶在製備單糖葡萄糖中的應用。一種嗜熱酸性普魯蘭酶，它的核苷酸序列如下(0RF:Tlet_1262，基因序列號
NC_009828)
tcattccctg tacatcacca ttgcagatat tggcggaatt tctattgtcc cactgagttt60
gtagagaaga tctacaccag ctctttcttt atcaacgaca acattccatt cgccatcggg120
caaaatcaat tcatgttcaa cgatatctcc attgaagatc accaagatcc cttcccaggg180
gtcattgtta acatgttcat ttattaaaaa agcaacaacc ttcttcggtg attccaggaa240
agttatgtgt tttcttatat catctgccgt cctcaatcta aatgcagggt gtgattttct300
gagctttatc aatcctttgt ggtattcgaa aacatctatg aactgcgcct tcctttcata360
gtcgagcgca tttatagaaa ttggtgcatt gtacgaattt tcattgaact gtttggtcct420
gcaaaaatcc tggcctgcgt gaaagaaagg aacaccctgt gaagtgagta atatagctgc480
tgcaagtttt tgagctgact ttaattcttc ttcactccat tcccttctgt cagattttgc540
cgccagaaca tttttatccc agagtgtgtg attatcatga catgcaacat agttgatagt600
ttgttctgga ctgtaagcaa aatcagcaat caacttgttg tcatagttaa tactcccaac660
cactcctctt ttgatcttga tttctttccc cacagagccc ataacaaacc cttttgcttt720
tggatcaaaa acagagcccc ttataccgtc tcttattcca tcgttgaata cagctattct780
caaatcgaga agttgtgatt ttccaaacct tggttgaacc ccccagcctc cccacggttc840
gccatatata atcacgcttg gattaatctg tcttaaagtc ttttcaacca ttgccatggt900
ttttcggtct ataagtccca tctgatcaaa cctaaatcca tctacatgat attctttagc960
ccagtgaacg actgtatcaa gaatatatct tctcatcatg agcctttcgc tgtttgttgt1020
attgccacaa ctactttcat tcaggtattg ccccattttt ccaagcctgt aatagtaata1080
tgggactgcc tgatcaaaaa cagaaaattc tcccacacca taagtgtgtg gaaaaactac1140
atccattatc acacctatac catttttgtg aaatgtctga accattttct ttacttcata1200
gattcttgtc tttggatttg atggatctga gctgtagcag ccttctggta ccatgtaatg1260
ataaggatca tacccccagt tgtactgatt ttcgaagtct cttttcactt catcaccagt1320
gtaaaaatcg tagattggca aaatatgtac atgtgttaca ccaagttctt ttatatgttc1380
aagccctgtt gtaacgccat ttggaccgat tgtgccttct tctatcaaac caagataaga1440
cgatttgttt ttcacattac tcgtccagga gcctgtcata tctgctatgt gtatttcata1500
gattattgca tcaacataag aatcaagttt tacgtaacta tcctgttgcc aatcttctgg1560
atctgccttt ctcatgtcga cgatcgcgcc gaattttccc tgtaaagaca gcgccttggc1620
atatgggtct accccttctc tgattttgcc gtaactttcg tatcgatatc tgtaaaacca1680
tccatctaaa tctttatcaa gtcttgtata ccaaacacct ttttcatttc tttgcatatc1740
aacaacaaat gctggctgat cctgctcact tgtctgatac aatagcaact tgacagattt1800
gctgaccgga gtccatacat aaaactctgt gtattgcggt gtataaaaag ttcccagagg1860
gccatcgtag taaagctcgt ccaaaacttc taccgcataa acccttgatt tcttaaaacc1920
atctatctgt agaaaaatat ctcttgagag gtcttcttcc ttcaaaggtt gggaaagttt1980
tattctgaag taatttgtcc tggttatatc tgttgggtcg actttttcca gactgctaat2040
權利要求
1.一種嗜熱酸性普魯蘭酶的製備方法，其特徵在於，它的步驟如下 (O設計併合成嗜熱酸性普魯蘭酶的引物，引物的序列如下 上遊引物 Pl :5' - GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC-3'； 下遊引物 P2:5' - GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC-3'； (2)PCR擴增及重組質粒的構建 以嗜熱細菌全基因組序列為模板進行擴增，PCR擴增條件如下94°C預變性5 min；94°C 30 s，53°C 30 s，72°C 2 min，30個循環，用內切酶酶切後連接到經同樣內切酶酶切的pET15b上，連接產物轉化大腸桿菌疋coli DH5 α，篩選重組質粒，並進行雙酶切及測序驗證； (3)基因的誘導表達與蛋白質的純化 將重組質粒轉化疋 coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL，加入 O. 5-1 mo I/L IPTG 於 37°C繼續培養3-5 h，誘導表達的蛋白經過熱處理，鎳柱親和層析，得到純化的酶蛋白。
2.嗜熱酸性普魯蘭酶酶在製備麥芽三糖中的應用。
3.嗜熱酸性普魯蘭酶酶在製備單糖葡萄糖中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種嗜熱酸性普魯蘭酶的製備方法，它的步驟如下(1)設計併合成嗜熱酸性普魯蘭酶的引物；(2)PCR擴增及重組質粒的構建；(3)基因的誘導表達與蛋白質的純化。本發明該酶活性最適酶活性為90℃，具有較為寬的酶適應溫度，在50-100℃之間具有很高的酶活性；該酶的最適酶活pH為5.4，具有較好的耐酸性，在高溫70℃和酸性條件pH為5.0處理36小時，仍保持50%以上的活性。
文檔編號C12N15/56GK102766644SQ201210214218
公開日2012年11月7日 申請日期2012年6月27日 優先權日2012年6月27日
發明者佘軒, 封盛雪, 魏濤 申請人:鄭州輕工業學院