一種檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法
2023-05-23 04:36:31 2
專利名稱：一種檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法，屬於生物技術 領域。
背景技術：
近年來在許多國家和地區，塑化劑對食品、環境的汙染引起了人們強烈的擔憂。鄰 苯二甲酸二丁酯(DBP)屬於苯二甲酸酯類化合物，被普遍應用於塑料製品、膠水、油漆、指 甲油、洗髮水和沐浴液等數百種產品中。鄰苯二甲酸二丁酯是半揮發性化合物，不與終產品 共價結合，在生產和生活中，被不斷地釋放到大氣、土壤和水環境中。環境中的鄰苯二甲酸 二丁酯又通過呼吸、飲食、皮膚接觸等三種途徑進入人體。因此，人類正面臨著越來越高的 鄰苯鄰苯二甲酸二丁酯暴露風險。有研究報告指出我國普通人群DBP日攝入量為12. 2ug/ kg bw,高於世界平均水平。
動物模型研究和流行病學調查發現鄰苯二甲酸二丁酯可以引起雄性生殖發育的 障礙。鄰苯二甲酸酯還具有免疫毒性，能導致兒童產生哮喘、溼疹、鼻炎等持久性過敏症。此 外，鄰苯二甲酸二丁酯還能能導致糖尿病、肥胖症等。
因此，鄰苯二甲酸二丁酯檢測已成為食品安全、環境監測、毒理學研究等領域的重 要工作。由於鄰苯二甲酸二丁酯在水環境、生物體內的含量較低，常常在檢測域以下，因此 鄰苯二甲酸二丁酯的含量分析是一件非常困難的工作。
早期用含同位素14C的DBP飼餵實驗動物，然後檢測體內組織中的放射性水平來評 價DBP的水平。但是由於DBP在生物體內降解快，所檢測到的放射量只是DBP和降解代謝 物的總體水平，並不能代表DBP在生物組織內的真正含量。
現在DBP的分析多採用氣相色譜(GC)、HLPC、GC-質譜聯用法等色譜分析技術， 但這些技術需要進行樣品前處理等，耗時多，並且有較高的儀器要求，色譜柱等耗材價格昂 貴，此外，還需要操作人員有豐富的經驗。
免疫分析由於選擇性強、靈敏度高，一次可檢測多種樣品，因此把免疫分析技術應 用於DBP檢測具有簡便、快速、成本低的優點。張明翠等用一種DBP的多克隆抗體，通過免疫 組化法分析了水和包裝的食品中DBP的含量。Yanaihara等運用酶聯免疫分析法(ELISA) 分析了鄰苯二甲酸酯類物質的含量。但是，這兩個研究都是基於多克隆抗體的免疫分析。多 克隆抗體對抗原的專一選擇性、靈敏度上都不及單克隆抗體。多克隆抗體受限於實驗動物， 不能無限制的獲取。此外，由於從不同動物個體中獲取的多克隆抗體的選擇性、靈敏度、效 價等都不同，因此用多克隆抗體建立同一標準的免疫分析方法就很困難。發明內容
針對現有技術的不足，本發明所要解決的技術問題是提供操作簡便、靈敏度高的檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法。
本發明利用DBP結構類似物作為半抗原連接載體蛋白OVA而製得人工抗原，該人工抗原免疫小鼠所得脾細胞和瘤細胞雜交融合而篩選得到能穩定分泌DBP單克隆抗體的細胞株，小鼠腹水法大量製備DBP單克隆抗體。取待測生物組織樣品製成冰凍切片，用該 DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過螢光二抗標示DBP的分布。通過圖像分析軟體IPP分析螢光強度，從單位面積螢光值計算DBP的相對含量。
本發明所採用的技術方案是(O利用DBP結構類似物4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯(DBAP)作為半抗原連接載體蛋白 OVA而製得人工抗原，用該人工抗原免疫小鼠所得脾細胞和瘤細胞雜交融合，而篩選得到能穩定分泌DBP單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水法大量製備DBP單克隆抗體；(2)取待測生物組織樣品製成冰凍切片，用(I)所得DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過螢光二抗標示DBP的分布；(3)通過圖像分析軟體分析螢光強度，從單位面積螢光值計算DBP的相對含量。
本發明將單克隆抗體技術、免疫螢光技術和圖像分析軟體技術相結合。更具體地， 可採用如下步驟O用人工抗原DBAP-OVA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞並克隆化，通過小鼠腹水法大量製備單克隆抗體，再通過硫酸銨沉澱法純化DBP 單克隆抗體；2)抗體效價檢測；3)載玻片預處理將載玻片用王水浸泡過夜，大量流水衝洗乾淨並晾乾，再在DEPC水配製的多聚賴氨酸溶液中浸泡30min，室溫晾乾備用；4)生物組織材料切片和封閉取待測生物組織樣品用4%PFA固定I小時，再用液氮冰凍並用OCT包埋樣品，用冰凍切片機 在_20°C下將包埋樣品切成5-10 μ L薄片，將冰凍切片貼於載玻片上在37°C烘乾lh，冷卻至室溫，在臥式染缸中用PBS將載玻片洗3次，每次 IOmin ;用5%的溶於PBS的奶粉在室溫下封閉Ih ；5)DBP單克隆抗體結合DBP :用PBS衝洗載玻片洗去牛奶，加入DBP單克隆抗體孵育， 每片加200yL 1%溶於PBS的奶粉，按1:100比例稀釋DBP單克隆抗體，4°C孵育過夜；取出玻片，放入臥式染缸用PBST (PBS+0. l%Tween-20)在搖床上洗5次，每次IOmin;再用PBS 在搖床上洗3次,每次IOmin;6)二抗標記DBP單克隆抗體加入二抗和PI孵育液(1:100稀釋FITC-標記羊抗鼠血清，lOyg/ml PI，2%正常羊血清，溶於PBS)黑暗中室溫孵育lh;取出玻片，放入臥式染缸用 PBS在搖床上洗6次，每次IOmin;7)用抗淬滅劑封片，用雷射共聚焦顯微鏡觀察並拍照，使用圖像軟體分析螢光強度， 從單位面積螢光值計算DBP的相對含量。
比較分析各樣品DBP含量時，顯微鏡的波長等參數應一致。
本發明對DBP含量和分布可以進行可視化分析，靈敏度高，方便快捷，穩定性好， 成本低廉，且由於本發明的單克隆抗體對DBP特異性強，因此檢測結果不受其它酞酸酯的影響。本發明可以廣泛適用於檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯的含量，評價環境中鄰苯二甲酸二丁酯的汙染水平。
圖1顯示的是將大鼠通過皮膚塗抹400mg/kg/d DBP染毒五天後，取皮膚組織製成 冰凍切片，通過基於DBP單克隆抗體的免疫螢光技術分析DBP在皮膚組織內的分布。
上排為DBP染毒組左為FITC綠色突光顯示DBP的分布；中為PI染色顯示細胞 核；右為前兩者的融合照片。
下排為未染毒對照組左為FITC綠色螢光顯示DBP;中為PI染色顯示細胞核；右 為前兩者的融合照片。
圖2顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露於400mg/kg/d的DBP，染毒五天後，24小時 內取腎組織製成冰凍切片，通過基於DBP單克隆抗體的免疫螢光技術分析DBP在腎組織內 的分布。
上排為DBP染毒組左為FITC綠色突光顯示DBP的分布；中為PI染色顯示細胞 核；右為前兩者的融合照片。
下排為未染毒對照組左為FITC綠色螢光顯示DBP;中為PI染色顯示細胞核；右 為前兩者的融合照片。
圖3顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露於400mg/kg/d的DBP，染毒五天後，24小時 內取腎、肝、胃、睪丸組織製成冰凍切片，通過基於DBP單克隆抗體的免疫螢光技術分析DBP 在各組織內的分布，再通過IPP軟體分析雷射共聚焦照片的螢光強度而計算DBP的相對含量。
圖4顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露於400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒 結束後的24小時、48小時、72小時採集腎組織樣品製成冰凍切片，通過基於DBP單克隆抗 體的免疫螢光技術分析DBP在腎組織內的分布，再通過IPP軟體分析雷射共聚焦照片的熒 光強度而計算DBP的相對含量。
圖5顯示的是通過灌胃法將大鼠暴露於400mg/kg/d的DBP，染毒五天，分別在染毒 結束後的24小時、48小時、72小時採集肝組織樣品製成冰凍切片，通過基於DBP單克隆抗 體的免疫螢光技術分析DBP在肝組織內的分布，再通過IPP軟體分析雷射共聚焦照片的熒 光強度而計算DBP的相對含量。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明。
一、實驗材料1.分泌抗DBP單克隆抗體的雜交瘤細胞株由華中師範大學生命科學學院環境科學實 驗室保存，可對外發售。該雜交瘤細胞細胞能穩定分泌抗體，生長狀態良好。
2. 10周齡BALB/C小鼠，購自湖北省疾病控制 3. 6周齡Wistar大鼠中心二、實驗方法1.實驗動物染毒處理6周齡Wistar大鼠購自湖北省疾病控制中心，每籠2-3隻飼養在22±3 C和溼度為 55± 10%房間裡，可自由進食和飲水。將DBP溶解在玉米油中分別通過灌胃方式、皮膚塗抹方式暴露5天，暴露劑量為400mg/kg/d，分別在染毒結束後的24小時、48小時、72小時取大鼠皮膚、肝、腎、胃、睪丸等組織固定。
2.抗DBP單克隆抗體製備取10周齡BALB/C小鼠，腹腔注射O. 5ml滅菌石蠟油。10天後。取生長狀態良好的雜交瘤細胞，用PBS漂洗，吹下，IOOOrpm離心5min收集細胞，O. 4mlPBS重懸細胞。注射到石蠟處理過的小鼠腹腔內，10-12天後收集小鼠腹水，IOOOrpm離心5min沉澱細胞，收集細胞上清。
3.硫酸銨沉澱法純化DBP單克隆抗體1)取腹水與醋酸鹽緩衝液按1:2混合，再加入33μ I正辛酸，室溫攪拌30min，4°C靜置2h。
2)4。。12000g 離心 15min，取上清調 pH 值到 7. 4。
3)向上清液中加入等體積飽和硫酸銨溶液，攪拌30min，4°C靜置lh。
4)4°C 12000g離心15min，棄上清，用4ml半飽和硫酸銨溶液洗滌後，再溶於PBS中。
5)向懸液中加適量飽和硫酸銨溶液使飽和度為33%，攪拌30min，4°C靜置lh。6)4°C 12000g離心15min，棄上清，再溶於PBS中，用100倍體積的PBS4°C透析 24h，8h換一次液。
7)取透析後樣品測定蛋白含量並用SDS-PAGE檢測抗體純度。
4抗體效價測定O包被用包被緩衝液將人工抗原(DBAP-BSA)稀釋到O. 25 μ g/ml或O. 5μ g/ml， 100 μ L/空加入酶標板中，同時設置加有100 μ L包被緩衝液的對照孔，4°C過夜；2)封閉倒出酶標板內孔內液體，拍幹，每孔加入250μL1%0VA，37°C封閉lh，倒出酶標板內孔內液體，拍幹；每孔加入200 μ L洗滌緩衝液洗板，倒出孔內液體，拍幹；重複洗3次;3)用抗體稀釋液將DBP單抗從1:500開始2倍梯度稀釋後加入酶標板孔內，37°C孵育 lh，倒出酶標板內孔內液體，拍幹；每孔加入200 μ L洗滌緩衝液洗板，倒出孔內液體，拍幹； 重複洗3次；4)加酶標二抗用抗體稀釋液將HRP標記羊抗小鼠IgG以1:10000稀釋，100μ L每孔加入酶標板中，37°C孵育lh，倒出酶標板內孔內液體，拍幹；每孔加入200 μ L洗滌緩衝液洗板，倒出孔內液體，拍幹；重複洗3次；5)顯色每孔加入新鮮配製的底物顯色液，室溫避光反應15min；6)終止每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4終止反應；7)用酶標儀測定492nm處吸光度值；吸光度接近1.O處的抗體稀釋度1:1600為抗體的工作濃度；5.冰凍切片1)載玻片預處理將載玻片用王水浸泡過夜，大量流水衝洗乾淨並晾乾，再在DEPC水配製的多聚賴氨酸溶液中浸泡30min,室溫晾乾備用；2)生物組織材料固定取步驟I中準備的大鼠皮膚、肝、腎、胃、睪丸生物組織材料用4%PFA固定I小時；3)冰凍切片製作a.用液氮冰凍並用OCT包埋生物樣品；b.用冰凍切片機在_20°C下將包埋樣品切成5-10μ L薄片製成冰凍切片；c.將貼有樣品的玻片在37°C烘乾Ih；4)封閉切片烘乾後，冷卻至室溫，在臥式染缸中用PBS將玻片洗3次，每次IOmin ;用5%的奶粉(溶於PBS)在室溫下封閉Ih ；5)DBP單克隆抗體結合DBPa.PBS衝洗玻片數次，洗去牛奶；b.加入DBP單克隆抗體孵育(1:100稀釋DBP單克隆抗體，1%奶粉，溶於PBS中，每片加200μυ，4 孵育過夜；c.取出玻片，放入臥式染缸用PBST(PBS+0.l%Tween-20)在搖床上洗5次。每次IOmin;d.再用PBS在搖床上洗3次，每次IOmin;6)二抗標記DBP單克隆抗體a.加入二抗和PI孵育液(1:100稀釋FITC-標記羊抗鼠血清，10 μ g/ml PI，2%正常羊血清，溶於PBS)黑暗中室溫孵育·Ih;b.取出玻片，放入臥式染缸用PBS在搖床上洗6次，每次IOmin;7)封片用抗淬滅劑封片；8)用Leica雷射共聚焦顯微鏡觀察並拍照比較分析各樣品DBP含量時，顯微鏡的波長等參數應一致。
9)圖像軟體分析螢光強度使用IPP軟體分析螢光強度的操作步驟a.雙擊IPP，下拉菜單「File(橫I )」，用「Open」打開圖形文件;b.左鍵單擊下拉菜單「Edit(橫2)」,用「Convert To」,選取「Gray Scale 8」,使圖形文件灰化；c.左鍵單擊下拉菜單「Enhance(橫5)」,用「 Invert Image」,使圖形文件反色,生成文件「untitledOOl」 ；d.左鍵單擊「照相機」圖標(下排倒數第8個圖標)，生成拷貝文件「untitled002」e.左鍵單擊下拉菜單「Edit(橫2)」,用「Convert To」,選取「Gray Scale 8」,使圖形文件再次灰化，出現「untitled003」 ；f.左鍵單擊下拉菜單「Measure(橫7)」,用「Calibration」,選取「intensity」,對圖形文件進行校正；g.對「校正對話框」最小化；h.左鍵單擊下拉菜單「Measure(橫7)」,用左鍵單擊「Count/Size」,跳出「Count/Size 對話框」;1.左鍵單擊「Count/Size對話框」中的「SelectColors…跳出「Segmentation對話框」；j.左鍵單擊「Segmentation對話框」中的「Histogram Based」,將紅色/或綠色調整合適的程度(很重要，例如將3x3後面的下限調至O ;上限調至240);下圖為「肝臟_DBP」圖片。
k.左鍵單擊 「Segmentation 對話框」中的 「Close」 按鈕，關閉 「Segmentation 對話框」；1.回到「Count/Size對話框」,左鍵單擊「Count」按鈕,等一會,「untitled003」文件部分變紅；m.在「Count/Size對話框」中，左鍵單擊「Vie w」,在下拉菜單中選擇「Statistics」， η.自動跳出統計結果「Statistics表格/對話框」；O.在「Statistics表格/對話框」中，左鍵單擊「File」，然後單擊「Export Data」，輸出「Excel」數據表。
p.以以相對的IOD SUM作為DBP的相對含量。
權利要求
1.一種檢測生物體內鄰苯二甲酸二丁酯相對含量的方法，其特徵在於 (1)利用DBP結構類似物4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯作為半抗原連接載體蛋白OVA而製得人工抗原，用該人工抗原免疫小鼠所得脾細胞和瘤細胞雜交融合，而篩選得到能穩定分泌DBP單克隆抗體的細胞株，通過小鼠腹水法大量製備DBP單克隆抗體； (2)取待測生物組織樣品製成冰凍切片，用(I)所得DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過螢光二抗標示DBP的分布； (3)通過圖像分析軟體分析螢光強度，從單位面積螢光值計算DBP的相對含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，包括如下步驟 1)用人工抗原DBAP-OVA免疫小鼠，取免疫小鼠脾細胞與瘤細胞融合，篩選出陽性雜交瘤細胞並克隆化，通過小鼠腹水法大量製備單克隆抗體，再通過硫酸銨沉澱法純化DBP單克隆抗體； 2)抗體效價檢測； 3)載玻片預處理將載玻片用王水浸泡過夜，大量流水衝洗乾淨並晾乾，再在DEPC水配製的多聚賴氨酸溶液中浸泡30min，室溫晾乾備用； 4)生物組織材料切片和封閉取待測生物組織樣品用4%PFA固定I小時，再用液氮冰凍並用OCT包埋樣品，用冰凍切片機在_20°C下將包埋樣品切成5-10 u L薄片，將冰凍切片貼於載玻片上在37°C烘乾lh，冷卻至室溫，在臥式染缸中用PBS將載玻片洗3次，每次IOmin ；用5%的溶於PBS的奶粉在室溫下封閉Ih ； 5)DBP單克隆抗體結合DBP:用PBS衝洗載玻片洗去牛奶，加入DBP單克隆抗體孵育，每片加200 ii L 1%溶於PBS的奶粉，按1:100比例稀釋DBP單克隆抗體，4°C孵育過夜；取出玻片，放入臥式染缸用PBST (PBS+0. l%Tween-20)在搖床上洗5次，每次IOmin;再用PBS在搖床上洗3次,每次IOmin; 6)二抗標記DBP單克隆抗體加入二抗和PI孵育液(1:100稀釋FITC-標記羊抗鼠血清，10iig/ml PI，2%正常羊血清，溶於PBS)黑暗中室溫孵育lh;取出玻片，放入臥式染缸用PBS在搖床上洗6次，每次IOmin; 7)用抗淬滅劑封片，用雷射共聚焦顯微鏡觀察並拍照，使用圖像軟體分析螢光強度，從單位面積螢光值計算DBP的相對含量。
全文摘要
本發明提供了一種檢測生物體內組織鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)相對含量的方法。利用DBP人工抗原免疫小鼠而製得DBP單克隆抗體，用DBP單克隆抗體與生物組織樣品中的DBP結合，再通過螢光二抗標示DBP的分布。本發明還可以通過圖像分析軟體分析螢光強度，從而計算DBP的含量。本發明對DBP的含量和分布可以進行可視化分析，靈敏度高，方便快捷，穩定性好，成本低廉。
文檔編號G01N33/577GK102998454SQ20121053105
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者陳明清, 楊旭, 曾強, 魏晨曦, 袁均林, 丁書茂 申請人:華中師範大學