載脂蛋白A1的快速提取及分離純化方法與流程
2023-05-23 05:02:24
載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法
技術領域
1.本發明涉及蛋白表達領域，具體涉及載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法。
背景技術：
2.載脂蛋白a1(簡稱載脂蛋白a1)由肝臟和小腸合成，為一種含有243個胺基酸的單鏈多肽，在血漿中半衰期為45d，含量為1.00～1.60g/l。載脂蛋白a1主要存在於hdl中，在hdl3中載脂蛋白a1佔載脂蛋白的65％，在hdl2中載脂蛋白a1佔載脂蛋白的62％，在cm、vldl和ldl中也有少量存在。載脂蛋白a1組成載脂蛋白並維持其結構的穩定性與完整性，可以激活卵磷脂膽固醇醯基轉移酶(lcat)的活性，在膽固醇和脂蛋白代謝中起重要作用。目前認為，載脂蛋白a1的含量與冠狀動脈的病變程度呈負相關，可以作為心腦血管疾病診斷的輔助指標。因而臨床檢測載脂蛋白a1的濃度主要用於心腦血管疾病危險性的預測，載脂蛋白a1降低可見於冠心病、腎病症候群、營養不良、肝功能低下和糖尿病等。
3.目前普遍採用免疫比濁法測檢測臨床樣本中載脂蛋白a1的含量，載脂蛋白a1可用於生化診斷試劑盒中的標準品及質控品；也可用於免疫原製備相應的抗體，免疫原用的載脂蛋白a1要求的純度非常高。生物製藥行業從人血漿中分離純化載脂蛋白a1的方法有低溫乙醇法、超速離心法、沉澱劑法、層析法等。但是低溫乙醇法也存在自身的缺點，製備過程需要控溫且需要乙醇沉澱，生產放大會耗費大批量的乙醇。超速離心法對離心機設備要求較高，且離心耗時較長。沉澱劑法因分離時間較長,且需要多種試劑。
4.採用粗純加精純的方法可獲得高純度的載脂蛋白a1，主要方法就是通過物理吸附先將血漿中的脂蛋白分離出來，再通過洗脫得到粗提物，最後通過層析得到高純度的載脂蛋白a1。氣相二氧化矽作為一種極其重要的高科技超微細無機新材料之一，具有多孔性，無毒無味無汙染，粒徑小、比表面積大的特性，使得它具有良好的吸附性能，因此可作為血漿或血清脫脂劑，用於載脂蛋白的富集。目前已有二氧化矽作為吸附劑用於血清載體蛋白ai的提取，但提取得到的ai純度較低，還需要進一步處理，因此開發一種新的高純度載體蛋白ai的提純方法至關重要。
技術實現要素：
5.有鑑於此，本發明要解決的技術問題在於提供載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法。
6.本發明提供了載脂蛋白a1的製備方法，其步驟包括：血漿中加入氯化鈣反應獲得血清，在血清中加入氣相二氧化矽處理後經陰離子交換層析獲得載脂蛋白a1。
7.進一步的，所述血漿中氯化鈣的體積分數為0.1％～0.3％；所述血漿中加入氯化鈣反應的條件為：室溫，攪拌2～4小時；所述血漿中加入氯化鈣後還包括低溫離心的步驟；所述低溫離心的條件為：4℃、8000rpm～10000rpm，離心10～20分鐘。
8.本發明中，所述氣相二氧化矽處理的步驟包括：在血清中加入二氧化矽吸附、第一離心、第一洗滌、第二洗滌、洗脫和第二離心；
9.所述血清中氣相二氧化矽的體積分數為2％～3％；
10.所述氣相二氧化矽吸附的條件為：室溫，攪拌6～12h；
11.所述第一離心的條件為4℃，8000～10000rpm離心10～20分鐘；
12.所述第二離心的條件為4℃，8000～10000rpm離心10～20分鐘；
13.所述第一洗滌的試劑為氯化鈉溶液；
14.所述第二洗滌的試劑為tris-hcl溶液；
15.所述洗脫的試劑為含有體積分數為10％～20％乙醇的tris-hcl緩衝液。
16.進一步的，所述氣相二氧化矽處理的步驟中，
17.所述第一洗滌的試劑為含有0.4m～0.6m氯化鈉的氯化鈉溶液；所述第一洗滌的次數為3次，所述第一洗滌的條件為攪拌10～30分鐘；
18.所述第二洗滌的試劑為含有15mm～25mm tris的ph為7.40的tris-hcl溶液；所述第二洗滌的次數為2次，所述第二洗滌的條件為攪拌1～2小時；
19.所述洗脫的試劑為含有10％～20％乙醇的ph 7.40的tris-hcl溶液；所述tris-hcl溶液中tris的濃度為15mm～25mm；所述洗脫的次數為3～5次。
20.所述第一洗滌和第二洗滌每次獨立的洗滌之後包括離心的步驟，所述離心的條件為4℃，8000～10000rpm離心10～20分鐘。
21.本發明所述的製備方法中，
22.所述陰離子交換層析的層析液為含有0.5mm～1.5mm edta和6m～8m尿素的tris-hcl緩衝液，所述tris-hcl緩衝液中tris的濃度為5～25mm，所述tris-hcl緩衝液的ph為7.0～9.0；
23.所述陰離子交換層析後還包括保存的步驟，所述保存為陰離子交換層析獲得的載脂蛋白a1溶液中添加體積分數為0.1％～0.3％ proclin300和體積分數為20％～40％的甘油。
24.進一步的，所述陰離子交換層析中血漿體積與層析填料的體積比為25：1；所述層析填料為deae sepharose；
25.所述陰離子層析的條件為：上樣流速2～4ml/min，上樣濃度2～4mg/ml。
26.本發明提供了血漿載脂蛋白a1純化試劑盒，其包括氯化鈣、氣相二氧化矽、第一洗滌液、第二洗滌液、洗脫液、層析液；
27.所述第一洗滌液為氯化鈉溶液；
28.所述第二洗滌液為tris-hcl溶液；
29.所述洗脫溶液為含10％～20％乙醇的tris-hcl緩衝液；
30.所述層析液含有edta和尿素的tris-hcl緩衝液。
31.進一步的，本發明所述的試劑盒中，
32.所述第一洗滌液為含有0.5m氯化鈉的氯化鈉溶液；
33.所述第二洗滌的試劑為含有15mm～25mm tris的ph為7.40的tris-hcl溶液；
34.所述洗脫溶液為含有10％～20％乙醇的ph 7.40的tris-hcl溶液；所述tris-hcl溶液中tris的濃度為15mm～25mm；
35.所述層析液為含有0.5mm～1.5mm edta和6～8m尿素的tris-hcl緩衝液，所述tris-hcl緩衝液中tris的濃度為5～25mm，所述tris-hcl緩衝液的ph為7.0～9.0。
36.本發明所述的製備方法中，所述載脂蛋白a1分離於血漿，其包括血漿中加入氯化鈣反應獲得血清，在血清中加入氣相二氧化矽處理後經陰離子交換層析獲得載脂蛋白a1。與傳統的血漿中純化載脂蛋白a1的方法相比較，在氣相二氧化矽處理前加入氯化鈣處理，去除纖維蛋白，減少纖維蛋白對載脂蛋白a1的幹擾，從而利於載脂蛋白a1的純化，一些具體的對比例的實驗結果也證明了加入氯化鈣後載脂蛋白a1的收率提高了一倍。且本發明在載脂蛋白a1純化過程中，加入了多次清洗的步驟，進一步提高了載脂蛋白a1純化的純度，也更利於下一步純化。同時採用針對性配製的層析液進行deae陰離子層析，所述的載脂蛋白a1存在於流穿液中，無需洗脫過程即可到目的蛋白載脂蛋白a1，進一步簡化了工藝，縮短純化時間，減少了載脂蛋白a1的損耗和試劑的用量。實驗表明，在本發明提供的載脂蛋白a1的製備方法中使用的試劑和實驗步驟參數，相互影響，彼此配合，共同對載脂蛋白a1的純化效果產生影響，最終使獲得的載脂蛋白a1純度大於95％，載脂蛋白a1的收率達到300～400mg/l。
37.本發明採用物理吸附的方法將脂蛋白從人血漿中分離出來，然後經洗雜、洗脫後、再結合離子交換層析得到高純度載脂蛋白a1。本發明所述的純化工藝簡單易行，重複性好，活性和穩定性較好，便於放大生產，且獲得的載脂蛋白a1純度可達95％以上，可作為免疫原以及診斷試劑產品中的校準品以及質控品，具有較高的開發應用價值。
附圖說明
38.圖1示本發明實施例1、實施例2和實施例3中步驟(4)提取得到的粗提物的sds-page圖譜；
39.圖2示是本發明實施例1、實施例2和實施例3經陰離子層析後的純化得到的載脂蛋白a1的sds-page圖譜；
40.圖3示是本發明實施例1純化得到的載脂蛋白a1樣品凍融1次、3次、5次、7次和37℃加速1天、3天、5天、7天的sds-page圖譜；
41.圖4示0.5m氯化鈉和20mm tris-hcl ph7.40沉澱洗滌次數電泳圖；
42.圖5示20％乙醇的20mm tris-hcl ph7.4沉澱洗滌次數電泳圖；
43.圖6示30ml deae填料純化電泳圖；
44.圖7示40ml deae填料純化電泳圖；
45.圖8示50ml deae填料純化電泳圖。
具體實施方式
46.本發明提供了載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
47.本發明採用的試材皆為普通市售品，皆可於市場購得。
48.下面結合實施例，進一步闡述本發明：
49.實施例1載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法1
50.步驟1、取1l正常人血漿，解凍後充分恢復至室溫，稱取2.00g無水氯化鈣固體粉
末。緩慢倒入血漿中，室溫連續攪拌2小時，至纖維蛋白出現。在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，去除纖維蛋白沉澱，收集上清；
51.步驟2、在通風櫥中稱取氣相二氧化矽20.00g，加入到上一步得到的上清中，邊加邊攪拌。容器用保鮮膜封口，室溫攪拌6小時。在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，收集離心後的沉澱；
52.步驟3、將上一步得到的沉澱先後用0.5m氯化鈉溶液洗滌3次、20mm tris-hcl ph 7.40溶液洗滌2次，每次用量500ml，玻璃棒分散開之後機械攪拌10分鐘。然後在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，離心收集沉澱；
53.步驟4、將上一步洗滌後的沉澱用含體積分數為10％乙醇的20mm tris-hcl ph7.40溶液洗脫3次，每次用量500ml，玻璃棒分散開之後機械攪拌1小時。然後在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，收集離心上清得到載脂蛋白a1粗提物，其sds-page電泳圖見圖1中的條帶1；
54.步驟5、將上一步得到的粗提物用5mm tris+1mm edta+6m尿素ph8.0溶液洗濾後過濾，使用的離子交換層析為deae層析，deae柱平衡所用緩衝液為ph8.0的5mm tris+1mm edta+6m尿素溶液，上樣流速為2ml/min，上樣濃度為3mg/ml，收集流穿液。
55.步驟6、將上一步得到的流穿液用10kd中空纖維柱洗濾濃縮，加入體積分數為0.1％ p300和20％甘油，≤-20℃凍存。
56.實施例2載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法2
57.步驟1、取1l正常人血漿，解凍後充分恢復至室溫，稱取2.00g無水氯化鈣固體粉末。緩慢倒入血漿中，室溫連續攪拌3小時，至纖維蛋白出現。在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，去除纖維蛋白沉澱，收集上清；
58.步驟2、在通風櫥中稱取氣相二氧化矽30.00g，加入到上一步得到的上清中，邊加邊攪拌。容器用保鮮膜封口，室溫攪拌8小時。在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，收集離心後的沉澱；
59.步驟3、將上一步得到的沉澱先後用0.5m氯化鈉溶液洗滌3次、20mm tris-hcl ph7.40溶液洗滌2次，每次用量500ml，玻璃棒分散開之後機械攪拌30分鐘。然後在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，離心收集沉澱；
60.步驟4、將上一步洗滌後的沉澱用含體積分數為20％乙醇的20mm tris-hcl ph7.40溶液洗脫3次，每次用量500ml，玻璃棒分散開之後機械攪拌1.5小時。然後在4℃、10000rpm條件下離心10分鐘，收集離心上清得到載脂蛋白a1粗提物，其sds-page電泳圖見圖1中的條帶2；
61.步驟5、將上一步得到的粗提物用5mm tris+1mm edta+6m尿素ph8.0溶液洗濾後過濾，使用的離子交換層析為deae層析，deae柱平衡所用緩衝液為ph8.0的10mm tris+1mm edta+6m尿素溶液，上樣流速為3ml/min，上樣濃度為2mg/ml，收集流穿液。
62.步驟6、將上一步得到的流穿液用10kd中空纖維柱洗濾濃縮，加入體積分數為0.2％ proclin300和體積分數為30％甘油，≤-20℃凍存。
63.實施例3本發明所述的載脂蛋白a1的快速提取及分離純化方法3
64.步驟1、取1l正常人血漿，解凍後充分恢復至室溫，稱取2.00g無水氯化鈣固體粉末。緩慢倒入血漿中，室溫連續攪拌4小時，至纖維蛋白出現。在4℃、8000rpm條件下離心20
分鐘，去除纖維蛋白沉澱，收集上清；
65.步驟2、在通風櫥中稱取氣相二氧化矽20.00g，加入到上一步得到的上清中，邊加邊攪拌。容器用保鮮膜封口，室溫攪拌12小時。在4℃、8000rpm條件下離心20分鐘，收集離心後的沉澱；
66.步驟3、將上一步得到的沉澱先後用0.5m氯化鈉溶液洗滌3次、20mm tris-hcl ph7.40溶液洗滌2次，每次用量500ml，玻璃棒分散開之後機械攪拌30分鐘。然後在4℃、8000rpm條件下離心20分鐘，離心收集沉澱；
67.步驟4、將上一步洗滌後的沉澱用含10％乙醇的20mm tris-hcl ph7.40溶液洗脫3次，每次用量500ml，玻璃棒分散開之後機械攪拌2小時。然後在4℃、8000rpm條件下離心20分鐘，收集離心上清得到載脂蛋白a1粗提物，其sds-page電泳圖見圖1中的條帶3；
68.步驟5、將上一步得到的粗提物用5mm tris+1mm edta+6m尿素ph8.0溶液洗濾後過濾，使用的離子交換層析為deae層析，deae柱平衡所用緩衝液為ph 8.0的5mm tris+1mm edta+8m尿素溶液，上樣流速為2ml/min，上樣濃度為2mg/ml，收集流穿液。
69.步驟6、將上一步得到的流穿液用10kd中空纖維柱洗濾濃縮，加入體積分數為0.3％ proclin300和體積分數為40％甘油，≤-20℃凍存。
70.實施例4本發明所述的載脂蛋白a1的純度和性能測定
71.(1)載脂蛋白a1純度分析：將實施例1、實施例2和實施例3得到的載脂蛋白a1分別取10μl，用20mm tris-hcl ph7.4稀釋至1mg/ml，取樣20μl，進行15％ sds-page變性非還原膠(附mark)檢測，考馬斯亮藍染色後使用molecular imager凝膠成像儀分析目的蛋白的純度，如圖2所示：條帶1、2、3分別是本發明實施例1、實施例2和實施例3純化得到的載脂蛋白a1的sds-page圖譜，載脂蛋白a1的純度均大於95％。
72.(2)載脂蛋白a1穩定性測定：取實施例1純化得到的載脂蛋白a1樣品凍融1次、3次、5次、7次穩定性和37℃加速1天、3天、5天、7天熱穩定性，採用北京安圖的載脂蛋白a1(apoa1)測定試劑盒(免疫比濁法)檢測載脂蛋白a1的活性濃度，樣品均稀釋4倍測定。檢測結果如表1所示，圖3為sds-page圖譜，可以看出凍融穩定性和熱穩定性較好，降幅均在10％以內，滿足需求。
73.表1.免疫比濁法檢測載脂蛋白a1的活性濃度
[0074][0075]
[0076]
實施例5載脂蛋白a1純化中一些參數及步驟調整的影響
[0077]
1、血漿轉血清工藝對氣相二氧化矽物理吸附的影響
[0078]
在氣相二氧化矽物理吸附前採用血漿轉血清工藝，即第一步先在血漿中加入氯化鈣除去纖維蛋白。結果表明，加入氯化鈣後可減少纖維蛋白對載脂蛋白a1提取的幹擾，從而利於載脂蛋白的提取。實驗數據如下表2所示，血漿轉血清之後目的蛋白apoai的收率可提高1倍，因此後續在氣相二氧化矽物理吸附前採用血漿轉血清工藝。
[0079]
表2.apoai收率對比數據
[0080][0081]
2、清洗次數對提取工藝的影響
[0082]
2.1 0.5m氯化鈉和20mm tris-hcl ph7.40清洗次數影響：
[0083]
血漿轉血清後加入氣相二氧化矽，攪拌、離心後得到固體沉澱，沉澱先後用0.5m氯化鈉溶液洗滌3次、tris-hcl ph 7.40溶液洗滌2次，實驗過程每一步洗滌後離心上清蛋白濃度數據如下表3所示，該洗雜次數和洗雜過程非常重要，洗雜不徹底會導致下一步沉澱中載脂蛋白a1粗提物中人血清白蛋白含量較高，進而影響deae純化得到的apoai的純度。
[0084]
表3.沉澱洗雜過程蛋白含量檢測結果
[0085][0086]
0.5m氯化鈉和20mm tris-hcl ph7.40清洗一次效果如圖4所示，圖中條帶4是離子層析後的目的蛋白條帶，有明顯的雜帶，純度較差，60％～70％。對比之下，洗滌次數影響差異很明顯。(註：表3洗雜過程的蛋白量為按步驟依次處理後得出的結果，其中0.5m氯化鈉洗滌第三次的蛋白濃度低於20mm ph 7.40tris-hcl洗滌第一次的蛋白含量的原因為緩衝體系的影響，經過多次嘗試和重複結果均類似；且表3中為總蛋白的含量)。
[0087]
2.2採用20％乙醇的20mm tris-hcl ph7.40洗滌不同次數對純化的影響
[0088]
用含10％乙醇的20mm tris-hcl ph7.40溶液對沉澱洗脫3次(活潑3～5次)，每洗滌一次洗滌液用量500ml(按1l人血漿計)，且洗滌時要將沉澱重懸並充分分散開，然後機械攪拌1～2小時，目的是保證目標蛋白洗脫徹底，提高得率。攪拌時間不夠，目的蛋白洗脫效果較差，洗脫得到的粗提物中目的蛋白含量較低，影響收率。洗滌次數對蛋白純化影響如圖5所示，結果表明20％乙醇的20mm tris-hcl ph7.40的洗滌次數對apoai蛋白純化影響較大。
[0089]
3、離子交換層析中填料體積的調整
[0090]
離子交換層析分離蛋白質是根據在一定ph條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的
分離方法，deae屬於離子交換層析的一種。本專利採用deae離子交換層析，將載脂蛋白a1粗提物上樣，deae優先吸附人血清白蛋白。這是由於粗提取中主要成分為人血清白蛋白和apoai，人血清白蛋白的等電點是4.7左右，apoai的等電點是5.4～6.5，所以deae先吸附人血清白蛋白，apoai流穿下來。因此，本專利在純化過程中目的蛋白apoai在流穿中，因此只需收集流穿液，無需洗脫過程即可到目的蛋白載脂蛋白ai，工藝簡單，縮短純化時間，減少試劑用量。
[0091]
經過調整deae填料的用量，可以達到人血清白蛋白全部被吸附而apoai流穿的效果。這樣一來，我們收集流穿液即可得到純度較高的目的蛋白。優化過程如下：
[0092]
1、填料用量為30ml時，將流穿液分管收集，電泳結果可以看出目的蛋白apoai純度較低，60％～70％，說明填料用量不夠，不能完全吸附人血清白蛋白，導致其流穿，如圖6所示(條帶2，3，4，5，6，7是一個樣品離子層析過程中不同時間分管收集得到的流穿液)。
[0093]
2、填料用量為40ml時，流穿液純度可達95％以上，收率可到361mg/l，如圖7所示。
[0094]
3、填料用量為50ml時，流穿液純度可達95％以上，但是收率僅為200mg/l，收率降低，這是由於填料用量過多，填料吸附不飽和，如圖8所示。具體數據如表4。對比得出，1l的血漿採用40ml較佳。
[0095]
表4.deae純化填料用量驗證
[0096][0097]
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。