一種小幹擾核酸和藥物組合物及其製藥應用的製作方法
2023-05-23 00:15:46 4
專利名稱：一種小幹擾核酸和藥物組合物及其製藥應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於抑制B型肝炎病毒基因表達的小幹擾核酸和含有該小幹擾 核酸作為活性成分的藥物組合物以及所述小幹擾核酸在製備用於預防和/或治療乙型肝 炎的藥物中的應用。
背景技術：
乙型病毒性肝炎簡稱B型肝炎，是一種由B型肝炎病毒(h印atitis Bvirus,HBV) 引起的傳染病。據世界衛生組織(WHO)統計，全球B肝病毒攜帶者超過了 20億人，其中3. 6 億B肝慢性患者的病情正在惡化，每年約有100萬人死於HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原發性肝細胞癌。中國是世界範圍內感染HBV人數最多的國家，B型肝炎病毒(HBV)感染率 高達57. 63%。全國現有慢性B肝病人2000萬，每年B肝新發病人數約50萬，每年有23. 7 萬人死於B型肝炎相關的疾病，其中有15. 6萬人死於肝癌。據中國肝炎防治基金會2006 年報導，我國每年用於治療慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接醫療耗費約300億元人民幣，HBV 造成的直接經濟損失約為3600億元/年。每人年均醫療花費高達觀864. 89元人民幣，是 我國2005年人均⑶P的2. 12倍。由此可見，B型肝炎不僅嚴重危害我國人民的健康，而且 還為國家帶來嚴重的社會經濟負擔。治療B肝的方法主要包括抗病毒複製、提高機體免疫功能、保護肝細胞、促進肝細 胞再生以及中醫藥治療、基礎治療及心理治療等綜合治療。全球公認的防治B型肝炎的藥 物主要可分為幹擾素、核苷類似物2大類。幹擾素作為B肝治療藥物已使用了較長時間，其 治療終末應答率只有30%，即使和其他抗病毒藥物聯合使用或增加劑量後，其治療終末應 答率也只有50%，且停藥、減量或減少注射次數後易復發，不良反應明顯增加。另外，長期使 用會誘發乾擾素抗體，失去藥效。核苷類似物起效快，但終末應答率也不高，且核苷類似物 只抑制肝細胞質內的病毒，對肝細胞核內的CCC-DNA沒有作用，需要長期維持用藥。長期用 藥面臨的最主要問題是病毒變異而引發的耐藥性，以及停藥後也易出現病毒反彈、復發率 高。更為嚴重的是少數病人停藥後出現肝功能急劇惡化，甚至死亡。從基因水平抑制HBV 的生成和複製來降低病毒代謝和對肝細胞的侵染無疑將是B肝最為理想的治療手段。RNA 幹擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-strandedRNA，dsRNA) 分子在mRNA水平關閉同源基因的表達或使該基因表達沉默的現象。但由於小幹擾核酸 (siRNA)的穩定性較差，在體內容易被核酸酶降解，因此人們對合成的siRNA進行化學修 飾，以增加siRNA的血清穩定性，從而有效地抑制目的基因的表達。目前，由於人們對小幹擾核酸在血清中的降解過程和機制缺乏足夠的了解，雖然 通過修飾在一定程度上提高了小幹擾核酸的穩定性，但由於引入了過量的修飾，導致修飾 後的小幹擾核酸的產生了潛在的細胞毒性，且修飾後的小幹擾核酸的生物學活性也受到很 大的影響。因此，開發出一種血清穩定的、具有良好生物活性的且細胞毒性較低的抑制乙型 肝炎病毒基因表達的小幹擾核酸成為迫切需要解決的問題。
發明內容
本發明解決的技術問題是克服現有的用於抑制B型肝炎病毒基因表達的小幹擾 核酸存在的細胞毒性高且生物活性差的缺點，提供一種具有血清穩定、良好生物活性的且 較低的細胞毒性特性的、用於抑制B型肝炎病毒基因表達的小幹擾核酸。B型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，基因組長約3. 2kb，為 部分雙鏈環狀DNA;B型肝炎病毒基因組含有4個開放讀碼框(0RF，S基因區、C基因區、P 基因區和X基因區)。S基因區包括S基因、前Sl基因和前S2基因，它們分別編碼S蛋白、M蛋白和L蛋 白；其中，S蛋白和M蛋白與B型肝炎病毒的嗜肝性、基因免疫及轉錄激活密切相關。C基因區包括前C基因和C基因，它們分別編碼核殼蛋白HBeAg和BcAg，該核殼 HBeAg和HBcAg是組成B型肝炎病毒核心部分的重要組成部分，是病毒複製的主體。P基因區包括P基因，編碼P蛋白，P蛋白含816個胺基酸，具有4個功能結構域， 包括具有反轉錄酶活性的DNA聚合酶、RNA酶H等，參與HBV複製的全過程。X基因區包括X基因，是HBV病毒基因組中最小的開放性讀碼框，編碼長度為IM 個胺基酸的蛋白，該蛋白能夠直接或間接地對病毒自身的複製與增殖產生影響，並且能夠 對宿主細胞中被感染的細胞的調亡和癌變過程產生影響。所述X、P、S、C基因的保守區在HBV基因組(Genbank登記號為U95551)相對位置 分別為 1376-1840bp,2309-3182bp 和 l-1625bpU57-837bpU816bp-2454bp0本發明提供了一種小幹擾核酸，其中，該小幹擾核酸的序列為正義鏈5，-GGAAACUACUGUU⑶UAGAdTdT-3，反義鏈5，-UCUAACAACAGUA⑶UUCCdTdT-3，；並且所述小幹擾核酸具有E1-E8之一所示方式的修飾El)正義鏈中5:3、方向第1位鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷 酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；E2)正義鏈中5:3、方向第1位鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2』-OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧 啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修 飾；E3)正義鏈中的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；E4)正義鏈中的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾， 第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E5)正義鏈中5:3、方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾， 第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氟修飾；反義鏈中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第2和9位胞嘧啶核苷酸 的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E6)正義鏈中5』_3』方向的第1、11和14位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』_0H位被 氧甲基修飾，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第8和17 位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5』 -3』方向的第2位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH 位被氟修飾，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E7)正義鏈中5』 -3』方向的第1位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基 修飾，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中 5』_3』方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氧甲基修飾，第6、18和19位的胞 嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH 位被氟修飾；E8)正義鏈中5』 -3』方向的第1位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基 修飾，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中 5』 _3』方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』-OH位被氧甲基修飾，第6和19位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氟修飾，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』_0H 位被氟修飾。本發明還提供了一種用於預防和/或治療B型肝炎的藥物組合物，其中，該藥物 組合物含有本發明提供的小幹擾核酸作為活性成分。此外，本發明還提供了本發明所述的小幹擾核酸在製備用於預防和/或治療乙型 肝炎的藥物中的應用。本發明提供的小幹擾核酸通過特異性的修飾，從而在僅引入少量修飾的情況下， 即可達到增加修飾後的小幹擾核酸的血清穩定性的目的，從而降低了修飾後的小幹擾核酸 分子的潛在的細胞毒性，以及修飾對小幹擾核酸的生物學活性的影響，從而提供了一種能 夠有效抑制B型肝炎病毒基因表達的小幹擾核酸。
圖1顯示了本發明實施例中的小幹擾核酸與對比例中的參比小幹擾核酸的血清 穩定性的檢測結果。圖2顯示了本發明實施例中的小幹擾核酸與對比例中的參比小幹擾核酸對乙型 肝炎病毒mRNA表達抑制活性的檢測結果。圖3顯示了本發明實施例中的小幹擾核酸與對比例中的參比小幹擾核酸對乙型 肝炎病毒的HBV的S抗原和E抗原表達的抑制率。圖4顯示了本發明實施例中的小幹擾核酸與對比例中的參比小幹擾核酸對小鼠 血清中ALT (丙氨酸氨基轉移酶)、AST (穀草轉氨酶)、LT (血清總蛋白)和LDH (乳酸脫氫 酶)的血液生化指標的影響。圖5顯示了本發明實施例中的小幹擾核酸與對比例中的參比小幹擾核酸對HBV轉 基因小鼠血清中HBsAg含量的影響。圖6顯示了本發明實施例中的小幹擾核酸與對比例中的參比小幹擾核酸對HBV轉基因小鼠肝組織中B型肝炎病毒的mRNA含量的抑制。
具體實施例方式本發明提供了一種小幹擾核酸，其中，該小幹擾核酸的序列為正義鏈5，-GGAAACUACUGUU⑶UAGAdTdT-3，反義鏈5，-UCUAACAACAGUA⑶UUCCdTdT-3，；並且所述小幹擾核酸具有E1-E8之一所示方式的修飾El)正義鏈中5:3、方向第1位鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷 酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；E2)正義鏈中5:3、方向第1位鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾， 第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第7、12、13、15和16尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2』-OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧 啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修 飾；E3)正義鏈中的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；E4)正義鏈中的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾； 反義鏈中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾， 第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E5)正義鏈中5:3、方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾， 第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氟修飾；反義鏈中5:3、方向第1、 3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第2和9位胞嘧啶核苷酸 的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E6)正義鏈中5』_3』方向的第1、11和14位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』_0H位被 氧甲基修飾，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第8和17 位的腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5』 -3』方向的第2位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH 位被氟修飾，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E7)正義鏈中5』 -3』方向的第1位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基 修飾，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中 5』_3』方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氧甲基修飾，第6、18和19位的胞 嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH 位被氟修飾；E8)正義鏈中5』 -3』方向的第1位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基 修飾，第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中 5』 _3』方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』-OH位被氧甲基修飾，第6和19位的胞嘧 啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氟修飾，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』_0H
7位被氟修飾。本發明的發明人對用於抑制B型肝炎病毒基因表達的小幹擾核酸及其修飾方式 進行了細緻的研究，發現，具有上述E1-E8之一所示核苷酸序列的小幹擾核酸不但血清穩 定性好，並且由於引入修飾的量很少，因而降低了修飾後的小幹擾核酸分子的潛在的細胞 毒性，並且小幹擾核酸的生物活性所受到的影響也非常小。本發明提供的小幹擾核酸的幹 擾靶位點序列具有SEQID NO :2所示的核苷酸序列，該核苷酸序列是指與如SEQ ID N0:1所 示B型肝炎病毒基因組(Genbank登記號為U95551)的2334-2352位相對應的B型肝炎病 毒的mRNA序列。
權利要求
1.一種小幹擾核酸，其特徵在於，該小幹擾核酸的序列為 正義鏈5，-GGAAACUACUGUU⑶UAGAdTdT-3，反義鏈5，-UCUAACAACAGUA⑶UUCCdTdT-3，； 並且所述小幹擾核酸具有E1-E8之一所示方式的修飾El)正義鏈中5:3、方向第1位鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第6 和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸 的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的 戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；E2)正義鏈中5:3、方向第1位鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』-0H位被氧甲基修飾，第6和 9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第7、12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的 戊糖的2』-0H位被氧甲基修飾；反義鏈中5、-3、方向第1、3、12、1 5、16和1 7位尿嘧啶核 苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾； E3)正義鏈中的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義 鏈中5:3、方向第4、5、7、8和13腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；E4)正義鏈中的鳥嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義 鏈中5:3、方向第1、3、12、15、16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第2 和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E5)正義鏈中5:3、方向第6和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』-OH位被氟修飾，第7、 12、13、15和16尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氟修飾；反義鏈中5、_3、方向第1、3、12、 15,16和17位尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氟修飾，第2和9位胞嘧啶核苷酸的戊糖 的2』 -OH位被氟修飾；E6)正義鏈中5』-3』方向的第1、11和14位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』-0H位被氧甲 基修飾，第7、13和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第8和17位的 腺嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5』 -3』方向的第2位的胞嘧啶核 苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第6和18位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被 氟修飾，第12位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾；E7)正義鏈中5』 -3』方向的第1位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾， 第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5』 -3』 方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾，第6、18和19位的胞嘧啶 核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第3、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被 氟修飾；E8)正義鏈中5』 -3』方向的第1位的鳥嘌呤核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾， 第7、10、13、15和16位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氧甲基修飾；反義鏈中5』 -3』 方向的第2位的胞嘧啶核苷酸的戊糖的2』-0H位被氧甲基修飾，第6和19位的胞嘧啶核苷 酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾，第3、15、16和17位的尿嘧啶核苷酸的戊糖的2』 -OH位被氟修飾。
2.根據權利要求1所述的小幹擾核酸，其中，該小幹擾核酸具有E2、E4-E8之一所示方 式的修飾。
3.根據權利要求1所述的小幹擾核酸，其中，該小幹擾核酸的正義鏈和反義鏈的_3』末端dTdT之間的磷酸二酯鍵被硫代磷酸修飾。
4.一種用於預防和/或治療B型肝炎的藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物含有 權利要求1-3中的任意一項所述的小幹擾核酸作為活性成分。
5.根據權利要求4所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射液，所述注射液還 含有藥學上可接受的載體，相對於100重量份的小幹擾核酸，所述藥學上可接受的載體的 含量為100-10000000重量份。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中，所述藥學上可接受的載體為PH值為 4. 0-9. 0的磷酸緩衝液、pH值為7. 5-8. 5的三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽緩衝液、生理鹽水或pH 為5. 5-8. 5的磷酸鹽緩衝液。
7.根據權利要求5所述的藥物組合物，其中，所述注射液還含有保護劑和/或滲透壓調 節劑；以所述注射液的總重量為基準，所述保護劑的含量為0. 01-30重量％，所述保護劑選 自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一種或幾種；所述滲透壓調節劑的含量使所述注射液的滲透壓 為200-700毫滲摩爾/千克，所述滲透壓調節劑為氯化鈉和/或氯化鉀。
8.權利要求1-3中的任意一項所述的小幹擾核酸在製備用於預防和/或治療B型肝炎 的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種小幹擾核酸，該小幹擾核酸的序列為正義鏈5』-GGAAACUACUGUUGUUAGAdTdT-3』；反義鏈5』-UCUAACAACAGUAGUUUCCdTdT-3』；所述小幹擾核酸具有E1-E8之一所示方式的修飾。本發明還提供了一種用於預防和/或治療B型肝炎的藥物組合物，該藥物組合物含有本發明提供的小幹擾核酸作為活性成分。本發明還提供了所述小幹擾核酸在製備用於預防和/或治療B型肝炎的藥物中的應用。本發明中通過特異性的修飾，從而在僅引入少量修飾的情況下，即可達到增加小幹擾核酸的血清穩定性的目的，從而降低了修飾後的小幹擾核酸分子的潛在的細胞毒性以及對生物學活性的影響。
文檔編號A61P31/20GK102140459SQ20101010676
公開日2011年8月3日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者張鴻雁, 梁子才 申請人:蘇州瑞博生物技術有限公司