用抗胚胎血紅蛋白抗體鑑別胎兒細胞的方法

2023-05-23 06:07:31 3

專利名稱：用抗胚胎血紅蛋白抗體鑑別胎兒細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種從血樣中分離和鑑別胎兒細胞的方法。更具體地說，是涉及在孕婦的血樣中，從母親的細胞中分離和鑑別胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞。
背景技術：
胎兒的組織，特別是胎兒的DNA和染色體通常用來做產前診斷及要求對胎兒的基因組進行精確估價時的其它醫療程序。目前，用羊膜穿刺術、絨毛膜取樣(CVS)、胎兒鏡或臍帶穿刺術可以得到胎兒的組織。上述方法在Thompson和Thompson著的Genetics in Medicine,5th Edition,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,1991中進行了描述。
在羊膜穿刺術中，含胎兒細胞的羊水樣品用針管和注射器穿過母親的腹部取出。羊膜穿刺術有其固有的危險性。主要的危險是會引起流產，據估計，每200個用羊膜穿刺術的人中會有1個人流產。其他危險包括母親感染及對胎兒肉體的損傷。在CVS中，通過貫穿子宮和貫穿腹部自絨毛膜區域吸出營養細胞組織，用這種方法造成胎兒死亡的機率高達1％。臍帶穿刺術或經臍帶血取樣提供了一種在超聲波引導下直接從臍帶取出血樣的方法。上述每一種進入的方法均同時給母親和胎兒帶來危險。
因此，理想的是發明一種不進入的方法得到胎兒的組織或胎兒的DNA。或者，為便於保護和在臨床實驗室中進行診斷，需要發明一種快速而且可靠的，從母親的組織中分離和富集胎兒組織的方法。最近，發現了一種在母親的末梢循環中鑑別胎兒細胞，並儲存這些細胞用來作遺傳分析的優選方法。
從母親的血液中鑑別或分離胎兒細胞有賴於從較多的大量的母親細胞中區別出很少的胎兒細胞。雖然各種胎兒細胞，如胎兒淋巴細胞和滋養層作為目標細胞已經用於胎兒DNA的鑑別，但是，更多的努力則集中於對胎兒的成核紅細胞(nRBC)，也就是已知的成核紅血球細胞的鑑別。參見Cheuh和Golbus,「The search for Fetal Cells in the MaternalCirculation」,J.Perinatol.Med.,19:411(1991)；Simpson等人,「NoninvasiveScreening for Prenatal Genetic Diagnosis」,Bull.WHO,73:799(1995)；及Cheuh和Golbus,「Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells from MaternalCirculation」,West.J.Med.,159(3):308(1993)。
一般認為，胎兒的紅細胞作為經胎盤出血而穿過胎盤。因為胎兒擁有大量成核紅血球細胞，這些成核紅血球細胞在成人的血液中很少被發現，因此，成核現象這種區別在從母親的細胞中分離和鑑別胎兒細胞的過程中是非常有用的。
細胞表面抗原抗體，特別是成核紅細胞抗體，如鐵蛋白受體，已經被用於鑑別和富集這些胎兒細胞。請參見Bianchi等人「Isolation of FetalDNA from Nucleated Erythrocytes in Maternal Blood」,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3279(1990)及Bianchi等人PCT國際申請號為PCT/US90/06623的國際申請(WO 91/07660)，其中描述了用與一種在胎兒細胞表面上的抗原相結合的抗體富集末梢血樣中的胎兒成核紅血球細胞方法。
Bresser等人在PCT國際申請號為PCT/US94/08342(WO 95/03431)的國際申請中描述了一種用胎兒血紅蛋白抗體和mRNA探針富集母親血液中胎兒細胞的方法。胎兒血紅蛋白的存在也被Kleihauer-Betke反應所證明，該反應用酸淘析特性從成人血紅蛋白中區分出胎兒血紅蛋白。請參見Kleihauer等人「Demonstration von fetalem hamoglobin in denerythrocyten eines blutausstrichs」,Klin.Woschenschr,35:637(1957)及Saunders等人「Enrichment of fetal cells from maternal blood for geneticanalysis」,American Journal of Human Genetics,57:287(1995)。
對胎兒基因組的遺傳分析已經通過在原位將染色體或基因特異性的DNA或RNA探針雜交的螢光法而完成，某些時候，通過自動讀數和放大目標胎兒基因和DNA的方法完成。參見Lichter等人「Rapid detectionof human chromosome 21 aberration analysis using fluorescence in situhybridization」,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:9664(1988)；O＇kelley等人「Instrumentaion for the genetic evaluation of fetal cells from maternalblood」,Am.J.Hum.Genet.,57:286(1995)及Lo等人「Prenatal SexDetermination,by DNA amplification from maternal peripheral blood」,Lancet,2:1363(1989)。
本發明概述本發明提供了一種血樣中胎兒紅血球細胞，優選成核或有核紅血球細胞的鑑別方法，該方法包括a)將血樣與一種抗體或抗體碎片接觸來指示血紅蛋白中的胚胎球蛋白部分，其中，所述抗體或碎片將與胎兒細胞結合，並且b)將與抗體或碎片結合的細胞鑑別為胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞(血樣一般取自妊娠期母親的末梢循環血液)。
各種抗胚胎血紅蛋白抗體或其抗體碎片可以用於該方法，特別是那些指示血紅蛋白中的胚胎ε球蛋白鏈和/或胚胎ζ球蛋白鏈的抗體或其抗體碎片。此外，第二種胎兒或成熟細胞標記物可以用來進一步鑑別或分離所期望的胎兒細胞。
一旦被選定的胎兒細胞被鑑別出來，一種胎兒的核酸或蛋白質就可以在用於遺傳分析的細胞中被放大或檢測。
本發明還提供了各種與上述方法協同使用的工具包。這些工具包包括一種直接或間接經過標記的抗胚胎血紅細胞抗休及其使用說明。在這些工具包中還任意地包括用於提高胎兒細胞濃度、破壞紅細胞的溶血試劑、消散藥劑和核酸探針的密度梯度介質。具體實施例的詳細描述除非另有定義，這裡所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員所理解的術語相同的含義。雖然任何與這裡描述的方法和材料相近或等同的方法和材料也可以用來完成和試驗本發明，但本發明還是描述了優選的方法和材料。為了達到本發明的目的，定義了下述術語。
這裡所用的「紅血球細胞」或「血紅細胞」或「RBC」包括成人和胎兒的血紅細胞，它可以是成核的或非成核的。成核紅血球細胞是優選的。
這裡所用的「有核紅血球細胞」指一種成核細胞的前身物，從該前身物，一個網狀紅血球細胞發展成為一個紅血球細胞。「正常紅細胞」指一種成核血紅細胞，它是一種血紅細胞的中間前體。
這裡所用的「胚胎」指懷孕經過二個月形成的一個或多個細胞。典型情況下，從胚胎階段到出生前的階段命名為胎兒。
在母親血液中循環的胎兒血細胞是很少的，胎兒細胞被認為是通胎盤「滲透」到母親血液中的。對這種極少情況發生的頻率的估計有所變化，但有報導認為該頻率為億分之一到一千億分之一。參見Holzgreve.W等人，Lancet(1990)i:1220。在懷孕的早期，胎兒血紅細胞可能是成核的，也即，不像非成核胎兒紅血球細胞那樣，他們含有胎兒DNA，並且無需用進入的方法，這些胎兒血紅細胞可以用來進行遺傳分析。血紅蛋白的個體發生近似99％的成人血紅蛋白由兩個α鏈和兩個β鏈組成，而約1％的成人血紅蛋白含有兩個α鏈和兩個δ鏈。胎兒血紅蛋白則含有兩個α鏈和兩個γ鏈。
三個早期的胚胎血紅蛋白由ζ(與α類似)和ε(與β鏈類似)構成。胚胎Gower2由兩個α鏈和兩個ε鏈組成，而胚胎Gower1血紅蛋白由兩個ζ鏈和兩個ε鏈組成，Portland型胚胎血紅蛋白由兩個ζ鏈和兩個γ鏈所組成。參見Gale等人的「Nature」,280:162(1979)和Maniatis等人，Ann.Rev.Genetics,14:145(1980)。
通過本發明可以證明，懷孕最長到約22月經周時，在胎兒的血紅細胞(RBCs)中，雖然信使RNA已不存在，但胚胎球蛋白鏈卻仍然存在。優選情況下，這些鏈在約9-20月經周內可以被檢測出。胎兒最終可以產生胎兒血紅蛋白，在成人血紅蛋白中可以發現近似1％這種胎兒血紅蛋白，而在成人的血紅細胞中沒有胚胎血紅蛋白。紅蛋白抗體血紅細胞中的各種特異血紅蛋白可以用抗體或抗體碎片與球蛋白鏈中抗原相結合的具體位置進行區別。成人球蛋白(α和β)、胎兒球蛋白(γ)和胚胎ε球蛋白抗體可以買到。Accurate Chemical and Scientific公司(Westbury,NY)和Cortex Biochem公司(San Leandro,CA)供應ε球蛋白抗體。
很多免疫原可以用來生產與血紅蛋白鏈蛋白產生特異反應的抗體。再結合蛋白質是優選的用來生產單克隆或多克隆抗體的免疫原，天然純或不純的蛋白質也可以用作免疫原，用血紅蛋白鏈蛋白胺基酸序列製備成的合成肽也可以用來製造蛋白質抗體的免疫原。再結合蛋白質可以用真核或原核生物細胞榨出並可以純化，產物可以注入能產生抗體的動物體中。
製備多克隆抗體的方法為本領域技術人員所熟知，簡單地說，是將一種免疫原，優選一種純化的蛋白質與一種輔藥混合使動物免疫，動物對免疫原製備過程的免疫反應用測試血液和確定反應滴定度來監控，當得到適當高的抗體對免疫原的滴定度時，將動物的血液收集起來，製備出抗血清。必要情況下分餾血清以濃縮對蛋白質有反應性的抗體。參見Harlow等人，Antibodies,A.Laboratory Manual,Cold Spring HarborPublications,New York(1988)。
單克隆抗體可以由本領域技術人員熟知的各種技術獲得。簡單地說，通常將一種所期望的抗原免疫後的動物的脾細胞與一種骨髓瘤細胞融合，使所述脾細胞不朽化。參見Kohler等人，Eur.J.Immunol.,6:511-519(1976)。另外的不朽化方法包括用EB病毒、致癌基因或逆病毒來轉變，或者用現有技術中已知的方法。為生產對抗原有理想特異性和親合力的抗體，由單個不朽化的細胞產生出來的菌落被保護起來。用各種技術，包括注射到脊椎動物寄主的腹膜腔中，可以提高用這種細胞生產的單克隆抗體的產率。根據Huse等人在Science,246:1275-1281(1989)中簡述的總議定書，可以將DNA序列從人類B細胞中分離出來，通過掃描DNA庫，該DNA序列將單克隆抗體或一個相結合的碎片譯成密碼。
各種組分或抗體碎片可以用於本發明。免疫球蛋白的不確定區域是提供抗原分子附著力特性的部分。特別是這種屬於免疫球蛋白的互補的確定性區域，也就是已知的變異性過多的區域。免疫球蛋白可以以各種形式存在，包括，例如Fv、Fab、F(ab＇)、F(ab＇)2，及其它碎片以及單鏈。參見Huston等人Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)及Bird等人，Science 242:423-426(1988)。通常情況下參見Hood等人，Immunology,Benjamin,N.Y.,2nd ed.(1984)及Hunkapiller和Hood,Nature,323:15-16(1986)。也可以用單鏈抗體，在單鏈抗體中，一個重鏈和一個輕鏈的基因結合成一個單個的指定遺傳密碼序列。免疫球蛋白多肽還含有一個被截去末端的免疫球蛋白鏈，如一個含有比天然多肽更小的恆定區域範圍的鏈。這種被截去末端的多肽可以採用標準的方法生產，如在預截去的範圍序列的序列5＇中引入一個中斷密碼子，將被截去末端的多肽結合構成被截去末端的抗體。這裡所用的抗體還包括雙特性抗體，雙特性抗體可以由下面參考文獻中所描述的方法生產Glennie等人J.Immunol.,139:2367-2375(1987)；Segal等人，Biologic Therapyof Cancer Therapy of Cancer Updates,2(4):1-12(1992)及Shalaby等人J.Exp.Med.,175:217-225(1992)。單特性和雙特性免疫球蛋白也可以在真核或原核動物寄主細胞中採用再結合技術來生產。
「嵌合的」抗體被免疫球蛋白基因譯成密碼，該免疫球蛋白基因在遺傳學上已被設計，使輕鏈和重鏈基因由屬於不同物種的免疫球蛋白基因段所組成。例如，從一隻老鼠的單克隆抗體而來的基因的變異(V)片段與人類恆定的(C)片段相結合。這種嵌合的抗體很可能比帶有老鼠恆定區域及變異區域的抗體對人具有更低的抗原性。
如這裡所用的那樣，術語嵌合的抗體還可以指這樣的抗體，該抗體含有一種類似人類構架組織的免疫球蛋白，該免疫球蛋白中任何存在的恆定區域有至少約85-90％，優選約95％的多肽序列與人類免疫球蛋白的恆定區域相同，該免疫球蛋白稱為「人性化的」免疫球蛋白。參見，如PCT公開號WO 90/07861。因此，這種「人性化的」免疫球蛋白的所有部分，除可能的互補性確定的區域(CDRs)外，基本上與一種或多種固有人類免疫球蛋白序列的相應部分相同。必要時，特別是如果某種構架組織殘基可以影響CDRs結構，構架組織殘基可以被物種內或物種間的構架組織殘基所代替。一種嵌合的抗體也可以含有被截去末端的變異或恆定區域。
如這裡所用的那樣，術語「構架組織區域」指在一個單一物種中的不同免疫球蛋白中被相對保全的免疫球蛋白輕和重鏈變異區的那些部分。如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunologic Interest,4th Ed.,US Dept.Health and Human Services(1987)中所定義的那樣。如這裡所用的那樣，一個「類似人類構架組織區域」指在每一個存在的鏈中含有至少約70個或更多的胺基酸殘基，典型情況下含有75-85或更多的殘基，這些胺基酸殘基與在人類免疫球蛋白中的相同。
人類恆定區域DNA序列可以從各種人類細胞中按照已知的方法分離出來，但優選從不朽化的B細胞中分離出來。本發明中用來生產嵌合免疫球蛋白的變異區域或CDRs可以類似地從能與胚胎血紅蛋白或它們的鏈相結合的單克隆抗體中衍生獲得，並將在任何方便的哺乳動物系包括老鼠、兔、人類的細胞系，或其它能產生抗體的脊椎動物中，用已知的方法生產。變異區域或CDRs可以用包括聚合酶鏈反應(PCR)在內的標準再結合法或通過噬菌體顯示資料庫而合成生產。關於噬菌體顯示法，參見McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)；Clackson等人，Nature,352:624-628及Marks等人，Biotechnology,11:1145-1149(1993)。合適的原核生物系如細菌、酵母和噬菌體可以被使用。
合適的DNA序列的源細胞和用來表示和分泌免疫球蛋白的寄主細胞可以從很多來源獲得，如American Type Culture Collection(「Catalogueof Cell Lines and Hybridomas,」Fifth edition(1985)Rockville,Maryland,U.S.A.)。
除在這裡特意描述的嵌合的和「人性化的」免疫球蛋白以外，還可以容易地設計並用本領域普通技術人員熟知的各種DNA重組技術製造基本上相同的改性免疫球蛋白。一般來說，基因的改性可以用各種已知技術完成。如PCR和位置指示誘變。參見Gillman和Smith,Gene,8:81-97(1979)及Roberts等人，Nature,328:731-734(1987)。
另外，只含有一部分初級免疫球蛋白結構的多肽碎片可以被生產出來。例如，生產除具抗體分子附著力(如補償組織固定)以外，還具有一種或多種免疫球蛋白活性的免疫球蛋白多肽碎片是一種理想的情況。標記為了進行分離和鑑別，抗體或碎片可以被直接或間接地標記。合適的標記物包括放射核素、酶、酶作用物、輔助劑、抑制劑、螢光劑、化學發光劑、磁性顆粒、半抗原、染色劑等。參見專利US3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。還可以包括的是已報導的各組，如與如鏈黴定或抗生物素蛋白相結合的組、依次直接或間接與酶相結合的組，如鹼性磷酸酶或過氧化酶辣根。螢光劑或螢色物包括螢光素、香豆素、若丹明、藻紅朊、氯化磺酸若丹明(德克薩斯紅)等。
在本發明所屬領域，這些可檢測出的標記物已得到充分發展，一般情況下，任何一種標記物均可使用，其中，優選使用螢光酶或劑。血樣的抽取本發明提供的方法優選採用來自妊娠期母親的血樣；然而，除在母親的血循環中已被分離或鑑別的外，其他胎兒細胞源也可以採用。為進行分析，可以採用前述的羊膜穿刺術、CVS、胎兒鏡或臍帶穿刺術來獲得胎兒組織。
在上述例子中，其中母親的血液是胎兒細胞源，所述血樣可以是完整的血液，也可以是含有選自一個單核細胞層的胎兒紅血球細胞或有核血球細胞的血的分餾組分。典型情況下，在使用所要求的方法所述的抗胚胎血紅蛋白抗體之前和/或之後，處理血源，提高胎兒細胞的濃度。此外，在與抗體接觸之前，可以將血樣製成懸浮液，通過空氣乾燥或將其化學固定在一種固體基質上。
雖然任何母親或胎兒哺乳動物均可以是胎兒的組織源，但是，優選的胎兒組織源是人。其它家養的哺乳動物也是優選的，如狗、貓、母牛、馬等。富集方法密度梯度除了對血液進行分餾以外，還描述了分離或富集血細胞的方法，該方法使用包括細胞聚集或凝聚試劑，如甲基纖維素、IsopaqueTM、葡聚糖和FicollTM的密度梯度，Boyum,Scaud.J.Clin.Lab.Invest.,21(Supp1.97):31-50(1968)和Bhat,N.M.J.Immunol.Meth,158:277-280(1993)對此進行了描述。IsopaqueTM，如Boyum描述的那樣，是一種N-甲基-3,5-二乙醯胺基-2,4,6-三碘代苯甲酸鈉。FicollTM(由AccurateClemical and Scientific Corporation,Westbury NY出品)是一種合成的高聚物。該高聚物是由蔗糖和表氯醇共聚而製備的。這些分子具有羥基含量很高的支鏈，使其在水介質中可溶。這些試劑中許多是可以自由擴散的。這些試劑可以引起紅血球細胞凝集，據此可以給出從紅細胞中分離出白血球細胞的方法。然而，在這種細胞聚集的條件下，胎兒成核血紅細胞可以在一個母親血紅細胞聚集成的凝塊中被捕集，因此，當以這種凝塊的平均密度來確定它的沉澱特性時，胎兒血紅細胞將與母親的紅血球細胞一同沉澱。
Rennie等人，Clinica Chemica Acta,98:119-125(1979)和Vincent及Nadeau,Anal.Biochem.,141:322-328(1984)描述了叩診密度梯度。在Rennie的研究中，一種等張叩診密度梯度用來老化一分餾紅血球細胞，因在等張梯度條件下，白血球細胞與紅血球細胞共分餾。因此在離心沉澱前白血球細胞包被移出。
Ganshert-Ahlert等人，Am.J.Obstet.Gynecol.,1350-1355(1992)和PCT公開號WO 93/23754描述了一種富集胎兒成核紅血球細胞的方法，該方法在整體母親血液中採用了三級密度梯度，然後用鐵蛋白受體富集胎兒成核血紅細胞，一種流動血細胞計數法或磁性分離步驟被用於富集被標記的細胞。正如Ganshert-Ahlert參考文獻中所記載的那樣，鐵蛋白受體的作用仍然不能在母親循環血細胞群中準確地鑑別出胎兒細胞。
一種優選的從一種母親細胞群中分離胎兒成核血紅細胞的富集方法包括如下步驟在第一步離心沉澱容器中離心沉澱血樣，得到一種血紅細胞組分；將該血紅細胞組分轉移到第二步離心沉澱容器的上部，在第二步離心沉澱容器中有一種密度梯度介質，該密度梯度介質由一種分散在混合凝膠中的膠質所組成。其中，所述膠質能使血紅細胞基本上保持在非聚集狀態；將血紅細胞組分中的母親的紅血球細胞溶血，得到富集胎兒紅血球細胞組分；軟化所述凝膠；並且，通過所述密度梯度介質離心沉澱所述富集胎兒紅血球組分，得到富集胎兒成核紅血球細胞的組分。參見US5,432,054。
第一步離心沉澱提供一種初步富集。這種初步富集將低密度的成核血紅細胞餾分和血白細胞與更重的非成核血紅細胞、血清和血清蛋白分離開來。優選情況下，第一步離心沉澱管由軟塑料製成。以便於血細胞在管中的移動。合適的離心沉澱管在US5,422,018中進行了描述。優選情況下，將塑料沙漏形狀的離心沉澱管支撐於離心沉澱器中，以防止過度變形或在狹窄中心通道部分的管的破裂。可以用各種合適的方法支撐。例如，可以將一種固體的不可移動的支撐管狀物包在管的周圍。在一個優選的實施方案中，在一個較大的容器如一個試管中。用一種液體支撐介質支撐管，液面至少覆蓋管的狹窄部分，優選情況下，被樣品管置換的液體支撐介質的體積的重量近似等同於樣品管體積及其內含物的重量。優選的液體支撐介質為水。
經過第一步離心沉澱步驟後，得到了一種成核血紅細胞的組分。這個組分也含有血白細胞。管的頂部含有血聚組分。比血漿較重而較其它血紅細胞較輕的成核紅血球細胞分布在血紅細胞堆的頂部，該血紅細胞堆就位於血漿之下，並可變地與白血細胞混合在一起。在第一步離心沉澱中，用一種經過預先校準的離心沉澱管可以從第一個管的狹窄部分容易地分離出相關組分。也就是，使其它血液組分，如血清和血漿的含量在第一步離心過程中降至最低。
含血紅細胞和白細胞的組分通過溶血可以不均勻地將母親的血紅細胞破壞。母親血紅細胞的不均勻溶血作用使保留下來的相當大量的母親的血紅細胞遭到破壞，而同時保護了大部分胎兒產生的細胞。參見Boyer等人Blood,47(6):883-897(1976)。所述不均勻溶血作用可以在任何合適的反應容器中進行。在一個優選實施方案中，母親的血紅細胞的不均勻溶血作用在第二步離心沉澱容器的上部進行，這樣可以通過離心沉澱反應產物，即保留下來的血紅細胞，使之進入密度梯度介質，也就是將血紅細胞從溶血試劑中移出，來終止溶血反應。
不均勻溶血作用應用了這樣一個事實，即在含有溶血試劑，如銨離子(NH4+)和碳酸氫根離子(HCO3-)的溶液中，血紅細胞可以被破壞。細胞的破壞可以被碳無水化酶抑制劑所減速。成人紅血球細胞中碳無水化酶的含量至少是胎兒紅血球細胞中的5倍。因此，與成人血紅細胞相比，NH4-HCO3調節胎兒血紅細胞，包括胎兒成核血紅細胞的溶血作用速度較慢，特別是碳無水化酶抑制劑存在的情況下。本發明所用的優選的碳無水化酶抑制劑包括乙醯唑磺胺、乙氧基唑磺胺(6-乙氧基唑磺胺，Sigma Chemical Co.)和甲氧基唑磺胺。
不均勻溶血作用導致了胎兒血紅細胞中大量白細胞與血紅細胞一起富集。然後富集胎兒血紅細胞的組分通過密度梯度介質被離心沉澱以獲得富集了胎兒成核血紅細胞的組分，並移去由於溶血反應導致的血紅細胞碎片及大部分白細胞。存在於20毫升末梢循環血最初樣品中的胎兒血紅細胞可能減少到2毫升樣品，這樣就可以很容易地在顯微鏡載玻片上或通過聚合酶鏈反應進行鑑別和分析。
第二步離心沉澱使用了一種密度梯度介質。溶血作用之後，期望密度梯度介質中成核血紅細胞與粒性白細胞、白細胞組分中的一種成分以相同的密度達到平衡，如在PCT國際公開號WO 93/23754中所描述的那樣。梯度介質的張力和密度可以使胎兒成核紅血球細胞從血樣的白細胞組分中分離和富集出來。
優選的密度梯度介質含有分散在一種混合凝膠中的一種膠質。參見US5,489,386。該膠質給予梯度介質所要求的密度。也即，通過改變膠質的濃度可以相應地改變介質的密度。在凝膠狀態下，膠質固有的性質能固定各密度分離層，而不會在凝膠狀態下從一層向另一層的擴散。此外，膠質可以使血細胞保持非聚集狀態。一種優選的給予介質密度的膠質為聚乙烯-丙酮酸塗層的氧化矽，如Pharmacia生產，Sigma ChemicalCo.出售的PercollTM。
用於富集胎兒成核紅血球細胞的密度梯度介質是高張力的。在高張力條件下，血紅細胞收縮並變得更重，在這些條件下，白細胞保持恆定的密度。因此，通過在一種高張力介質中選擇性地收縮紅血球細胞，這些細胞的密度增大並且以和白細胞不同的密度在梯度中達到平衡。富集方法--流動血細胞計數法及其它富集血樣可用其它技術來完成，如細胞選淘、用光學顯微鏡進行微觀剖析、流動血細胞計數法和/或磁珠或磁性顆粒分離。例如，對母親或成熟細胞標記物有特異性的抗體和/或對第二種胎兒標記物有特效的抗體可以加入到本發明提供的方法中以進一步富集胎兒細胞。陽性或陰性選擇法均可以被採用，也就是說，可以增加所期望的胎兒細胞或削減不需要的成熟細胞。一種與抗體相結合的塔可以單獨使用或與其它富集技術聯合使用。
Mueller等人在Lancet,336:197(1990)中描述了一種用磁珠在孕婦的血中分離胎盤產生的磁養層的方法。也存在將抗體和磁珠配合使用的方法的動向，參見Thomas等人J.Immunol.,120:221(1989)和Deretser等人Tissue Antigens,16:317(1980)。在Berenson等人J.Immunol.Methods,91:11(1986)中討論了一種另外的富集方法，其中利用了抗生物素蛋白與維生素H之間的親合力，創造了一種非直接的免疫吸附方法。
在流動血細胞計數法中，根據細胞的性質，對細胞進行分析和分類在一種分類器上進行，不同性質的細胞光線向前或向側邊分散。每次實驗中都考慮到向前或向側邊分散的性質，各種參數完全憑經驗建立。一般情況下，用來檢測向前分散光和向側邊分散光的成相放大器管上的腰槽都要在不同方向上進行調節以分布來自穿過用來作分析的線路的細胞的信號排列，調節的方法是本領域技術人員熟知的。在這種環境下，可以觀測到一種特徵的圖案或分散圖。對血樣的表明在散射圖中有三種主要的細胞型，即單核白血球、淋巴細胞和粒性白細胞，它們中的每一種都有可區別的光散射特性。控制散射圖中單核白血球細胞區域、粒性白細胞區域和淋巴細胞區域，使被分類成單核白血球、粒性白細胞或淋巴細胞的細胞能進一步被分析或用流動分類法收集。
通過將細胞用螢光-偶合的單克隆抗體染色或者用螢光偶合的低聚核苷酸或核酸探針與細胞進行雜交，可以進行進一步的分析。在這種條件下，因螢光的存在，具有特定光散射性質的細胞也可以被分析出來。當採用螢光偶合的抗體時，用同型匹配的控制單克隆抗體來完成控制實驗。當採用螢光偶合的低聚核苷酸探針時，控制由與哺乳動物序列不相關的低聚核苷酸序列組成。
將收集到的樣品放到一個或多個載玻片上，在一個載玻片上放置不能超過2-3,000,000個細胞，注意使放置上去的細胞形成一個單層，使在載玻片上的細胞濃度足夠低，以致細胞不與另一個細胞重疊。在另外的時候，將細胞收集到微觀驅除管中並固定在懸浮液中，如在另外的地方所描述的那樣。
一種Coulter,ProfileⅡ型流動計數器(Coulter,Haileah,FL)可以用於檢測胎兒細胞中的核酸。一種Epics Elite(Coulter Haileah,FL)系統可以用來從母親血樣中分類出胎兒細胞。
優選情況下，用一種螢光活化的細胞分類器來完成流動血細胞計數，並且鑑別胎兒細胞。在這種方法中，採用螢光素作為標記物或染料，該標記物或染料直接或間接地與抗體相結合。其它標記物第二種胎兒標記物可以用來確定細胞為胎兒細胞。例如，可以採用代表胎兒細胞標記物的抗體。對於胎兒血紅細胞來說，一種胎兒血紅蛋白標記物，如一種胎兒血紅蛋白γ鏈的抗體是優選的。
胎兒細胞特異RNA序列也可用作胎兒細胞標記物，這種序列如可以是胎兒血紅蛋白基因的轉錄產物，這些基因和其它基因序列可以從基因序列資料庫、基因庫69.0版中得到。作為一種寡聚脫氧核苷酸，含有任何這些序列的一個DNA探針或多個探針可以採用一種商購的DNA合成器，如Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA公司的380B型DNA合成器來合成。這些探針可以含有天然核苷酸鹼基或已知的天然核苷酸鹼基的類似物，包括那些經改性成為結合標記的部分。
對於陰性選擇法，可以採用一種成熟細胞的標記物，如一種抗anti-CD45、anti-CD13和/或anti-CD34的抗體，這些抗體選擇性地與白細胞結合。也可以包括anti-CD44抗體以去除對母親血紅細胞的汙染。加入anti-CD31抗體可以特定地去除對血小板的汙染。優選情況下，採用指示成人血紅蛋白β鏈的抗體。胎兒核酸和蛋白質一旦從母親的血液中分離出來胎兒細胞，這些細胞可以被培養，以增加用於診斷的細胞的數量。參見Fibach等人，Blood,73:100(1989)。
特別是可以按下述方法選擇或分離出特定的胎兒蛋白質和/或核酸。將細胞溶解，從而使核酸或蛋白質能用於分析。在一些例子中，如可以採用加熱的方法將胎兒DNA從其它的複合體中分離出來，使它能與核酸探針雜交。在分析之前，可以採用如聚合酶鏈反應(PCR)或連拉酶鏈反應(LCR)的方法將胎兒DNA放大。
如果要進行放大，被分類的樣品以合適的變性和退火循環周期的數量(如近似25-60)被放大。控制取樣可以包括一個不加DNA的管以監控假陽性放大。對PCR條件進行適當地改變後可以同時放大多於一個的獨立的胎兒基因。以「多元」放大為人所知的這種技術已經以6套引物用於DMD的診斷中。參見Chamberlin等人，Prenat.Diagn.9:349-355(1989)。當進行放大時，得到的放大產物是一種混合物，該混合物含有我們所關心的被放大的胎兒DNA，也就是其出現將被檢測和/或定量的DNA。
用已知的技術可以將放大的胎兒DNA和其它DNA序列分離。隨後的對放大的DNA的分析也可以用已知的技術進行，如與限定的內核酸酶一起浸煮，用3,8-二胺-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溴化物染色的瓊脂糖凝膠的紫外光檢測，DNA排序或與特異的寡聚核苷酸探針等位基因雜交。參見Saiki等人，Am.J.Hum.Genet.,43(Suppl.):A35(1988)。這種分析將確定被放大的「母親」和「胎兒」樣品之間是否存在多形態區別。以大小為基準可以將放大混合物分離，並且，將得到以大小分離出來的胎兒DNA與一種或多種合適的選定的DNA探針接觸(這種選定的DNA與我們關心的胎兒DNA充分互補，以致在所用的條件下，與我們關心的胎兒DNA雜交)。一般情況下，DNA探針用如上所述的標記物進行標記。
以大小分離出來的胎兒DNA和選定的DNA探針在合適的條件下保持足夠的時間之後，用已知的方法檢測得到的複合物，所述合適的條件使互補DNA序列的雜交發生，生成胎兒DNA/DNA探針複合物。例如，如果探針是經過標記的，則胎兒DNA/標記過的DNA探針複合物就被檢測出來和/或被定量測出(例如用自動放射照相術，螢光標記物的檢測)。通過與一種標準曲線(即一種預先測定的檢測到的標記的量與給定讀數之間的關係)進行比較，標記的複合物(也即胎兒DNA)的量就可以被測定出來。基因畸形的測定與疾病或條件相關的胎兒DNA的出現可以用現有方法測定和/或定量出來。在每一種情況下，一種合適的探針可用於測定所關心的序列。例如，從St14(Oberle等人，New.Engl.J.Med.,312:682-686(1985))探針、49a(Geurin等人，Nucleic Acids Res.16:7759(1988))探針、KM-19(Gasparini等人，Prenat.Diagnosis,9:349-355(1989))探針而來的序列或來自杜興肌肉營養不良(DMD)基因的缺失俯伏外顯子序列(Chamberlain等人，Nucleic Acids Res.,16:11141-11156(1988))可用作探針。St14是一種從X染色體的長臂上分離出來的高度多形態序列，所述X染色體在從母親的DNA中區分出雌性DNA中有潛在的用途。St14在染色體圖譜中位於第八因子Ⅷ:C附近，也可用於產前血友病A的診斷。與DMD基因中6個最常缺失的外顯子側面相接的序列相應引物也可以使用，這些引物已經成功地用於通過PCR對DMD的診斷。參見Chamberlain等人，Nucleic Acids Res.,16:11141-11156(1988)。能被本發明診斷的其它疾病包括Down氏麻痺性眩暈綜合症、β-地中海貧血症(Cai等人，Blood,73:372-374(1989)；Cai等人，Am.J.Hum.Genet.,45:112-114(1989)；Saiki等人，New Engl.J.Med.,319:537-541(1988))、鐮刀細胞貧血症(Saiki等人，New.Engl.J.Med.,319:537-541(1988))、苯基酮尿症(Dilella等人，Lancet,1:497-499(1988))和Gaucher氏疾病(Theophilus等人，Am.J.Hum.Genet.,45:212-215(1989))。
用本發明方法檢測出來的基因畸形可以是缺少、增加、放大、換位或重排。
例如，通過檢測不存在探針與目標序列的雜交結合可以鑑定出缺少。為檢測基因序列的缺少，一組探針被製備出來，這些探針與核酸序列是互補的，這種序列存在於正常胎兒細胞中而不存在於異常的胎兒細胞中。如果探針與該序列的雜交被檢測出，則該序列被檢測出，就該序列來說，這個細胞是正常的。如果探針不能同細胞的核酸雜交，則該序列在那個細胞中沒有被檢測出，那麼那個細胞就被標記為不正常的，假設一種控制序列，如X染色體，在相同的細胞中被檢測出的話。
一種增加可以用檢測一種被標記的探針與一種染色體上多核苷酸重複片段的結合而被鑑定出來。為了檢測出基因序列的增加，如一種染色體或染色體組畸形(如表示Down氏麻痺性眩暈綜合症的21號三倍染色體)的嵌入一組探針被製備出來，這些探針與有問題的基因序列是互補的。繼續以Down氏麻痺性眩暈綜合症舉例，如果這些與21號染色體互補的探針與細胞中具有三種外觀的21號染色體序列雜交，21號染色體的三種表現形式就被檢測出來，並且表明了Down氏麻痺性率暈綜合症的三倍染色體疾病的存在。如果檢測方法是螢光染色，例如每個細胞中的三個可見的獨特的螢光點表明了三倍染色體疾病。
如果存在特異DNA碎片的放大，被放大的序列的標記過的探針信號強度會增強。用任何數量的影像分析系統，將這種信號用數量表示並與正常控制相比較就可以確定是否存在特定的放大異變。
用幾種不同的方法可以鑑定出換位或重排。例如，可以將第一種標記過的探針與沒有發生換位的染色體中的標記區域相結合，然後將第二種探針與同一染色體(對於重排)或第二染色體(對於換位)的第二個區域相結合，接著檢測第一和第二探針的結合。另外，通常在分裂中期，通過第一次將標記過的探針與發生換位或重排的染色體的多核苷酸區的標記區域相結合可以鑑定出換位。接著，標記過的探針的結合被檢測。
例如，為檢測換位，鑑別出有問題的染色體一個標記物，並且製備出一組選擇性地與該標記物雜交的探針，他們用一種可檢測出的標記物來標記，可檢測出的標記物如可以是有特定波長螢光的染料。被檢測的畸形中的換位或重排的序列也被鑑別出來，並且，第二組探針被製備出來以鑑別它。第二組探針中成員用一種可區別的不同的標記物標記，如一種與第一組具有不同波長螢光的染料。用兩組探針進行原位雜交，並且，比較用每一組探針的雜交結果。如果在所有樣上第一種和第二種標記是重合的，沒有換位發生。如果在樣品的相當一部分上沒有發現第一種標記與第二種標記重合，那麼發生了換位或重排。參見Spleman,Clinical Genetics,41(4):169-174(1992)和Gray,Progress in Clinical andBiol Res,372:399-411(1991)。核酸雜交「核酸」這個術語，如這裡所用的那樣，指DNA或RNA。「核酸序列」或「多核苷酸序列」指從5＇端到3＇端的脫氧核糖核酸或核糖核酸鹼基的單鏈或雙鏈多聚體，它既包括半複製的質粒、有感染性的DNA或RNA多聚體也包括非功能性的DNA或RNA。
「核酸探針」可以是DNA或RNA碎片，例如DNA碎片可以通過溶解質粒DNA或用PCR製備，或者用Beaucage和Carruthers,Tetrahedron Lett.,22:1859-1862(1981)描述的磷酸氨基方法合成，或者按照Matteucci等人，J.Am.Chem.Soc.,103:3185(1981)所述三脂法合成。如果希望的話，一個雙鏈DNA碎片可以將化學合成的單鏈在合適的條件下一起退火或者通過合成互補鏈而獲得，該互補鏈用DNA聚合酶和合適的引物序列合成。一旦給出了一個核酸探針的特定序列的位置，互補鏈也被鑑別和包括是可以理解的。在目標是一個雙鏈核酸的位置，互補鏈將起同樣好的作用。
術語「選擇性雜交」指當目標序列存在於全部細胞DNA或RNA製品中時，一個核酸探針只與一個特定的目標DNA或RNA序列雜交、複合或結合。「互補」或「目標」核酸序列指的是選擇性地與一個核酸探針雜交的那些核酸序列。例如，退火條件依一個探針的長度、鹼基組成和不匹配的數量及它們在探針中的位置而定，並且，經常必須根據經驗來確定。對核酸探針的設計和退火條件的討論參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2nd ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology,ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)。
用作探針的核酸按照磷酸胺基三脂法用化學法合成，該方法由Beaucage和Carruthers在Tetrahedron Lett.,22(20):1859-1862(1981)中首次做了描述，該方法採用了一種自動合成器，正如Needham-VanDevanter等人在Nucleic Acids Res.,12:6159-6168(1984)中所描述的那樣。寡聚核苷酸的純化採用丙烯醯胺凝膠電泳法或陰離子交換HPLC法，該方法在Pearson和Regnier,J.Chrom.,255:137-149(1983)中做了描述。合成的寡聚核苷酸序列的檢驗用化學降解法，該方法在Maxam和Gilbert在Grossman and Moldave,eds.Academic Press,New York,Methods inEnzymology,65:499-560(1980)中做了說明。
採用核酸雜交技術測定特異DNA和RNA的各種方法為本領域技術人員所知。例如，測定樣品中是否存在DNA的一種方法包括一個南極轉錄。簡單地說，溶解的基因組的DNA融化在緩衝劑中的瓊脂糖序凝膠上並轉錄到膜上，用核酸探針進行雜交。優選的核酸探針為有20個鹼基或長度更長(參見Sambrook等人，for methods of selecting nucleicacid probe sequences for use in nucleic acid hybridization)。目測雜交的部分可以給出是否存在DNA的定性測定結果。
相似地，在檢測mRNA時可以用北極轉錄。簡而言之，用酸性鈲鹽-苯酚-氯仿萃取法可以從一個給定的樣品中分離出mRNA，然後將mRNA電泳以分離出各種mRNA，並且將mRNA從凝膠轉錄到一個硝化纖維薄膜上。正像南極轉錄那樣，用標記過的探針鑑別是否存在合適的mRNA。
各種核酸雜交的形式為本領域技術人員所知。例如，常用的形式包括夾心測定和競爭或置換測定。一般情況下，各種雜交技術在「NucleicAcid Hybridization,A Practical Approach,」Ed.Hames,and Higgins,IRLPress,1985；Gall和Pardue,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,63:378-383(1969)和John.Burnsteil及Jones,Nature,223:582-587(1969)中進行了描述。
在用於原位雜交的細胞的製備過程中，乙醇，如80％乙醇/水(體積/體積)是一種理想的固定劑。其它沉澱固定劑包括乙酸、甲醇、丙酮及其混合物，如乙醇/甲醇為3∶1的混合物。其它有用的固定劑為本領域的技術人員所熟知。大體上，各種固定劑及固定後細脆的雜交在US5,225,326中進行了討論。固定劑應該提供好的對細胞形態保護，應該保護和保持抗原的易接近性，應該促進高的雜交的效率。一些鹽類和極端的溫度，如在火焰上揮動，也可以起到固定劑的作用。
固定劑可以含有一種化合物，該化合物通過將細胞組分交聯在一起而固定細胞組分，例如，多聚甲醛、戊二醛或甲醛。當交聯劑保護亞顯微結構時，常常通過形成捕集核酸和抗原的網絡而降低雜交的效率，使得它們不能與探針和抗體接近。一些交聯劑還常常共價地改性核酸，阻止後面的雜合體生成。
典型的雜交溶液含有離液序列高的變性試劑，這些試劑包括甲醯胺、尿素、氰硫基胍、三氯乙酸鹽、四甲基胺、高氯酸鹽和碘化鈉。可以用pH值至少約6.0-8.0，優選7.0-8.0的任何緩衝溶液。互不相關的主題的處理各種固體載體可以用來實現本發明。載體包括玻璃、尼龍、硝化纖維等。最為優選情況下採用玻璃或塑料顯微鏡載玻片。載體的使用和將樣品放置在載體上的方法為本領域技術人員所知。載體材料的選擇根據所用的細胞目測方法和定量方法而定。
此外，核染色劑可以用來確認染色質、核蛋白、核組分、DNA等。這些染色劑包括亞甲基藍、蘇木精、DAP-1、Propidinium iodide、硫堇等。
本發明還包含了各種染色體的染色技術。染色體的染色大體上在專利US5,447,841中做了描述。典型情況下，被標記的核酸碎片或探針的不均勻性混合物不在重複序列中，整個基因組、單一染色體、染色體的亞區等均可以被染色，染色的時間為細胞分裂中期。工具包在實現本發明方法時，在母親的血樣中分離和鑑別我們關心的胎兒DNA，如與一種或另外一種疾病相關的染色體畸形時，就產生了一套工具包。例如，選自所需的盛反應物的容器，反應物和任一用於從其它樣品組分中分離出胎兒成核細胞/特異抗體複合物的固體載體或與一種特異抗體複合的母親細胞的移除所用的固體載體。
優選情況下，本發明提供的是含有被標記的抗胚胎血紅蛋白抗體的胎兒成核紅血球細胞或有核紅細胞的鑑別所用的工具包，其中的標記物是螢光染色劑、酶或維生素H。此外，所述抗胚胎血紅蛋白抗體與一種半抗原偶合，並且，指示該半抗原或血紅蛋白抗體的被標記的第二種抗體用來捕獲。工具包中的其它成分可以進一步地是這樣的組分，例如，血液分餾管、溶血試劑、密度梯度介質、消散劑、被標記的核酸探針及使用說明等。
例如，用於採用PCR放大胎兒DNA後的用來檢測所關心的胎兒DNA的試劑可以包括1)對胚胎血紅蛋白或鏈有特異性的至少一種抗體、用PCR放大胎兒DNA所用的選定的DNA引物、與被檢測的胎兒DNA互補的至少一種DNA探針。正如所指出的那樣，工具包還可以包括一種固體載體，該載體用於從其它的樣品組分中分離出形成的複合物。這種固體載體可以是，例如，一種玻璃載玻片、硝化纖維過濾器或免疫磁珠，這種載體上可以具有一種用來選擇存在於胎兒成核紅血球/特異抗體複合物中的抗體的抗體附著物。其它工具包還包括一種含一種固定/雜交混合物和一種或多種被標記的探針的溶液。工具包還提供了完成雜交反應的方法和說明。工具包還包括用於記錄本發明的測定結果的攝影膠捲或感光乳劑。
另一方面，本發明還包括一種用來富集和檢測血樣，如母親或臍帶血液中的胎兒細胞的工具包。這種工具包可以包括一種或多種用來製備一種密度梯度的試劑，這種密度梯度用來富集胎兒細胞。工具包中還可以包括用來檢測胎兒細胞的經過標記的抗體和/或對胎兒細胞的mRNA和/或DNA有特異性的探針、以及用來完成胎兒細胞富集的方法和說明。
另一種工具包可以包括一種或多種抗體，理想地與一種固體載體結合，在樣品中陽性或陰性地富集胎兒細胞，對染色體特定的DNA序列有特異性的探針，採用密度梯度離心沉澱法或流動血細胞計數法完成胎兒細胞富集的方法和說明以及任選的一種或多種富集胎兒細胞用的密度梯度的製備所用的試劑。
這種工具包任選地提供了完成本發明的任何方法所用的自動系統中的各種試劑和材料。
實施例下面的實施例僅僅是為了解釋本發明，而不能解釋成以任何形式來限制本發明的範圍。本領域的技術人員會承認，在本發明的範圍內可以進行一定的變化或改變。
分別用14周懷孕後流產胎兒的臍帶血、母親的全血(流產後)和上述臍帶血與母親血樣的比例為1∶25的混合物製備楔形塗片。在室溫下將塗片風乾約半小時，在-20℃的100％甲醇中固定10分鐘，然後在-20℃的100％丙酮中固定10分鐘。
在緩合振動下，於室溫下將塗片在PBS(pH值為7.4的10mM鹼金屬磷酸鹽緩衝液)中洗滌5分鐘，並在緩合振動下和室溫下用2％甲醛/PBS固定10分鐘。將載玻片在緩合振動和室溫溫度下在PBS中洗滌兩次每次5分鐘後，在緩合振動和室溫溫度下再在TBS(pH為7.6的100mM三鹽酸)中洗滌5分鐘共洗滌兩次。
用封閉劑處理標本，處理的方法是在每一面均要染色的24×60的載玻片上沉積上200微米的TNBB(0.5％封閉劑(Boehringer Mannheim)和在100mM TBS中的1％BSA)。然後將塗片的樣品面向下放置在TNBB點上。將蓋玻片向下放置在一個塑料載玻片儲藏箱中，然後將儲藏箱放在一個裝有潮溼紙巾的敞開的潮溼的箱中，最後，將潮溼的箱放入一個乾燥器中，在室溫下對整個裝置抽真空(DD20型精密真空泵)15分鐘。將載玻片從乾燥器中移出並染色。
小心地移開蓋玻片，在每個面上加入100微升混合物，該混合物含有在TNBB/0.75％的吐溫20中的老鼠的抗-HbE的1∶250稀釋液(胚胎ε血紅蛋白)(單克隆的)和野兔抗HbF(胎兒γ球蛋白)(多克隆的)生物素化鈉抗體的1∶10稀釋液。塗片用一個新蓋玻片蓋上，然後如上所述將載玻片向下置於一個真空乾燥器中的潮溼敞開箱中的塑料載玻片儲藏箱中培育15分鐘。
小心地移開蓋玻片，在緩合振動和室溫溫度下在TBS中洗滌載玻片10分鐘，然後再洗滌兩次每次5分鐘。在每個面上加入100微升第二種混合物，第二種混合物含有在TNBB/0.75％吐溫20中的與FITC偶合的山羊抗鼠抗體的1∶100稀釋液和與德克薩斯紅偶合的馬的抗野鼠抗體的1∶100稀釋液。採用如上的方法在真空中進行培育。
小心地移開蓋玻片，然後在緩和振動和室溫溫度下在TBS中洗滌載玻片10分鐘，然後再洗滌兩次每次5分鐘。將載玻片風乾放置在Vectrashield/DAPI中。結果上述系統用綠FITC螢光將胚胎血紅蛋白(hBE,ε血紅蛋白)染色，用德克薩斯紅螢光將胎兒血紅蛋白(HbF,γ血紅蛋白)染色。此外，用DAPI對比染色將成核細胞的細胞核染成藍色。
抗HbE抗體(胚胎血紅蛋白)很特異。FITC螢光(胚胎血紅蛋白)只在從臍帶和臍帶與母親混合的塗片的血紅細胞中被觀測到。成核的和成熟的HbE陽性血紅細胞均被觀測到。在任一種塗片上均沒有發現FITC染色的白細胞。
德克薩斯紅螢光(γ血紅蛋白)在所有三種塗片類型中即臍帶、母親和混合的塗片上的成熟血紅細胞中都被觀測到。德克薩斯紅螢光在臍帶和臍帶-母親混合物塗片的成核血紅細胞中也被觀測到。染上色的或別的方式的成核血紅細胞沒有在母親血塗片中發現。在臍帶血和母親血塗片中的一些粒性白細胞的細胞質中已觀測到了德克薩斯紅螢光。尚不清楚粒性白細胞中的這種紅色螢光是代表被粒性白細胞吸收的血紅蛋白，還是抗體的多克隆orgins引起的外來物質。
臍帶血和混合血塗片還含有成核的和成熟的血紅細胞，這些血紅細胞中的γ和胚胎血紅蛋白都被陽性地染色。
這裡所有與本發明內容相同的公開文獻÷授權專利和專利申請併入本發明申請供參考，每一個特別和單獨指出的獨立的公開文獻或專利申請也併入本發明申請供參考。
上述對本發明優選實施方案的描述用來說明和描述本發明，並不意味著是本發明的全部或用來精確地限制本發明及公開的形式。並且，在上述描述的指示下，很多改變和變化是可能的，這些改變和變化均應屬於本發明的範圍。
雖然前面的說明和實施例對本發明做了較詳細的描述，然而很明顯，為了更清楚地理解本發明，在權利要求的範圍內，可有一定的變化和改變。
權利要求
1．一種在血樣中鑑別胎兒紅血球細胞或有核紅血球細胞的方法，該方法包括a)將該血樣與一種指示血紅蛋白中胚胎球蛋白部分的一種抗體或其抗體碎片接觸，其中，抗體或碎片將與胎兒細胞結合；和b)鑑別與抗體或碎片結合的細胞為胎兒紅血球細胞或有核紅血球細胞。
2．根據權利要求1的方法，其中的血樣為人類母親的血液，並且，其中的胎兒紅血球細胞是一種成核紅血球細胞。
3．根據權利要求1的方法，其中的抗體指示血紅蛋白的胚胎ε球蛋白鏈或胚胎ζ球蛋白鏈。
4．根據權利要求1的方法，其中的抗體為多克隆抗體。
5．根據權利要求1的方法，其中的抗體為單克隆抗體。
6．根據權利要求1的方法，其中的抗體被直接或間接地標記。
7．根據權利要求1的方法，該方法還進一步包括將血樣與第二種胎兒標記物接觸。
8．根據權利要求7的方法，其中的第二種胎兒標記物是指示血紅蛋白的胎兒γ球蛋白鏈的一種抗體或其抗體碎片。
9．根據權利要求1的方法，該方法進一步包括將血樣與成熟細胞的標記物接觸。
10．根據權利要求9的方法，其中的成熟細胞標記物是指示血紅蛋白的成人β球蛋白鏈的抗體或其抗體碎片。
11．根據權利要求1的方法，其中的血細胞是在懸浮液中。
12．根據權利要求1的方法，其中在與抗體或碎片接觸之前或之後，血樣是經過空氣乾燥的或者是被化學固定在固體基質上的。
13．根據權利要求1的方法，該方法進一步包括為鑑別胎兒細胞，在與抗體或碎片接觸之前，將血樣中的胎兒細胞的濃度進行濃縮。
14．根據權利要求13的方法，其中，通過流動血細胞計數法、血液分餾法、密度梯度分離法或磁珠分離法來富集胎兒細胞。
15．根據權利要求1的方法，該方法進一步包括選擇或分離胎兒細胞所含的核酸或蛋白質。
16．根據權利要求15的方法，其中的核酸或蛋白質被放大或檢測。
17．一種鑑別胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞的工具包，包括a)標記過的抗胚胎血紅蛋白抗體，和b)使用說明。
18．根據權利要求17的工具包，其中的抗體用螢光染色劑或酶標記。
19．一種鑑別胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞的工具包，包括a)用半抗原標記的抗胚胎血紅蛋白抗體；b)指示所述半抗原或抗胚胎血紅蛋白抗體的被標記過的第二種抗體；和c)使用說明。
20．一種用於鑑別胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞的工具包，包括a)與維生素H偶合的抗胚胎血紅蛋白抗體；b)經標記過的抗生物素蛋白或鏈球抗生物素蛋白分子；和c)使用說明。
21．根據權利要求20的工具包，該工具包進一步包括d)血液分餾管；e)溶血試劑；和f)密度梯度介質。
22．一種用於選擇或分離胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞中的核酸序列的工具包，該工具包包括a)經標記過的抗胚胎血紅蛋白抗體；b)密度梯度介質；c)消散胎兒細胞的試劑；d)一種對被選擇或被分離的核酸序列有特異性的經過標記的核酸探針；和e)使用說明。
23．根據權利要求22的工具包，其中經過標記的核酸探針是DNA或RNA探針。
全文摘要
本發明描述了一種在活體外從血樣中鑑別或分離胎兒細胞的方法。用一種胚胎血紅蛋白或胚胎血紅蛋白鏈的特異抗體或抗體碎片鑑別出了胎兒成核紅血球細胞或有核紅血球細胞。一旦鑑別出胎兒細胞,就可以對他們進行處理使胎兒核酸或蛋白質能被鑑別和放大。通過檢測所選定的胎兒核酸或蛋白質出現或存在而獲得了一種定性或定量的診斷或產前估計,包括確定胎兒的性別、染色體、單個基因或蛋白質畸形和確定特定基因、核酸序列或蛋白質的存在與否。
文檔編號G01N33/551GK1234117SQ97199005
公開日1999年11月3日 申請日期1997年10月20日 優先權日1996年10月21日
發明者米切爾·戈爾巴斯 申請人:應用成像公司