交聯的聚-e-賴氨酸非顆粒狀支持物的製作方法

2023-05-22 17:22:31 2

交聯的聚-e-賴氨酸非顆粒狀支持物的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種非顆粒狀交聯的聚-ε-賴氨酸聚合物。聚-ε-賴氨酸和交聯劑通過醯胺鍵連接並且交聯劑可具有能夠與聚-ε-賴氨酸的α碳胺反應的至少兩個官能團。聚合物合適地在水和其他溶劑中是可溶的，並且是以宏觀形式例如片、物品或纖維而提供。所述宏觀形式的聚合物可用於廣泛的應用，包括傷口處理，用作醫學診斷劑包括顆粒狀支持物和被支持物結合或保留的功能性材料，以及肽、寡核苷酸、寡糖的合成，物質的固定化、細胞培養和色譜分離。
【專利說明】交聯的聚-E-賴氨酸非顆粒狀支持物
[0001]本發明涉及一種非顆粒狀聚合物支持物(polymeric support),製備所述支持物的方法和所述支持物在固相過程中的用途。尤其是，本發明涉及一種含有交聯的聚-ε -賴氨酸的非顆粒狀聚合物支持物。所述支持物在廣泛的物理和化學過程中有用，特別是當與底物的相互作用是例如固相合成、固相萃取、固相試劑、物質的固定化、細胞培養、催化、色譜分析以及醫學診斷所需要的。
[0002]對於本發明，術語聚合物支持物用於描述以任何形式的聚合物，例如整塊料材、膜、纖維，除了特定的形式。
[0003]聚-ε -賴氨酸是一種由通過羧基和第五位(ε )氨基之間的醯胺鍵連接的胺基酸賴氨酸組成的自然發生的短鏈多分散的聚醯胺。這種結構其不尋常在於所述醯胺鍵由羧基和賴氨酸的第五位(ε )氨基之間形成,而在肽的胺基酸之間並且傳統採用聚賴氨酸的正常肽鍵是在羧基和α氨基之間形成。在自然發生的聚-ε -賴氨酸的多分散性通常是在25-35個胺基酸之間。在傳統的市售聚賴氨酸中，肽具有更寬的可控性不佳的多分散性，其通常含有5-500個胺基酸的任意。
[0004]交聯的聚-ε -賴氨酸在結構上具有比傳統的聚賴氨酸更有彈性的性質，是由於醯胺鍵之間更大的鏈長。結構上聚_ε-賴氨酸實際上是一種α-氨基的尼龍5。
[0005]目前，聚-ε-賴氨酸是通過大規模的細菌發酵來製備用作食品防腐劑。其價格低廉並以商業數量隨時可得。在本發明中，我們描述了聚_ε-賴氨酸的交聯以形成不溶性聚合物支持物，其可應用於廣泛的技術中。這些包括但不限於固相肽合成、固相寡核苷酸合成、固相萃取、固相試劑、物質的固定化、細胞培養、催化、色譜分析、農藥的緩釋、和藥品的緩釋、再生醫學和醫學診斷。
[0006]在固相合成過程中有用的固體支持材料是已知的。廣泛的物理和化學過程採用固體支持材料，包括例如有機分子尤其是肽和寡核苷酸的合成、物質的固定化、催化劑的支持物、離子交換、從材料中提取物質、診斷和色譜分析。
[0007]通常情況下，有機分子的多級合成涉及眾多的分離步驟以在進展到隨後階段之前分離在每個階段產生的中間體。這些進程往往費時、昂貴並可能對於產率來說是低效的。中間體通常需要純化以除去過量的試劑和反應副產物，並且可採用例如沉澱、過濾、雙相溶劑萃取、固相萃取、結晶和色譜分析的步驟。
[0008]固相合成提供了超越液相合成的一些優勢。例如，通過可逆地將目標分子附著於固體支持物可以在一定程度上避免液相合成中使用的分離步驟。通過過濾和洗滌固體支持物去除過量的試劑和一些副產物。目標分子可以在一些過程中以基本上定量的產率回收，這在液相合成中通常是特別困難的。此外，固體支持物上進行操作所需的時間通常遠小於在液相合成中進行相應階段所需的時間。
[0009]在一系列過程中的物質固定化也是已知的。例如，在傳統的有機化學包括化學催化和生物催化中使用的催化 劑的固定化通常使用聚合物支持物。也可以採用固定化的酶進行有機化學反應或手性拆分，例如固定化的青黴素醯胺酶用於仲醇的拆分(E.Baldaro等人Tet.Asym.4，1031，(1993))，以及固定化的青黴素G醯胺酶也可用於在製備阿莫西林中節青黴素的水解(Carleysmith, S.W.和 Lilly, Μ.D.Biotechnol.Bioeng.，21，1057-73，1979)。
[0010]固體支持物也可用於在醫療和診斷應用中固定化生物大分子。這包括蛋白質、單克隆和多克隆抗體的固定化。細胞培養通常在固體支持物上進行，具有特定的表面特性和形態。在支持物上的固定化的酶也可用作傳感器來產生信號。一個實例是通過葡萄糖氧化酶/過氧化物酶偶聯酶系統檢測葡萄糖，其中葡萄糖的存在產生過氧化氫，而這又是過氧化物酶的底物，所述過氧化物酶用於氧化廣泛多樣的底物來提供的顏色、螢光或冷光信號。
[0011]其螢光對特定的陽離子或陰離子敏感的各種螢光劑可用於指示特定離子的濃度，包括用於PH測量的氫離子。
[0012]聚合顆粒通常用於色譜分析，其中固體支持物被稱為穩定相。在特定模式的色譜分析中，穩定相的成本可能是限制性的。在其他模式中，穩定相的物理性質可能降低技術的效率。例如，親和、離子交換和凝膠滲透色譜分析中常用的軟聚合物因為顆粒的可變形性質不能在高流速下使用。用於許多其他模式的色譜分析的剛性大孔聚合物往往是機械易碎的並由此遭受短的使用期的困擾。
[0013]在色譜分離中固體支持物或固定相的應用是非常廣泛的，例如用於製藥和生物技術行業的複雜的高科技分離和用於採礦業的較大規模的過程。製藥行業的一些最有價值的藥物是通過製備色譜進行純化，並且改良的色譜分離會是技術上有益的並在經濟上有利的。在採礦和貴重金屬回收行業中，世界上大部分的鈀可使用固定化的冠醚進行精煉(refine)，鈀是廣泛的工業應用和過程中的關鍵組分，包括催化轉換器和高價值產品的製造(Traczyk, F.P.;Bruening, R.L.; Izatt, N.Ε.〃The Application of MolecularRecognition Technology(MRT)for Removal and Recovery of Metal 1ns from AqueousSolutions"; In Fortschritte in der Hydrometallurgie; 1998, Vortrage beim34.Metallurgischen Seminar des Fachausschusses fuer Metallurgische Aus—undWeiterbildung der GDMB;18-20Novemberl998;Goslar)0
[0014]聚合顆粒在固相萃取和固相試劑製備中的用途在化學、製藥和生物技術行業也是已知的。
[0015]已知的固相支持物一般包括滿足所述應用的具有物理性質的聚合物材料。為了方便使用，這些聚合物顆粒通常是大塊料材。
[0016]在肽合成中，聚苯乙烯被廣泛用作聚合物支持物來支持增長中的肽，並且其相對廉價、非常便於獲得，而且在肽合成中提供可接受的性能。肽和寡核苷酸的固相合成中常用的其它市售的支持物可能是昂貴的，例如由於複雜的製造流程。一般使用微孔聚合物和大孔聚合物。微孔聚合物具有相對低水平的交聯劑，其允許聚合物顆粒在合適的溶劑中溶劑化並因而膨脹。大孔聚合物通常在聚合物基質中具有高水平的交聯劑並包含大孔。這些聚合物材料通常是剛性的並具有良好的流動特性，而且適於在填充柱中使用。
[0017]仍然需要找到一種可選的或改進的並符合成本效益的聚合物適合在廣泛的應用中用作非顆粒狀支持物，例如大塊料材支持物。我們現在已經發現，一種交聯的聚-ε -賴氨酸聚合物提供了極好的特性組合，可根據所需的屬性通過適當地選擇交聯劑而定製，並可以符合成本效益地用在廣泛的應用。
[0018]在第一方面中，本發明提供一種非顆粒狀交聯的聚-ε -賴氨酸聚合物。[0019]所述非顆粒狀交聯的聚-ε -賴氨酸聚合物優選地是以宏觀形式。術語「宏觀形勢」表示聚合物製成非顆粒狀的形式並且是大塊料材，並且具有能夠用作單個實體或以單個實體進行操作的形式，與所述單個實體相對的是顆粒狀形式需要多顆粒才能起作用。宏觀形式的例子包括片、纖維和物品，就此而言物品在所有3個維度上具有顯著的長度，相對地纖維在一個維度上具有顯著長度而片在兩個維度上具有顯著長度。
[0020]非顆粒狀聚合物可以包含孔。孔的大小和分布根據所需用途而定製。優選地，非顆粒狀聚合物含有大孔、微孔或超大孔，或者以微孔水凝膠或纖維的形式。
[0021]本發明還提供了包含根據本發明第一方面的交聯的聚-ε -賴氨酸的非顆粒狀支持物。
[0022]優選地，交聯劑使得聚-ε -賴氨酸不可溶。非顆粒狀交聯的聚-ε -賴氨酸聚合物特別可用於提供廣泛的應用，特別是其中交聯提供一種不溶於水和其它溶劑的聚合物。當採用較低水平的交聯，聚合物可溶於水而且這提供了如下所述在某些應用中的優勢。適宜地，聚合物包括聚-ε -賴氨酸和通過醯胺鍵連接的交聯劑。
[0023]交聯的聚-ε -賴氨酸中的聚-ε -賴氨酸組分是交聯的聚合物的主成分。交聯劑作用於將聚-ε -賴氨酸聚合物連接在一起從而聚-ε -賴氨酸聚合物提供一種結構，例如用於一系列應用中的格架，所述應用包括支持例如多肽和多核苷酸的有機分子合成，色譜分析，用作如下文所述的功能性材料的支持物。
[0024]聚-ε -賴氨酸 聚合物通過反應的交聯劑適當地交聯，所述交聯劑具有至少兩個官能團，優選地兩個或更多 個羧酸基團，能與聚-ε_賴氨酸聚合物中的游離α氨基反應。交聯劑可以具有三個或更多個官能團連接到相同數量的聚-ε -賴氨酸聚合物鏈，或更少的鏈但具有多個連接到一個或多個所述鏈。交聯劑可以含有其它官能團，其不參與交聯反應，並在使用交聯的聚合物時保持可用於和其他物質的反應。
[0025]聚合物支持物中的交聯水平可用來控制最終的交聯的聚-ε -賴氨酸的物理形態和化學反應性。引進高水平的交聯會產生適合用於製備大孔聚合物支持物的剛性結構，而低水平的交聯會產生更軟更多微孔材料。氨基功能性高與低水平的交聯相伴隨，其可以容易地通過控制加帽而定製。處理、溶劑化和物理性質也可以通過引入不同的交聯劑被定義。
[0026]適宜地，交聯劑包括特定的化合物或化合物組。交聯劑可以包括重複單元並是多分散的，然而多分散性是窄的以確保適當地控制交聯時形成的格架結構。所述交聯劑包括至少兩個能與聚-ε_賴氨酸的α碳氨基反應的官能團。適合於此目的的常見的官能團的實例包括羧酸。
[0027]醯胺鍵是可生物降解的，並且本發明所述交聯的聚合物以及包含其的支持物在生物可降解性尤為重要的一些應用中是特別有用的。另外，醯胺鍵可被代謝例如通過酶包括蛋白酶，也可被生物降解並在醫療應用中的使用特別有優勢，而且特別是在人體或動物體中的醫療應用。本發明所述聚合物和支持物在醫療應用中提供益處，其中聚合物或支持物隨著時間的推移適當地降解，因而不需要在其功能完成之後去除支持物的流程。
[0028]在一個特別優選的實施方案中，交聯劑和聚-ε -賴氨酸之間的鍵包括醯胺鍵，優選地至少20%，更優選至少50%，所需地至少90%，特別是幾乎所有的鍵是醯胺鍵。
[0029]在進一步優選的實施方案中，所述聚合物是輕微交聯的，並且從1%上至50 %、1-20%以及1-10%的ε氨基被交聯。本發明的輕度交聯的聚合物和支持物在有機物質(例如肽和核苷酸序列)合成以及在遞送活性物質(例如藥物活性劑)中特別有用。
[0030]因此，在一個優選的實施方案中，交聯劑包括兩個或更多個羧酸基團和連接兩個或更多個的基團的脂肪鏈。交聯劑可以包括多元酸。在一個優選的實施方案中，交聯劑包括分子式為X[C02H]n的化合物，其中η為2或更大，優選2-6，更優選為2_4，並且X是疏水性或親水性的連接基團，優選脂肪族的。適當地，基團X具有的分子量為14-250，更優選為28-140，不包括連接基團上的任何功能取代基。X可以包含雜原子例如氧和氮作為連接基團的骨架的部分，並且可以包含官能團用於在使用交聯的聚-ε -賴氨酸期間與其他物質反應。
[0031]連接酸性基團的脂族鏈可以是親水的，優選雙-羧基-聚亞烷基二醇，例如雙-羧基-聚乙二醇，或脂族鏈可以是疏水的提供疏水性交聯劑，例如癸二酸提供更親脂性的支持物。交聯劑可以衍生自前體材料，例如酸酐。其它合適的交聯劑的例子包括次氮基三乙酸、戊二酸和 hoocch2ch2conhch2ch2och2ch2och2ch2och2ch2nhcoch2ch2cooh。
[0032]當交聯劑具有少於5個原子的時候，非顆粒狀支持物或宏觀形式的物理整體性會受到破壞或失去。在一個優選的實施方案中，X包括烴基並且僅包括氫和碳原子，優選為
3-14個，更優選6-12個，而且特別是6-8個碳原子。優選地，交聯劑具有8_10個碳原子。所述烴基可以是直鏈或支鏈的，優選為直鏈。所述烴基可以是飽和的或不飽和的，優選為飽和的。優選的交聯劑的實例包括具有8-10個碳原子的二羧酸，如癸二酸、十二烷酸和壬二酸。
[0033]聚-ε -賴氨酸可在交聯之前衍生化或被修飾以允許本領域的技術人員所熟悉的其他交聯化學。例如，聚-ε -賴氨酸可在交聯之前衍生化或被修飾以允許本領域的技術人員所熟悉的其他交聯化 學。例如，聚-ε -賴氨酸可通過與戊二酸反應然後使用多功能胺使用本文描述的活化化學進行交聯而被預衍生化。
[0034]聚-ε-賴氨酸可以使用胺基酸(例如天冬氨酸和穀氨酸)被交聯。交聯的聚-ε -賴氨酸在這種情況下僅在降解時只生成天然存在的胺基酸。與胱氨酸反應，將產生以類似的方式交聯的聚合物，但在這種情況下結構中將包含半胱氨酸二硫鍵，其在降解時也會產生天然存在的胺基酸。
[0035]優選的交聯劑的例子包括穀氨酸、胱氨酸，EDTA (乙二胺四乙酸)、己二酸、十二烷二酸、合成肽(特別是基於天然膠原蛋白結構的肽)、含有三肽序列-Arg-Gly-Asp-的合成肽、纖維蛋白原和其他天然蛋白質中的細胞結合肽、含有多個羧酸基團的天然存在的聚合物包括明膠、特別適合用於金屬螯合和色譜分析的具有多個羧酸基團的藻酸和冠醚。其它合適的例子如下:
[0036]
【權利要求】
1.非顆粒狀的交聯的聚-ε-賴氨酸聚合物。
2.根據權利要求1的聚合物，其包含通過醯胺鍵連接的聚-ε-賴氨酸和交聯劑。
3.根據權利要求1或權利要求2的聚合物，其中所述聚合物是與交聯劑交聯的，所述交聯劑包含能夠與聚-ε_賴氨酸的α碳胺反應的至少兩個官能團。
4.根據前述權利要求中任一項的聚合物，其中所述交聯劑包含兩個或更多個羧酸基團和連接兩個或更多個的基團的脂肪鏈。
5.根據前述權利要求中任一項的聚合物，其在水中是不可溶的。
6.根據前述權利要求中任一項的聚合物，其是多孔的。
7.一種非顆粒狀支持物，其包括根據前述權利要求中任一項的聚合物。
8.根據權利要求7的非顆粒狀支持物，其中所述交聯的聚-ε-賴氨酸支持物用於直接或間接包被非顆粒狀介質。
9.根據權利要求7或權利要求8的非顆粒狀支持物，其中所述交聯的聚-ε-賴氨酸支持物用於包被非顆粒狀介質和與非顆粒狀介質共價結合。
10.根據權利要求7-9中任一項的非顆粒狀支持物，其中所述交聯的聚-ε-賴氨酸用於包被有機非顆粒狀介質。
11.根據權利要求7-9中任一項的非顆粒狀支持物，其中所述交聯的聚-ε-賴氨酸用於包被無機非顆粒狀介質。
12.根據權利要求7-11中任一項的非顆粒狀基於交聯的聚-ε_賴氨酸的支持物，其中所述交聯的聚-ε -賴氨酸是功能化的以提供包含下述的材料:催化劑、用於肽合成的引發劑物質、用於寡核苷酸合成的引發劑物質、用於固相有機合成的引發劑物質、藥物活性物質、農藥活性物質、用於色譜分離的表面、促進細胞培養或分化的物質、蛋白質或其他生物大分子。
13.—種三維結構，其包括根據權利要求1 一 6中任一項的交聯的聚-ε -賴氨酸。
14.根據權利要求13的三維結構，其中所述結構是微孔的、大孔的或纖維的。
15.根據權利要求13或權利要求14的三維大孔結構，其被交聯的聚-ε-賴氨酸所包被，其中用於包被的交聯的聚-ε -賴氨酸直接或間接共價結合至微孔的、大孔的或纖維的結構。
16.根據權利要求13或權利要求14的三維大孔結構，其被交聯的聚-ε-賴氨酸所包被，其中用於包被的交聯的聚-ε -賴氨酸不共價結合至微孔的、大孔的或纖維的結構。
17.根據權利要求13-16中任一項的三維基於交聯的聚-ε-賴氨酸的支持物,其中所述交聯的聚-ε -賴氨酸是功能化的以提供包含下述的材料:催化劑、用於肽合成的引發劑物質、用於寡核苷酸合成的引發劑物質、用於固相有機合成的引發劑物質、藥物活性物質、農藥活性物質、用於色譜分離的表面、促進細胞培養或分化的物質、蛋白質或其他生物大分子。
18.片、物品或纖維，其包括根據權利要求1一 6中任一項的聚合物或根據權利要求7 - 17中任一項的支持物。
19.傷口處理產品，其包括根據權利要求1-6中任一項的聚合物或根據權利要求7-17中任一項的支持物和用於治療傷口的組分或組合物和/或治療劑。
20.根據權利要求19的傷口處理產品，其中所述聚合物或支持物是以片的形式。
21.醫學診斷劑，其包含根據權利要求7-178中任一項的非顆粒狀支持物並包含被所述支持物結合或保留的功能性材料。
22.根據權利要求21的醫學診斷劑，其中所述功能性材料包含被所述支持物支持的酶。
23.根據權利要求7-17中任一項的非顆粒狀支持物在選自下述的方法中的用途:肽、寡核苷酸、寡糖的固相合成；固相萃取；固相有機化學；選自固相試劑、金屬和其他催化劑、生物催化劑、酶、蛋 白質、包括多克隆和單克隆抗體的抗體、完整細胞和聚合物的物質的固定化；細胞培養；用於色譜分離的穩定相的製備；或用作吸收劑或用作受控釋放產品的可生物降解載體。
【文檔編號】A61K49/18GK103619911SQ201280028657
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年4月20日 優先權日:2011年4月20日
【發明者】D·威靈斯 申請人:斯菲瑞技術有限公司