使用融合至肝素結合序列的生長因子促進心臟修復的方法

2023-09-16 23:39:05 2

專利名稱：使用融合至肝素結合序列的生長因子促進心臟修復的方法
技術領域：
本發明涉及其中促進細胞的生長和/或存活的多肽融合至結合肝 素的肽的蛋白質。可將此類蛋白質與心肌細胞結合併且施用至損傷的 心臟組織以幫助促進修復。
背景技術：
胰島素樣生長因子-l(IGF-l)是促進心肌細胞的生長和存活的蛋 白質。缺乏IGF-1的小鼠在心肌梗塞(myocardial infarction)後展 示增加的凋亡(Palmen， 等人，Cardiovasc. Res. 50:516-524 (2001))，然而心肌特異性IGF-1的過表達在梗塞形成後保護肌細胞 免受凋亡和心室擴張的侵害(Li，等人，J. Clin. Invest. 100:199卜1999 (1997); Torella， 等人，Circ. Res. 94:514-524 (2004))。 IGF-1的過表達還增加心臟幹細胞數目和生長，從而導致肌 細胞周轉和老化心臟的作用的增加。梗塞形成後，IGF-1促進移植入 心肌的胚胎幹細胞的移入(engraf tment )、分化和功能的提高(Kofidis 等人，Stem Cells 22:1239-1245 (2004))。此外，IGF-1的血清水平 與老年患者的亞群中的先天性心臟衰竭(congenital heart failure) 的風險呈負相關(Vasan， 等人，Ann. Intern. Med. 139: 642-648 (2003))。
上述特徵使IGF-1成為對已經歷心臟組織的損傷的患者，例如， 已經歷心肌梗塞的患者來說誘人的治療劑。然而，IGF-1是易於擴散
7通過組織的小蛋白質。因此，難以在組織損傷部位長時間保持高濃度
的該因子。已被採用以保持高局部濃度的一個方法是將IGF-1與自我 裝配的生物膜結合(參見US20060088510)。通過使用心肌梗塞的大鼠 模型，發現當將該膜與新生心肌細胞一起植入時，植入的細胞的存活 和生長與和未結合的IGF-1—起植入的細胞相比得到提高。因此，細 胞定居損傷的心臟和提高功能的能力得到增加。通過使用相似的方法， 使用PDGF也獲得積極的結果(US20060148703)。儘管這些結果具有前 景，但避免對構建和移植膜的需要的可選方法將是期望得到的。
發明概述
本發明基於將IGF-1與心肌細胞結合(在它們植入損傷的心臟組 織之前)的方法的發展。已發現，可能將IGF-1與肝素給合肽(HBP) 連接並且獲得保持對培養細胞的存活的有益效應的融合蛋白。融合蛋 白結合心肌細胞(推測結合細胞表面肝素)比單獨的IGF-1效果更好。 因為許多不同的細胞類型具有細胞表面肝素，因此不預期簡單地全身 性注射IGF-1/HBP蛋白對心臟病患者十分有益。然而，靶向作用可通 過在植入之前將心肌細胞與IGF-1/HBP—起溫育來獲得。在更低的程 度上，局部化還可通過將蛋白質直接注射入心臟組織來獲得。相似的 方法在治療對生長因子起反應(使用或不使用細胞移植)的其他病況 (例如，創傷)中應當是有用的。
在其第一方面，本發明涉及具有式B-(J)n-(Z)q或(Z)q-(J)n-B 的化合物，其中n是從0至10的整數；q是從l至5的整數；B是促 進心肌細胞的生長和/或存活(如例如使用4皮剝奪血清的細胞所測定 的)的肽，Z是肝素結合肽。可使用本領域內已知的任何肝素結合肽， 包括所有本文中描述的肽。J是蛋白質形成性(proteinogenic)氨基 酸或可用於將肽連接在一起的化合物例如生物素/抗生物素蛋白。為了 本發明的目的，從N端(極左)至C端(極右)書寫所有肽序列，並且除 非另外指出，所有肽由"蛋白質形成性"胺基酸組成，即，它們是 丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、穀氨酸(E)、穀氨醯胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮 氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨 酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或纈氨酸(V)的左旋體 (L一isomer )。
在優選實施方案中，上文所示的式的化合物是融合蛋白，其中， L是蛋白質形成性胺基酸，A是胰島素衍生生長因子-1 (IGF-l)或血小 板源性生長因子(PDGF)。人IGF-1的全長序列(GenBank登錄號NM
00618) 如 下
MGKISSLPTOLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETL CGAELVDALOFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPOTGIVDECCFRSCDLRRL EMYCAPLKPAKSARSVRAORHTDMPKTOKEVHLKNASRGSAGNKNYRM
(SEQIDN0:1)。然而，按照本文中描述的方法，下劃線標示的序列足 以促進心肌細胞生長和存活。因此，為了本發明的目的，IGF-1定義
ECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPTKSA (SEQ ID NO: 2)並且可任選地包含SEQ ID NO: 1的序列的任何另外部分。例如，C端可始於G、 AG、 TAG等。類似 地，SEQ ID NO: 2的N末端可按照SEQ ID NO: 1延伸。因此，肽可以 在R、 RS、 RSV等處終止。PDGF的全長胺基酸序列在本領域內也是熟 知的(參見，Rao，等人，Proc, Nat'1 Acad. Sci. USA 83: 2392-2396 (1986))並且尤其可發現為GenBank登錄號P01127。在上文所示的式 中，n優選為0, q優選為1。
優選的肝素結合肽，即，式中的Z,是
KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQ ID NO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQ ID NO:4); PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQIDNO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQ ID NO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQIDNO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQ ID NO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ IDNO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ ID NO:IO);LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO: 11);
PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12); KGKMHKTCYY (SEQ ID NO: 13); MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);
PPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:2"。
本發明還包括編碼上述任何融合蛋白的DM分子、包含此類DNA 分子的載體和用所述載體轉化的宿主細胞。所述宿主細胞可用於產生 用於本文中描述的治療方法的融合蛋白。DM還可用於轉化在組織損 傷部位分泌融合蛋白的細胞。分泌後，蛋白質將結合附近的其他細胞， 從而保持相對高的局部濃度。
本發明還包括使用一種或多種融合蛋白或化合物治療患有對 IGF-1或PDGF起反應的任何病狀的患者的方法。在一個實施方案中， 直接對治療部位施用化合物或融合蛋白以允許它們結合內源細胞的表 面。更優選，將它們用於治療其中需要組織生長或修復並且存在可獲 得的可用於幫助該過程的細胞的病狀。在此類情況下，可將化合物或 融合蛋白與細胞一起預溫育以使它們在植入前結合。在特別優選的方 法中，通過將心肌細胞與化合物或融合蛋白在足以允許它們結合的條 件下一起溫育一段時間來治療患者的損傷的心臟組織(例如，由於心 肌梗塞引起的)。然後將細胞注射入或植入患者的心臟組織。
還可使用化合物和融合蛋白修復損傷的軟骨。通常，IGF-l擴散 出軟骨，從而其對移植的軟骨細胞的作用減小或消失。通過在植入前 將軟骨細胞與肝素結合IGF-1 —起溫育，生長因子的局部濃度將增加 並且，作為結果，軟骨細胞將產生更多的軟骨。
經基因工程改造而結合肝素的生長因子，特別地IGF-1，還可結 合將被植入以修復和再生例如患者的神經元的細胞，所述患者患有神 經退行性疾病(neurodegenerative disease)例如ALS， 患有中風，或由於損傷已喪失神經功能。IGF-1是用於ALS的臨床試驗的候選物， 並且已發現其促進皮質脊髓運動神經元中的軸突向外生長(6zdinler， 等人，Nature Neurosci. 9:1371-1381 (2006))。通過在植入前將 IGF-1與神經元結合，將增強它們的體內生長。
發明描述
本發明基於概念損傷後組織的修復可通過保持高局部濃度的生 長因子例如IGF-1或PDGF來促進。本領域內描述的實驗支持使用生物 相容性膜來在施用部位保留治療劑的該方法(參見US20060088510和 US20060148703)。現已發現，生長因子可融合至肝素結合肽並且可在 它們植入心臟組織之前將其與心肌細胞結合。融合蛋白保持其促進細 胞生長和存活的能力並且在植入部位得到保持而無需製備和使用生物 相容性膜。
肽的製備
將肝素結合肽與治療劑連接的一個方法是通過非肽連接體的使 用。例如，生物素和抗生物素蛋白用於連接分子的用途在本領域內是 熟知的，可使用標準方法將肝素結合肽與生長因子例如IGF-1結合。
為了防止生物素/抗生物素蛋白基團和肽之間的位阻影響(steric interference),可在兩者之間包含間隔子。間隔子可採取1-15 (優 選1-IO)個脂肪酸或1-15 (優選l-10)個胺基酸的形式。用於整合該類 型的間隔子的方法在本領域內是熟知的。
優選，以融合蛋白的形式將肝素結合肽和生長因子例如IGF-1和 PDGF連接在一起。可以化學合成或使用重組DNA技術製備融合蛋白。 化學方法包括使用標準N-叔-丁氧羰基(t-Boc)化學試劑的固相肽合 成和使用n-甲基吡咯烷酮化學試劑的循環。在合成肽後，可使用方法 例如在反相柱上進行的高壓液相色譜法純化它們。純度還可通過HPLC 來估量，並且正確組合物的存在可通過胺基酸分析來確定。與勿應^潛合
心肌細胞或其他細胞可使用標準方法來獲得，然後可將其與融合 組合物或蛋白一起溫育足以使融合蛋白結合細胞表面的時間。溫育可 持續從大約1小時至數天的任何時間，並且應當在允許細胞存活的條
件下(例如在大約37°C、中性pH下)和在確保細胞存活的培養基中 進行。存在的蛋白質的量通常應當足以包被細胞但確切的量不是至關 重要的。細胞可通過注射器或導管施用至心臟組織。所使用的細胞的 精確量不是至關重要的，但通常將使用1X1S至1X10'個細胞的量。
秀參jg合參希浙量
可將融合蛋白併入含有載體例如鹽水、水、林格氏溶液和其他試 劑或賦形劑的藥物組合物中，並且可將細胞維持在標準培養基中以保 持生活力。通常設計用於植入、輸注或注射入特別是心臟組織的製劑， 但局部治療也可用於例如創傷的治療。所有藥物組合物可使用本領域 內的才示準方法(參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版.A. Oslo, ed. ， Eastern, PA (1980))來製備。
預期本領域技術人員將使用臨床醫學中良好建立的方法逐案
整劑量。最佳的劑量將通過本領域內已知的方法來測定，並且將受到 因素例如患者的年齡、疾病狀態和其他臨床相關因素的影響。
實施例
實施例1:心肌細胞的存活
本實施例證明IGF-1提高了 ES ;肝生的心肌細胞的存活和描述了 經基因工程改造以提高注射細胞的存活的新型肝素結合(HB)-IGF-1 融合蛋白的開發。
為了使畸胎瘤形成最小化，我們研究了定向分化成心肌細胞譜系的ES細胞。通過懸滴法(hanging drop method)將用ot-心肌肌球蛋 白重鏈啟動子驅動的增強型綠色焚光蛋白(EGFP)穩定轉染的小鼠ES 細胞分化成心肌細胞，通過螢光細胞分選純化EGFP陽性細胞。在此類 ES衍生的心肌細胞中，IGF-1減少由血清剝奪誘導的細胞死亡(13. 6 +/- 1. 9 %對25. 9 +/- 2. 5 % (對照中),p<0. 05)和減少由血清剝奪 誘導的凋亡(分別地TUNEL-陽性細胞8. 0 +/- 1. 5 %對4. 3 +/- 0. 5 %， p<0. 05)。此外，IGF-1減少阿黴素(liuM， 24小時)或白屈菜赤鹼(3 HiM， 1小時)誘導的凋亡(p〈0. 01)。磷酸肌醇-3激酶抑制劑LY294002 (10pM)抑制IGF-1對阿黴素誘導的凋亡的保護作用(p<0. 05)。因為 IGF-1快速地從注射的部位擴散開，因此我們設計和表達具有N末端 HB結構域的新型重組IGF-1融合蛋白。通過鎳親和層析純化蛋白質， 然後使其經歷氧化重新摺疊，從而恢復生物活性。HB-IGF-1比IGF-1 顯著更好地結合細胞表面，並且HB-IGF-1與天然IGF-1同樣有效地在 新生心肌細胞和3T3成纖維細胞中激活Akt。
潛論
因為IGF-1在體外提高ES衍生的心肌細胞的存活，因此該新型 肝素結合IGF-1可通過結合注射細胞的表面來改善細胞療法。這表明 了通過局部遞送的治療性蛋白改變細胞微環境的可能性。
實施例2:軟骨修復
在本實施例中，我們設計和純化了新蛋白質，肝素結合 IGF-1 (HB-IGF-l),該蛋白質是天然IGF-1與肝素結合表皮生長因子樣 生長因子的肝素結合結構域的融合蛋白。HB-IGF-1與肝素以及3T3成 纖維細胞、新生心肌細胞和正在分化的胚胎幹細胞的細胞表面選擇性 結合。HB-IGF-1以與IGF-1相同的動力學和劑量依賴性激活IGF-l受 體和Akt，表明沒有因肝素結合結構域而導致的生物活性的減弱。因為 軟骨是富含蛋白聚糖的環境以及IGF-1是已知的軟骨細胞生物合成的 刺激物，因此我們研究了 HB-IGF-1在軟骨中的功效。HB-IGF-1通過軟骨外植體得到選擇性保留並且與IGF-1相比導致持續的軟骨細胞蛋 白聚糖生物合成。這些數據顯示對"遠距離(long-distance)"生長 因子如IGF-1進行基因工程改造以用於局部遞送的策略可用於組織修 復和使全身效應最小化。
材料和方法 威'雄種建
大鼠 IGF-1 cDNA 通過使用引物 (5'至 30 GGACCAGAGGACCCTTTGCG (正向，SEQ ID NO: 22)和 AGCTGACTTT GTAGGCTTCAGC (反向，SEQ ID NO: 23)進行聚合酶鏈式反應(PCR )來 擴增。我們使用成熟肽IGF-1 (70個胺基酸)，其編碼外顯子3和4 (Hameed，等人，J. Physiol. 547:247-254 (2003); Shavlakadze， 等人，Growth Horm IGF Res 15:4-18 (2005); Musaro,等人，Exp Gerontol. 42:76-80 (2007))。將產物亞克隆入pTrcHis-T0P0載體 (Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)，在IGF-1的C末端加入終止密 碼子(TAG)，從而編碼帶Xpress-標籤的IGF-1 (Xpress-IGF-l)。 為編碼HB-IGF-1，通過誘變在X-press標籤和IGF-1序列之間插入大
TAAGAAATACAAG (SEQ ID NO: 24))的肝素結合序列(AA 93-113)。
用PfuUltra HF DM聚合酶(Stratagene， Cedar Creek, TX， USA) 進行擴增，並且在於大腸桿菌(E. coli)中轉化前用"/wl (New England Biolabs， Beverly, MA， USA)消化模板質粒。通過DNA測序確認所有 序列。
將Xpress-IGF-1和HB-IGF-1在大腸桿菌BL21細胞中表達並且 以4升的批次培養於LB培養基中。用lmM異丙基P-D-硫代半乳糖苷 誘導蛋白質合成，進行4小時，然後通過離心收穫細胞，將其在裂解 緩衝液(6 M鹽酸胍，20 mM磷酸鈉，500 mM NaCl， pH 7. 8)中裂解，並進行均質化。第一純化步驟由使用Ni-NTA (Invitrogen)，利用融 合蛋白中的多組氨酸標籤進行的親和純化組成。Ni-NTA樹脂用清洗緩 衝液(8 M尿素，500 mM NaCl， 20 mM磷酸鹽，pH 6. 2)清洗，然後在 pH 4下洗脫結合的蛋白質。然後使洗脫的蛋白質經歷氧化重新摺疊， 從而恢復生物活性。將蛋白質與重新摺疊緩衝液(50 raM Tris， 75 mM NaCl， 100 jaM氧化型穀胱甘肽和100 jaM還原型穀胱甘肽，pH 7. 8) 在4。C下一起溫育過夜。在重新摺疊後，將樣品調整至0. 1%三氟乙酸， 然後裝載於C18反相高效液相色鐠(RP-HPLC)柱子(Delta-Pak C18， Waters, Milford， MA， USA)上，作為終純化步驟。使柱子經歷從25% 至40%的乙腈的線性梯度(在0. 1%的三氟乙酸中)。
從新生Sprague Dawley大鼠的心室製備心肌細胞的原代培養物， 將其培養在含有7%胎牛血清(Invitrogen)的達爾伯克氏改良伊格爾 氏培養基(Dulbecco' s modified Eagle's medium) (DMEM, Invitrogen) 中；24小時後，用無血清培養基替換培養基。將3T3成纖維細胞培養 在含有10。/。新生牛血清(Invitrogen)的DMEM中，在實驗前24小時用 無血清培養基替換培養基。將小鼠胚胎幹細胞(ES)在不含有飼養細胞 的明膠塗覆的培養皿中培養於補充有15% KNOCKOUT SR (Invitrogen) 和白血病抑制因子(Chemicon， Billerica， MA， USA)的格拉斯哥極限 必需培養基(Glasgow Minimum Essential Medium) (Invitrogen)中。 每3天對細胞進行傳代。為了誘導分化，首先酶促分離細胞，以前述 用於胚狀體形成的懸滴形式培養細胞(Takahashi， 等人， Circulation 107: 1912-1916 (2003))。加入含有10% ES細胞級胎牛 血清(Invitrogen)、不含白血病抑制因子的分化培養基。此類ES細胞 在分化成心肌細胞後變成綠色螢光蛋白(GFP)P曰性，因為它們已用oc-肌球蛋白重鏈啟動子驅動的增強型GFP載體穩定轉染。在胚狀體形成 後(第7天)，將細胞塗布在明膠塗覆的培養皿上。從1-2周齡的初生小牛的髕股骨滑槽(fe,opatellar groove) 獲取牛關節軟骨外植體(3-mm-直徑、l-mm-厚的盤)，將其在37'C於5% C0z氣氛中培養於含有10 mM HEPES、 0. lmM非必需胺基酸、0. 4 mM L-脯氨酸、20 /ag/ml抗壞血酸鹽、100 U/ml青黴素和100 |u g/ml鏈 黴素的低葡萄糖DMEM中。
用含有1% Triton-X、 0. 25%脫氧膽酸鈉、lmM乙二胺四乙酸 (EDTA)、 lmM苯甲磺醯氟(PMSF) 、 lmM NaF、 lmM Na3V04和1: 1000蛋白 酶抑制劑混合物(Sigma， St. Louis， MD， USA)的磷酸鹽緩沖液(PBS) 裂解新生心肌細胞和3T3成纖維細胞。將軟骨盤研磨成粉並且用100mM NaCl、 50mM Tris、 0.5% Triton-X、 5mM EDTA、 lraM PMSF和1:1000 蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)進行裂解。通過Bradford測定法測量蛋 白質濃度，在各小孔中加載10 pg蛋白質以進行Western印跡分析。 如通過DMMB染料結合所測量的，在所有樣品中觀察到相似的GAG含量。 使用抗-Xpress抗體(Invitrogen)、抗-多克隆IGF-1抗體(Abcam， Cambridge, MA， USA)、抗-磷酸-IGF-l受體抗體(Cell Signaling, Danvers， MA， USA)、抗-磷酸-Akt抗體(Cell Signaling)和抗-肌動 蛋白抗體(Sigma) 。 IGF-1作為對照蛋白質購自Sigma。
為了通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測融合蛋白，用抗 -Xpress抗體(10jag/ml)塗覆96孔板過夜。向各小孔中加入相同量的 來自軟骨提取物的蛋白質。多克隆IGF-1抗體用作一抗，抗-兔-辣根 過氧化物酶(Bio-Rad， Hercules, CA， USA)用作二抗。在加入ABTS 過氧化物酶底物(KPL， Gaithersburg, MD, USA)後，在405nm處對板 進行讀數。
將肝素瓊脂糖珠粒(Sigma)與 300 pmol HB-IGF-1或Xpress-IGF-1 一起溫育2小時，然後用PBS清洗3次。通過用SDS-PAGE 樣品緩沖液(Invitrogen)煮沸來提取與肝素瓊脂糖珠粒結合的融合蛋 白。將3T3成纖維細胞或新生大鼠心肌細胞與100nMHB-IGF-l或對照 IGF-l(Sigma)—起溫育2小時，然後用PBS清洗3次。用裂解緩衝液 裂解細胞，然後使其經歷使用抗-IGF-l抗體的Western印跡分析。將 胚狀體(在誘導分化後10天)與融合蛋白一起溫育2小時，用PBS清洗 3次，在用抗-Xpress抗體進行免疫組織化學分析之前用多聚甲醛將其 固定。將軟骨盤培養在補充有500nMHB-IGF-l或500nM Xpress-IGF-l 的無血清DMEM中。在48小時後(第0天)，用PBS清洗盤3次，然 後將其與不含有IGF-1的DMEM—起溫育。在第0、 1、 2和4天收集盤。 通過Western印跡分析和ELISA檢測保留在軟骨提取物中的蛋白質。
通過[35S]硫酸鹽(PerkinElmer， Waltham, MA， USA)的整合測量 軟骨細胞蛋白聚糖的合成，如之前所描述的(Sah，等人，J. Orthop. Res. 7:619-636 (1989))。使軟骨盤於無血清培養基中平衡1天，然 後在含有100nM HB-IGF-1、 Xpress-IGF-1或對照IGF-1 (Sigma)的培 養基中溫育2天。然後用PBS清洗盤3次，然後更換至無IGF-1的培 養基中。用5juCi/ml ["S]硫酸鹽放射性標記培養的盤，進行最後24 小時的培養。標記後，在4。C下在1. Oml含有0. 8mM脯氨酸和lmM Na2S04 的PBS中清洗各個盤3次以除去游離放射性標記。將盤於1. Oml蛋白 酶K (125Mg/ml於O. lMNa2S04， 5mM EDTA和5mM半胱氨酸，pH 6.0 中)中進行消化。通過20ju 1消化物與180 n 1赫斯特染料(Hoechst dye) 33258 (24)的反應藉助螢光分析來分析樣品的DNA含量。然後在 閃爍計數器(Wallac MicroBeta TriLux， PerkinElmer， Waltham， MA， USA)中測量消化物的["S]硫酸鹽含量，對溢出和猝滅進行校正。
通過Student's t檢驗進行統計分析，接受水平oc-0.05。使用ot -1- (1- a 。)1/n就多重比較對t檢驗進行校正，其中a 。- 0. 05並且n= 比較的總數。所有數據表示為平均值土SE。
結果
t^-/^W ^趁必
IGF-1具有3個二疏鍵，包含70個胺基酸。IGF-l融合蛋白包含 用於蛋白質純化的多組氨酸標籤和用於蛋白質檢測的Xpress標籤。 HB-IGF-1和Xpress-IGF-1的分子量分別為14， 018 Da和11， 548 Da。 HB-IGF-1在IGF-1的N末端上具有HB結構域。HB結構域具有21個氨 基酸，其包含12個帶正電荷的胺基酸。重新摺疊後的新型融合蛋白使 用RP-HPLC進行最終純化。如之前所述(Milner，等人，Biochem. J. 308 (Pt 3): 865-871 (1995))鑑定正確摺疊的蛋白質，並使用生物活性 測定法對其進行驗證。在進行RP-HPLC後，重新摺疊的IGF-1蛋白的 考馬斯藍染色和使用抗-Xpress抗體的Western分析顯示單個條帶。
v^-/f7F-i潛合，;^希勿^羞面
我們首先檢測HB-IGF-1是否選擇性結合肝素。在將肝素瓊脂糖 珠粒與300 pmol HB-IGF-1或Xpress-IGF-1溫育2小時後，通過煮 沸從珠粒提取結合的蛋白質。與Xpress-IGF-1相比，與肝素瓊脂糖珠 粒結合的蛋白質的考馬斯藍染色顯示HB-IGF-1選擇性結合肝素。然後 我們使用3T3成纖維細胞和新生大鼠心肌細胞來檢測HB-IGF-l結合具 有硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan)的細胞表面 的能力。在用0 - lOOnM的HB-IGF-1預處理2小時後，用PBS清洗細 胞3次。關於這些實驗，將商購獲得的IGF-1用作對照。當用10nM 和100nM濃度處理時，HB-IGF-1結合3T3成纖維細胞。與新生心肌細 胞結合的HB-IGF-1在10nM和lOOnM時顯示明顯的HB-IGF-l的選擇性 結合，在lOOnM時顯示非常弱的IGF-1的條帶。這些結果與該HB結構 域在亞微摩爾範圍內對肝素的結合相符。我們還研究了 HB-IGF-1結合 胚狀體中的胚胎幹細胞的能力，所述胚狀體包含多種細胞類型。通過 針對Xpress表位標籤的免疫螢光容易地在胚狀體中的細胞的表面上檢測到HB-IGF-1，這表明HB-IGF-1可結合多種細胞類型。
為了確定HB結構域是否幹擾生物活性，進行IGF-1受體磷酸化 和Akt激活的生物測定。對照IGF-l、 HB-IGF-1和Xpress-IGF-1全 都以劑量依賴性的方式激活新生心肌細胞的IGF-l受體並同等地誘導 Akt的磷酸化。對照IGF-1、 HB-IGF-1和Xpress-IGF-1全都在相似的 時程內激活Akt。這些數據證明肝素結合結構域的加入不幹擾IGF-l 的生物活性。
朋-/W-J ^歡#
軟骨是富含蛋白聚糖的組織，軟骨細胞以增加的細胞外基質合成 對IGF-l作出反應。因為IGF-1信號轉導的延長的局部刺激可由此有 益於軟骨修復，所以我們研究了 HB-IGF-1結合軟骨的能力。將相同大 小的牛關節軟骨盤與500nM HB-IGF-1或Xpress-IGF-1 —起溫育1天、 3天或6天，在該時間內擴散入軟骨的IGF-1蛋白的量沒有差異。在 與HB-IGF-1或Xpress-IGF-1 —起預溫育48小時後，在第0天用PBS 清洗軟骨盤，檢測到相似量的IGF-1。然而，在除去IGF-1蛋白後第1、 2和4天，只有HB-IGF-1保留在軟骨中，這表明HB-IGF-1結合富含 蛋白聚糖的細胞外基質。相反，即使在清洗後1天，也未能檢測到 Xpress-IGF-l。 我們還4吏用軟骨提取物和ELISA測量進行了該選擇 性結合實驗。這些結果確認HB-IGF-1被軟骨選擇性保留，而 Xpress-IGF-1快速丟失。
7潛*炎#勿應參合4 HB-IGF-1至軟骨的選擇性保留表明該融合蛋白可遞送持續的刺 激以進行軟骨細胞生物合成。因此，我們通過["S]硫酸鹽的整合來測 量細胞外基質蛋白聚糖的軟骨細胞生物合成。將軟骨盤與100nM HB-IGF-1、對照IGF-1或Xpress-IGF-1 —起溫育2天，用PBS清洗3 次，然後在不含IGF-1的培養基中進行培養。在第0天(洗掉前)、
19第2天(剛洗掉後)、第4天、第6天和第8天測量TS]硫酸鹽整合， 進行24小時。在第0天，在與IGF-1構建體溫育期間，如所預期的， 對照IGF-1、 Xpress-IGF-l和HB-IGF-1組全都刺激蛋白聚糖合成。然 而，在清洗後，對照IGF-1和Xpress IGF-1在第4天或之後都不剌激 蛋白聚糖合成。相反，HB-IGF-1導致持續刺激蛋白聚糖合成6天。與 Xpress-IGF-l相比，在第2、 4和6天，與HB-IGF-1—起溫育的軟骨 中蛋白聚糖的合成顯著更高。這些數據證明選擇性保留在軟骨中的 HB-IGF-1在更長的持續時間內刺激軟骨細胞生物合成。
討論
IGF-1的局部遞送具有促進組織修復和再生同時使全身性不利效 應最小化的潛能。在本實施例中，我們描述了結合富含蛋白聚糖的組 織和細胞表面且具有與IGF-1相同的生物活性的新型IGF-1蛋白 HB-IGF-1。我們的數據表明HB-IGF-1可激活IGF-1受體和Akt，從而 表明肝素結合結構域不幹擾IGF-1與其受體的相互作用。IGF-1具有4 個結構域B結構域(AA1-29) 、 C結構域(AA30-41) 、 A結構域(AA42-62) 和D結構域(AA63-70) ， C結構域在與IGF-1受體的結合中起著最重要 的作用。整個C結構域的替代引起對IGF-1受體的親和力減少30倍。 因此，預期向IGF-1的N末端添加肝素結合結構域不幹擾與IGF-1 C 結構域的相互作用。
細胞外基質和細胞表面都富含蛋白聚糖，它們可用作蛋白聚糖結 合生長因子的l&庫(reservoir )。經典實例是成纖維細胞生長因子-2 (FGF-2)系統，其中蛋白聚糖受體的低親和力、高容量庫用作用於其高 親和力受體的FGF-2的貯庫。我們的實驗顯示HB-IGF-1在一些情況下 可以以相似的方式起作用，因為HB-IGF-1選擇性保留在細胞表面上。 IGF-1還可通過IGF結合蛋白(IGFBP)與細胞外基質結合；在循環中， 至少99%的IGF-1與IGFBP(IGFBP-1至6)結合。
IGF-1可促進軟骨細胞外基質的合成和抑制軟骨的降解 (Bonassar，等人，Arch. Biochem. Biophys. 379:57—63 (2000));然而，IGF-1遞送至軟骨的實際模型仍然有待發展(Schmidt,等人， Osteoarthritis Cartilage 14:403-412 (2006))。石克酸肝素蛋白聚 糖主要存在於(特別地以基底膜蛋白多糖(perlecan)和多配體聚糖 -2 (syndecan-2)上的鏈的形式)軟骨的細胞外周基質中，並且已知 其結合其他配體例如FGF-2。我們的實驗表明HB-IGF-1蛋白可結合基 質和增加至軟骨細胞的局部、長期生物利用度，從而促進軟骨修復。
除了軟骨以外，HB-IGF-1具有用於其他組織的潛能。例如，IGF-l 誘導PC12細胞和皮質脊髓運動神經元的軸突向外生長，從而IGF-1 可有益於運動神經元退行性疾病。在皮膚創傷癒合中，IGF-1也是有 效的，因為IGF-1刺激膠原合成和刺激成纖維細胞和角質形成細胞的 有絲分裂。HB-IGF-1結合細胞表面的能力可增強細胞療法和其他再生 策略。
本文中引述的所有參考文獻全部通過引用合併入本文。現已完全 描述了本發明，本領域技術人員應當理解，可在廣泛和等同的條件、 參數等的範圍內實施本發明而不影響本發明或其任何實施方案的精神 或範圍。
權利要求
1. 具有式B-(J)n-(Z)q或(Z)q-(J)n-B的化合物，其中B是促進心肌細胞的生長和/或存活的肽；J是蛋白質形成性胺基酸或連接體；Z是肝素結合肽；n是從0至10的整數；和q是從1至5的整數。
2. 權利要求1的化合物，其中所述化合物是融合蛋白，其中J 是蛋白質形成性胺基酸，並且B是胰島素衍生生長因子-1 (IGF-1)或血 小板源性生長因子(PDGF)。
3. 權利要求2的融合蛋白，其中Z選自 KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQIDNO:3);RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQ ID NO:4);PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQ ID NO:5);KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQIDNO:6);KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ DO NO:7);CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQIDNO:8);YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ E) NO:9);AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ IDNO:10);LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO:l 1);PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ ID NO:13);MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);PPTnWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15);KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16);KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17);GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18);HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:21)。
4. 權利要求1至3中任一項的融合蛋白，其中n-0。
5. 權利要求1至4中任一項的融合蛋白，其中q= 1。
6. 包含編碼權利要求2至5中任一項的融合蛋白的核苷酸序列 的DM分子。
7. 治療具有損傷的心臟組織的患者的方法，該方法包括a) 將心肌細胞與權利要求1的化合物在足以允許所述化合物結合 所述心肌細胞的條件下 一 起溫育 一 段時間；b) 將步驟a)的經溫育的心肌細胞注射或植入所述患者的心臟組織。
8. 權利要求7的方法，其中所述化合物是融合蛋白，其中J是 蛋白質形成性胺基酸，並且B是胰島素衍生生長因子-l (IGF-1)或血小 板源性生長因子(PDGF)。
9. 權利要求8的方法，其中所述融合蛋白中的Z選自 KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQIDNO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQ ID NO:4); PYVVLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQIDNO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQEDNO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQIDNO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQ ID NO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ ID NO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ ID NO:IO); LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO: 11);PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ ID NO: 13); MGKMHKTCYN (SEQ IDNO:14); PPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:21)。
10. 權利要求9的方法，其中在所述融合蛋白中n=0。
11. 權利要求9或權利要求10的方法，其中在所述融合蛋白中q=l。
12. 權利要求7的方法，其中所述心肌細胞來源於胚胎幹細胞。
13. 權利要求7的方法，其中所述心臟組織損傷是心肌梗塞的結果。
14. 治療患者以修復損傷的軟骨的方法，該方法包括a) 將軟骨細胞與權利要求1的化合物在足以允許所述化合物結 合所述軟骨細胞的條件下一起溫育一段時間；和b) 在軟骨損傷部位注射或植入步驟a)的經溫育的軟骨細胞。
15. 權利要求14的方法，其中所述化合物是融合蛋白，其中J 是蛋白質形成性胺基酸，並且B是胰島素衍生生長因子-1 (IGF-l)或血 小板源性生長因子(PDGF)。
16. 權利要求15的方法，其中所述融合蛋白中的Z選自KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQ ID NO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQIDNO:4); PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQ ID NO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQIDNO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ ID NO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQIDNO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ ID NO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ ID NO:10); LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO:l 1); PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ IDNO:13); MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);PPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO:15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGpRGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:2"。
17. 權利要求16的方法，其中在所述融合蛋白中n=0。
18. 權利要求16或17的方法，其中在所述融合蛋白中q=l。
19. 治療患者以修復損傷的神經組織的方法，該方法包括a) 將神經元與權利要求1的化合物在足以允許所述化合物結合 所述神經元的條件下一起溫育一段時間；和b) 在神經組織損傷部位注射或植入步驟a)的經溫育的神經元。
20. 權利要求19的方法，其中所述化合物是融合蛋白，其中J 是蛋白質形成性胺基酸，並且B是胰島素衍生生長因子-1 (IGF-l)或 血小板源性生長因子(PDGF)。
21. 權利要求20的方法，其中所述融合蛋白中的Z選自KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQIDNO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQIDNO:4); PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQIDNO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQIDNO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKJIKKLLES (SEQ ID NO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQ ID NO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ IDNO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ IDNO:10); LRKLRKRIXRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO: 11); PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ IDNO:13); MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);PPTHWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SE。 ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:2"。
22. 權利要求21的方法，其中在所述融合蛋白中n=0。
23. 權利要求21或22的方法，其中在所述融合蛋白中q=l。
24. 權利要求19的方法，其中所述損傷的神經組織是神經退行 性疾病、中風或創傷的結果。
25. 權利要求19的方法，其中所述損傷的神經組織是ALS的結果。
26. 權利要求19的方法，其中所述神經元是皮質脊髓運動神經元。
全文摘要
本發明涉及其中肝素結合肽融合至促進細胞生長和/或存活的生長因子的蛋白質。將所形成的化合物與細胞表面結合，所述細胞之後被施用至損傷的組織。生長因子由此保留在施用部位，在該部位中其促進修復。
文檔編號A61K38/00GK101547704SQ200780044876
公開日2009年9月30日 申請日期2007年11月8日 優先權日2006年11月13日
發明者R·李 申請人:布裡格海姆婦女醫院公司