環境脅迫效應啟動子的製作方法

2023-05-22 11:19:36 2

專利名稱：環境脅迫效應啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種環境脅迫反應啟動子。
EST(已表達序列標記)方案也對發現表達基因有很大貢獻(Hofte，H.等，(1993)植物雜誌4，1051-1061；Newman，T.等，(1994)植物生理106，1241-1255；Cooke，R.等(1996)植物雜誌9，101-124，Asamizu，E.等，(2000)DNA研究7，175-180)。例如，dbEST(國家生物技術情報中心(NCBI)的EST資料庫)包括了部分cDNA序列，其中描述了超過一半(大約28,000個基因)的所有基因補體(這是從完整測序的擬南芥染色體2所含基因估計的(Lin，X.等，(1999)自然402，761-768))。
近年來，微陣列(DNA晶片)技術已經成為一種分析基因組規模的基因表達的有用工具(Schena，M.等，(1995)科學270，467-470；Eisen，M.B.和Brown，P.O.(1999)酶學方法303，179-205)。在這種基於DNA晶片的技術中，將cDNA序列以大於1,000個基因/cm2的密度排列在一個載玻片上。為了直接和大規模地比較分析基因表達，同時將如此排列的cDNA序列與雙色螢光標記的不同細胞或組織型的RNA樣品的DNA探針對雜交。首先通過分析根和芽中的不同表達的48個擬南芥屬基因，證明此技術(Schena，M.等，(1995)科學270，467-470)。另外，微陣列用於研究隨機選自於人cDNA文庫的1,000個克隆，此文庫用於鑑定脅迫於熱休克和蛋白激酶C活化的新基因(Schena，M.等，(1996)美國國家科學院院刊93，10614-10619)。
在另一項研究中，在各種誘導條件下通過此基於DNA晶片的方法，對與炎症疾病相關的基因的表達分布進行分析(Heller，R.A.等，(1997)美國國家科學院院刊94，2150-2155)。而且，通過使用微陣列也已經分析了大於6,000個編碼序列的酵母基因組的動態表達(DeRisi，J.L.等，(1997)科學278，680-686；Wodicka，L.等，(1997)自然生物技術15，1359-1367)。
但是，在植物科學中，關於微陣列的分析僅有少量報告出版(Schena，M.等，(1995)科學270，467-470；Ruan，Y.等(1998)植物雜誌15，821-833；Aharoni.A.等，(2000)植物細胞12，647-661；Reymond，P.等(2000)植物細胞12，707-719)。
環境脅迫例如乾旱、高鹽和低溫對植物生長的影響很大。在這些脅迫中，乾旱或水缺乏是對植物生長和農作物生產最嚴重的限制因素。乾旱脅迫誘導植物中多種生物化學和生理反應。為了在脅追條件下生存，植物必需對這些脅迫作出反應和適應。近來，在轉錄水平描述了對乾旱作出反應的大量基因(Bohnert，H.J.等，(1995)植物細胞7，1099-1111.；Ingram，J.，和Bartels，D.(1996)植物分子生物47，377-403.；Bray，E.A.(1997)植物科學趨勢2，48-54.；Sbinozaki.K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)植物生理115，327-334.；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1999).「對乾旱脅迫的分子反應」、「高等植物對冷、乾旱、熱和鹽脅迫的分子反應」由Shinozaki.，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.R.G.Landes公司；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shiozaki，K.編輯(2000)植物生理現代觀點3，217-223)。
通過基因轉移，脅迫可誘導的基因已經用於提高植物的脅迫耐受性(Holmberg，N.，和Bulow，L.(1998)植物科學趨勢3，61-66.；Bajaj.S.等(1999)分子育種5，493-503)。分析脅迫可誘導基因不僅對於理解高等植物脅迫耐受性和反應的分子機理是重要的，而且對於通過基因處理提高農作物的脅迫耐受性也是重要的。
DRE/CRT(脫水反應元件/C-重複序列)已經被確定作為一種以不依賴ABA的方式在乾旱、高鹽和冷脅迫反應基因表達中的重要順式作用元件(ABA是指脫落酸，它是一種植物激素並且充當一種種子休眠和環境脅迫的信號傳遞因子)(Yamaguchi-Shinozaki，K.，和Shiozaki，K.(1994)植物細胞6，251-264.；Thomashow，M.F.等，(1999)植物分子生物，50，571-599.；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000)植物生理的現代觀點3，217-223)。涉及DRE/CRT-反應基因表達的轉錄因子(DREB/CBF)已經被克隆(Stockinger.E.J.等，(1997)美國國家科學院院刊94，1035-1040.；Liu，Q，等，(1998)植物細胞10，1391-1406.；Shiwari，Z.K.等，(1998)生物化學與生物物理研究通訊250，161-170.；Gilmour，S.J.等，(1998)植物雜誌16，433-443)。DREB1/CBFs被認為在冷反應基因表達中起作用，而DREB2s涉及乾旱反應基因表達。在轉基因的擬南芥屬植物中觀察到對嚴寒脅迫的強耐受性，此植物在一種花椰菜花葉病病毒(CaMV)35S啟動子控制下，超量表達CBF1(DREB1B)cDNA(Jaglo-Ottosen，K.R.等，(1998)科學280，104-106)。
本發明人曾報導在轉基因植物中，在一種CaMV35S啟動子或一種脅迫誘導的rd29A啟動子的控制下，DREB1A(CBF3)cDNA分子的超量表達，提高了脅迫誘導的DREB1A靶基因的強組成型表達並且提高了對嚴寒、乾旱和鹽脅迫的耐受性(Liu，Q.等，(1998)植物細胞10，1391-1406.；Kasuga，M.等，(1999)自然生物技術，17，287-291)。而且，本發明人也已經鑑定了六種DREB1A靶基因例如rd29A/lti78/cor78，kin1，kin 2/cor6.6，cor15a，rd17/cor47和erd10(Kasuga，M.等，(1999)自然生物技術17，287-291)。但是，它沒有充分闡明DREB1A cDNA分子在轉基因植物中的超量表達如何提高了對嚴寒、乾旱和鹽的脅迫耐受性。為了研究乾旱和嚴寒耐受性的分子機理，儘可能多地鑑定和分析由DREB1A控制的基因是重要的。
通過直接對上述對象的廣泛研究，本發明人已經成功地鑑定了一種新的DREB1A靶基因並且通過使用cDNA微陣列分析成功地分離出它的一個啟動子區域，因此完成了本發明。
也就是說，本發明是一種環境脅迫反應啟動子，它含有下列(a)、(b)or(c)的DNA(a)由選自序列號1至18的任意核苷酸序列組成的DNA；(b)由含有相對於選自序列號1至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成的並具有充當環境脅迫反應啟動子功能的DNA；以及(c)在嚴格條件下與由選自序列號1至18的任意核苷酸序列組成的DNA雜交，並且具有充當環境脅迫反應啟動子功能的DNA。
環境脅迫至少選自冷脅迫、乾旱脅迫、鹽脅迫和高光脅迫。
而且，本發明是一種包含上述啟動子的表達載體，或是一種還包含一種所需基因的表達載體。
再者，本發明是一種含有上述表達載體的轉化體。
更進一步，本發明是一種含有上述表達載體的轉基因植物(例如一種植物體、植物器官、植物組織或植物培養細胞)。
再者，本發明是一種生成一種抗脅迫植物的方法，它包括培養或栽培上述轉基因植物。
附圖2是一種顯示乾旱-或冷-可誘導的基因和DREB1A靶基因鑑定策略的圖。
附圖3是顯示新DREB1A靶基因和一種DREB1A基因在cDNA微陣列和RNA印跡分析方面比較的照片。
附圖4是一種顯示根據RNA凝膠印跡和微陣列分析將已鑑定的乾旱-或冷-可誘導的基因分為四組的結果的圖。
附圖5顯示了冷處理時間和FL3-5A3表達率之間的關係。
附圖6顯示了脫水處理時間和FL3-5A3表達率之間的關係。
附圖7顯示了高鹽處理時間和FL3-5A3表達率之間的關係。
附圖8顯示了冷處理時間和FL5-2H15表達率之間的關係。
附圖9顯示了脫水處理時間和FL5-2H15表達率之間的關係。
附


圖10顯示了高鹽處理時間和FL5-2H15表達率之間的關係。
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圖11顯示了脫水處理時間和FL5-3M24表達率之間的關係。
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圖12顯示了高鹽處理時間和FL5-3M24表達率之間的關係。
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圖13顯示了冷處理時間和FL5-90表達率之間的關係。
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圖14顯示了冷處理時間和FL5-2122表達率之間的關係。
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圖15顯示了脫水處理時間和FL5-2122表達率之間的關係。
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圖16顯示了高鹽處理時間和FL5-2122表達率之間的關係。
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圖17顯示了脫水處理時間和FL6-55表達率之間的關係。
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圖18顯示了高鹽處理時間和FL6-55表達率之間的關係。
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圖19顯示了脫水處理時間和FL1-159表達率之間的關係。
附圖20顯示了脫水處理時間和FL5-2D23表達率之間的關係。
附圖21顯示了高鹽處理時間和FL5-2D23表達率之間的關係。
附圖22顯示了脫水處理時間和FL05-08-P24表達率之間的關係。
附圖23顯示了脫水處理時間和FL05-09-G08表達率之間的關係。
附圖24顯示了脫水處理時間和FL05-09-P10表達率之間的關係。
附圖25顯示了ABA處理時間和FL05-09-P10表達率之間的關係。
附圖26顯示了高鹽處理時間和FL05-10-N02表達率之間的關係。
附圖27顯示了脫水處理時間和FL05-18-I12F表達率之間的關係。
附圖28顯示了高鹽處理時間和FL05-18-I12表達率之間的關係。
附圖29顯示了ABA處理時間和FL05-18-I12表達率之間的關係。
附圖30顯示了脫水處理時間和FL05-21-F13表達率之間的關係。
附圖31顯示了冷處理時間和FL05-21-F13表達率之間的關係。
附圖32顯示了脫水處理時間和FL06-10-C16表達率之間的關係。
附圖33顯示了高鹽處理時間和FL06-10-C16表達率之間的關係。
附圖34顯示了ABA處理時間和FL06-10-C16表達率之間的關係。
附圖35顯示了脫水處理時間和FL06-15-P15表達率之間的關係。
附圖36顯示了高鹽處理時間和FL06-15-P15表達率之間的關係。
附圖37顯示了ABA處理時間和FL06-15-P15表達率之間的關係。
附圖38顯示了脫水處理時間和FL08-10-F21表達率之間的關係。
附圖39顯示了高鹽處理時間和FL09-11-P10表達率之間的關係。
使用生物素醯化的CAP捕獲器(trapper)方法(Carninci.P.等(1996)Genomics，37，327-336)本發明人構建了在不同條件下擬南芥屬植物例如經乾旱處理和冷處理的植物等的全長cDNA文庫(Seki.M.等，(1998)植物雜誌15，707-720)。使用含有脅迫誘導基因的大約1,300全長cDNA分子和含有脅迫誘導基因的大約7,000全長cDNA分子，本發明人對每種情況製備了一種擬南芥屬全長cDNA微陣列。除這些乾旱-和冷-可誘導的全長cDNA分子外，本發明人還使用一種DREB1A靶基因，一種用於控制脅迫反應基因表達的轉錄調節基因，製備了另一種cDNA微陣列。此後，監測在乾旱和冷脅迫下基因的表達方式，以詳盡地分析脅迫反應的基因。作為結果，從含有大約1,300個全長cDNA分子的全長cDNA微陣列中分離出新的環境脅迫反應基因，即44個乾旱誘導基因和19個冷誘導基因。44個乾旱誘導基因中的30個基因和19個冷誘導基因中的10個基因，是新的脅迫誘導基因。而且，發現12個脅迫誘導的基因是DREB1A靶基因，這些12個中的6個是新基因。再者，作為此分析結果，從含有大約7,000全長cDNA分子的cDNA微陣列中，分離出301個乾旱誘導基因、54個冷誘導基因和211個高鹽誘導基因。
此後，從這些環境脅迫反應基因中成功地分離出啟動子區域。
如上所述，一種全長cDNA微陣列是分析擬南芥乾旱和冷脅迫誘導基因的表達方式和分析與脅迫相關的轉錄調節基因的靶基因的有用工具。1.分離啟動子本發明的啟動子是一種存在於基因上遊的順式元件，該基因編碼一種由環境脅迫例如冷、乾旱和高鹽脅迫表達的脅迫反應蛋白質，而且此順式元件具有結合一種轉錄因子以激活存在於下遊基因轉錄的功能。這樣的順式元件的實例包括一種乾旱脅迫反應元件(DRE；脫水反應元件)、一種脫落酸反應元件(ABRE)，和一種冷脅迫反應元件等。編碼結合這些元件的蛋白質的基因實例包括DRE結合蛋白1A基因(也稱作DREB1A基因)、DRE結合蛋白1C基因(也稱作DREB1C基因)、DRE結合蛋白2A基因(也稱作DREB2A基因)和DRE結合蛋白2B基因(也稱作DREB2B基因)等。
為了分離本發明的啟動子，首先，使用一種微陣列分離出脅迫反應基因。為製備一種微陣列，總共可以使用大約1,300cDNA分子，是從擬南芥屬全長cDNA文庫中分離出的基因、RD(對脫水發生反應的)基因、ERD(對脫水發生早期反應的)基因、kin1基因、kin2基因，cor15a基因、作為內部標準的α-微管蛋白基因，以及作為陰性對照的小鼠乙醯膽鹼菸鹼受體的ε亞單位(nAChRE)基因和小鼠糖皮質激素受體的同源基因。
作為一種用於分離本發明啟動子的微陣列，可以使用總共大約7,000cDNA分子，是從擬南芥屬全長cDNA文庫中分離出的基因、RD(對脫水發生反應的)基因、ERD(對脫水發生早期反應的)基因和從λ控制模板DNA片段(TX803，TakaraShuzo)中獲得的作為內部標準的PCR擴增片段，以及作為陰性對照的小鼠乙醯膽鹼菸鹼受體的ε亞單位(nAChRE)基因和小鼠糖皮質激素受體的同源基因。
用一種DNA測序儀(ABI PRISM 3700，PE Applied Biosystems.CA，USA)通過序列分析對一種用質粒製備裝置(Kurabo)提取的質粒DNA進行測序。根據GenBank/EMBL資料庫，用BLAST程序對所獲得序列進行同源檢測。
聚腺苷酸選擇後，進行逆轉錄以合成雙鏈的DNA分子，並將一個cDNA分子插入一個載體中。
插入一種用於製備cDNA文庫的載體中的cDNA分子，使用在cDNA分子的兩邊與載體的序列互補的引物，通過PCR擴增。這樣的載體的實例包括λZAPII和λPS等。
按照通常的方法，並且此方法沒有特殊的限制，可以製備一種微陣列，例如，使用一種基因吸頭微陣列壓印機器，GTMASS SYSTEM(日本雷射和電子實驗室)，從一個微量滴定板上加載上述所得的PCR產物，並以規定的間隔，點滴在一個微載玻片上。然後，為了防止非特異信號的表達，將此玻片浸入一種封閉溶液。
植物原料的實例包括通過破壞特異性基因所獲得的植株和野生型植物，並且可以使用一種其中導入DREB1A的cDNA轉基因植物。植物品種的實例包括擬南芥、菸草和水稻等，而且優選擬南芥。
可以按照一種已知方法(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)植物細胞6，251-264)，進行乾旱-和冷-脅迫處理。
完成脅迫處理後，將植物體(野生型植物和DREB1A過量表達轉化體)作為樣品，並用液氮將其進行深低溫保藏。野生型植物和DREB1A過量表達的轉化體用於一個實驗以鑑定DREB1A靶基因。按照一種已知方法或使用一種試劑盒，將mRNA從植物體中分離出並進行純化。
在用於標記的Cy3dUTP或Cy5dUTP(Amersham Phar macia)存在下，對每一種mRNA樣品進行逆轉錄，然後用於雜交。
雜交後，用一種掃描雷射顯微鏡對此微陣列進行掃描。作為一種分析微陣列數據的程序，可以使用Imagene Ver 2.0(BioDiscovery)和QuantArray(GSI Lumonies)等。
掃描後，通過製備一種含有此基因的質粒，將有關基因分離出。
通過分析上述分離出的基因的核苷酸序列，然後使用一種基於基因組情報資料庫(GenBank/EMBL，ABRC)的基因分析程序，進行啟動子區域的檢測。將分離出的基因分為對乾旱和冷脅迫均具有誘導率的一種，對乾旱脅迫特異性誘導率的一種，和對冷脅迫特異性誘導率的一種(附圖4)。按照一種基因分析程序，從上述基因中鑑定出18種基因(FL3-5A3，FL5-2H15，FL5-3M24，FL5-90，FL5-2I22，FL6-55，FL1-159，FL5-2D23，FL05-08P-24，FL05-09-G08，FL05-09-P10，FL05-10-N02，FL05-18-I12，FL05-21-F13，FL06-10-C16，FL06-15-P15，FL08-10-E21和FL09-11-P10)。這些基因的啟動子區域分別顯示於序列號1至18中。
只要本發明的啟動子充當一種環境脅迫反應啟動子，它可以是一種具有如此核苷酸序列的啟動子，此核苷酸序列包括相對於選自序列號1至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一個或多個核苷酸，優選一個或幾個核苷酸(例如1至10個核苷酸，優選1至5個核苷酸)的核苷酸序列。而且，本發明的啟動子還包括在嚴格條件下與含有任意選自序列號1至18的核苷酸序列的DNA雜交並進一步充當一種環境脅迫反應啟動子的DNA。
一旦確定了本發明的啟動子的核苷酸序列，就可以通過化學合成、使用一種克隆的探針作為模板的PCR、或雜交，用作探針，具有核苷酸序列的DNA片段，獲得啟動子本身。而且，具有與未突變的啟動子具有相等功能的本發明啟動子的突變體，也可以通過定點誘變等合成。
為了將突變導入啟動子序列，可以使用已知方法例如Kunkel方法和Gapped雙鏈體方法，或一種等效方法。例如使用一種用於導入突變的試劑盒(例如Mutant-K(Takara)和Mutant-G(Takara))，通過定點誘變完成突變的導入，或使用LA PCR體外誘變系列試劑盒(Takara)完成突變的導入。
此處使用的「作為一種環境脅迫反應啟動子功能」一詞，其含義是當啟動子暴露於特殊環境脅迫條件下時，結合RNA聚合酶至一種啟動子使之引發轉錄的功能。
「環境脅迫」一詞通常用於指一種非生物的脅迫例如乾旱脅迫、冷脅迫、高鹽脅迫和高光脅迫等。此處所用的術語「乾旱」是指一種水缺乏的狀態，此處所用的「冷」一詞是指被暴露於低於每種生物品種最適宜的生存溫度下的狀態，(例如擬南芥，連續暴露於-20至+21℃下1小時至幾周)。此處所用的「高鹽」一詞是指在用濃度為50mM至600mM的NaCl連續處理0.5小時至幾周後的狀態。此處所用的「高光脅迫」一詞是指將大於其光合能力的強光用於一種植物的狀態，例如使用了大於5,000至10,000 lx的強光。關於這些環境脅迫，可以接受一種脅迫或幾種脅迫。
本發明的植物啟動子包括一種啟動子，它在序列號1至18的任意核苷酸序列的3′-末端增加了一個提高其翻譯效力的核苷酸序列，或一種在其5′-末端缺失的同時保留了啟動子活性的啟動子。
而且，本發明的啟動子包括在嚴格條件下與由任何選自序列號1至18的核苷酸序列組成的DNA雜交並具有充當一種環境脅迫反應啟動子功能的DNA。此處所用的「嚴格條件」一詞是指鈉的濃度為25至500mM，優選25至300mM，並且溫度為42℃至68℃，優選42℃至65℃。特別優選的條件是5×SSC(83mMNaCl，83mM檸檬酸鈉)，並且溫度為42℃。2.表達載體的構建本發明的表達載體可以通過將本發明的啟動子連接(插入)至一種適宜的載體獲得。只要本發明的啟動子插入其中的載體能夠在宿主中複製，不需要特別的限制，載體的實例包括一種質粒、一種穿梭載體和一種輔助質粒等。
質粒DNA的實例包括來源於大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)(例如pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19和pBluescript等)的質粒，以及來源於枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)(例如pUB110和pTP5等)的質粒，以及來源於酵母(例如YEp13和YCp50等)的質粒，而且噬菌體DNA的實例包括λ噬菌體(例如Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBLA、λgt10、λgt11和λZAP等)。再者，動物病毒載體例如逆轉錄病毒和痘苗病毒，以及昆蟲病毒載體例如杆狀病毒也可以使用。
為了將本發明的啟動子插入一種載體中，使用一種方法，其中首先，用適宜的限制酶將純化的DNA裂解，然後，將所獲得的DNA片段插入適宜載體DNA的限制酶位點或一個多克隆位點以連接於載體上。
在本發明中，為了表達一種所需基因，可以將所需基因進一步插入上述表達載體中。涉及插入所需基因的技術與涉及將啟動子插入載體的方法相同。對所需基因沒有特別限制，基因的實例包括顯示於表2中的基因和不同於那些的已知基因等。
在本發明的啟動子與一種連接於其3′-末端的報導基因(例如廣泛用於植物科學的GUS基因)一同使用的情況下，通過檢測GUS的活性可以容易地確定此啟動子的強度。作為一種報導基因，不僅可以使用一種GUS基因，而且還可以使用螢光素酶和一種綠色螢光蛋白質。
因此，在本發明中可以使用各種類型的載體。而且，可以通過將一種有關的所需基因以有義或反義的方向連接於本發明的啟動子來製備一種產物，並然後將這樣的產物插入一個被稱作二分載體的載體，例如pBI1O1(Clonetech)中。3.轉化體的製備通過將本發明的表達載體導入一個宿主中而獲得本發明的轉化體。此處的宿主沒有特殊的限制，只要它可以表達有關的啟動子或基因，優選一種植物。在宿主是一種植物的情況下，一種轉化體植物(一種轉基因植物)可以如下製備。
在本發明中轉化的植物是指任何整株植物、植物器官(例如葉子、花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質部、脈管素等)以及植物細胞。用於轉化的植物的實例包括屬於芸苔科、禾本科、茄科和豆科等(參照下面)的植物，但不限制於此。芸苔科擬南芥(Arabidopsis thaliana)茄科菸草(Nicotiana tabacum)禾本科玉蜀黍(Zea mays)、稻(Oryza sativa)豆科大豆(Glycine max)可以用常用轉化方法例如電穿孔、土壤桿菌屬方法、顆粒槍方法、PEG等，將上述重組載體導入一種植物中。
例如，在使用電穿孔的情況下，使用一種裝有一種脈衝控制器的電穿孔裝置，在500至1,600V電壓，25至1,000μF和20至30毫秒的條件下，處理一種載體，並將一種基因導入一種宿主中。
在使用顆粒槍的情況下，在製備一切片後，可以使用一種植物體、植物器官或植物組織，或者製備一種原生質體。可以用一種基因導入裝置(例如PDS-1OOO/He，Bio-Rad.等)，處理如此製備的樣品。處理的條件隨植物或樣品變化，但是一般所用的處理條件是壓力為大約1,000至1,800psi，距離為5至6cm。
通過使用一種植物病毒作為載體，可以將有關基因導入一種植物中。可得到的植物病毒的實例包括花椰菜花葉病病毒。那就是，首先，將病毒基因組插入來源於大腸埃希氏桿菌的載體中以製備一種重組體。然後，將此有關基因插入病毒基因組中。用限制酶將如此修飾的病毒基因組從重組體中切下，並接種至一種植物宿主中，以便將有關基因導入其中。
當屬於土壤桿菌屬的細菌轉染入一種植物中時，細菌將其質粒DNA的一部分導入植物基因組中。在涉及使用土壤桿菌屬的Ti質粒的方法中，利用如此的特徵，將一種有關基因導入一種植物宿主中。在屬於土壤桿菌屬、根癌土壤桿菌(Agrolacterium tumefacieas)的細菌中，轉染至一種植物，並在那裡形成一種被稱作冠癭的腫瘤，而髮根病土壤桿菌(Agrobactorium rhizogenes)轉染至一種植物以形成毛根。這些現象源自一種原因，由此，將一存在於每種細菌中的定位於一種被稱作Ti質粒或Ri質粒的質粒上的稱作T-DNA區域的區域(一種轉移DNA區域)，轉移至一種植物中，並在轉染的時候插入至植物基因組中。
當土壤桿菌被轉染入一種植物宿主時，通過將欲結合入一種植物基因組的DNA插入Ti或Ri質粒的T-DNA區域，能把有關DNA結合入一種植物基因組中。
作為轉化結果所獲得的腫瘤組織、芽和毛根可以直接用於細胞培養、組織培養或器官培養，並且按照以前的已知植物組織培養方法，可以通過給予一種適宜濃度的植物激素(例如茁長素、細胞激動素、赤黴素、脫落酸、乙烯、brassinoride等)，使一種植物體發生再生。
本發明的載體不僅能被導入上述植物宿主中，而且能被導入屬於埃希氏桿菌屬例如大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌屬例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和假單孢菌屬例如惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)的細菌；酵母例如啤酒糖酵母(Saccharomgces cerevisiae)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)；動物細胞例如COS細胞和CHO細胞；以及昆蟲細胞例如Sf9細胞中，以便獲得一種轉化體。在一種細菌例如大腸埃希氏桿菌或酵母用作宿主的情況下，優選本發明的重組載體在細菌中能夠自我複製，並且在同時，還由本發明的啟動子、一種核糖體結合序列、一種有關基因和轉錄終止序列組成。而且，它還可以含有用於控制一種啟動子的基因。
用於將一種重組載體導入細菌中的方法，只要是一種將DNA導入細菌的方法，沒有特殊的限制。例如，可以使用一種涉及使用鈣離子的方法和電穿孔方法。
在酵母用作宿主的情況下，可以使用啤酒糖酵母和粟酒裂殖糖酵母等。將一種重組載體導入酵母的方法沒有特殊限制，只要是一種將DNA導入酵母的方法，這樣方法的實例包括電穿孔、原生質球方法、磷酸鋰方法等。
在動物細胞用作宿主的情況下，可以使用猴COS-7細胞、非州綠猴腎細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、小鼠L細胞等。將重組載體導入一種動物細胞的方法的實例包括電穿孔、磷酸鈣方法、脂轉染方法等。
在昆蟲細胞用作宿主的情況下，可以使用Sf9細胞及其類似細胞。將重組載體導入一種昆蟲細胞的方法的實例包括磷酸鈣方法、脂轉染方法、電穿孔等。
關於確認一個基因是否被插入宿主中，可以通過例如PCR、Southern雜交、Northern雜交等方法完成。例如，從一種轉化體中製備DNA，並設計與PCR一同使用的DNA特異性引物。在用於製備上述質粒的相同條件下進行PCR。然後，將所獲得的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺電泳或毛細管電泳，以便用溴化鋰或一種SYBR Green溶液等將產物染色。通過檢測作為信號帶的產品，證實擴增產物被轉化。或者，擴增的產物也可以通過PCR、使用被螢光染料染色的引物、或者諸如上述的方法檢測。而且，還可以採用下列方法，其中擴增的產物與一種例如微量培養板的固相結合，並且通過螢光或酶反應等證實。4.植物的生成在本發明中，一種轉化的植物體可以從上述轉化的植物細胞等再生。一種適合的再生方法是如下方法其中轉化的細胞被轉移至培養基中，並在具有不同類型激素和濃度的培養基中培養以促進珠心生胚，並由此獲得一整株植物體。適用的培養基的例子包括LS培養基和MS培養基等。
本發明「生產一種植物體的方法」包括如下方法將一種插有上述植物啟動子的植物表達載體導入一種宿主細胞中，以獲得一種轉化的植物細胞；從轉化的植物細胞再生轉化的植物體；從所得的轉化植物體獲得植物種子；並從植物種子產生植物體。
例如，從一種生根的培養基中收集一種轉化的植物體，並將其轉移至一個有含水的土壤的盆中，以從一種轉化的植物體中獲得一種植物種子。然後，轉化的植物體在恆溫下生長形成花朵，由此最終獲得種子。例如，在一種轉化的植物體中所形成的種子成熟後，分離出種子並植入含有水的土壤中，然後在照明恆溫下生長，以從種子生產植物體。如此育種的植物成為一種與導入啟動子的脅迫反應性相對應的抗環境脅迫植物。
本發明進一步描述於下列實施例中。這些實施例並非用於限制本發明。
而且，為了製備一種微陣列，總共使用大約7,000cDNA分子，它們是從擬南芥屬全長cDNA文庫中分離出的基因、RD(對脫水發生反應的)基因、ERD(對脫水發生早期反應的)基因和從λ控制模板DNA片段(TX803，Takara Shuzo)中獲得的作為內部標準的PCR擴增片段(下文稱之為PCR片段)，以及作為陰性對照的小鼠乙醯膽鹼菸鹼受體的epsilon亞單位(nAChRE)基因和小鼠糖皮質激素受體的同源基因。陽性對照乾旱誘導基因(對脫水的反應性基因rd，和對脫水的早期反應性基因erd)內部標準PCR片段陰性對照為了分析非特異性雜交，使用乙醯膽鹼菸鹼受體ε亞單位(nAChRE)基因和小鼠糖皮質激素受體的同源基因，它們基本上與擬南芥屬資料庫中所給出的任意序列不具有同源性。(2)擬南芥屬全長cDNA微陣列根據生物素醯化的CAP捕獲器(trapper)方法，本發明人已經從在不同條件下(例如在從發芽至成熟的種子的不同生長階段，脫水處理、冷處理和未處理)的擬南芥屬植物體中構建了全長cDNA文庫。本發明人從全長cDNA文庫中獨立地分離出各大約1,300和大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子。根據已知方法(Eisen和Brown，1999)，在載玻片上排列通過PCR擴增的cDNA片段。本發明人已經製備出一種含有大約1,300個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列，和另一種含有大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列，它們包含下述基因。(3)使用cDNA微陣列分離乾旱-、冷-和高鹽-誘導基因在此實施例中，使用一種含有大約1,300個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列，分離出乾旱-、冷-誘導基因。再者，使用一種含有大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列，分離出乾旱-、冷-和高鹽-誘導基因。
混合經乾旱處理、冷處理和未處理的植物的Cy3和Cy5螢光標記的探針，並將所得的混合物與含有大約1,300個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列雜交。附
圖1顯示了cDNA微陣列的圖象。通過一對cDNA探針的雙標記，其中一個mRNA樣品用Cy3-dUTP標記而另一個mRNA樣品用Cy5-dUTP標記，使同時與在一種微陣列上的多個DNA元件雜交成為可能，並使得在兩種不同條件(即脅迫和未脅迫)下直接測定基因表達水平變得容易。使用兩種不同的雷射隧道，對在雜交的微陣列上的每種DNA元件Cy3和Cy5的發射進行掃描。此後，測定每種DNA元件的兩種螢光信號的強度率，作為一種相對值，然後，確定基因不同表達的轉換，這顯示為微陣列上的cDNA斑點。在此實施例中，使用作為一種內部對照基因的α-微管蛋白基因，此基因的表達水平在兩種不同的試驗條件下基本上保持恆定。
在含有大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列的情況下，混合每種經脫水處理的植物、經冷處理的植物、高鹽誘導基因和未經處理的植物的Cy3和Cy5螢光標記的探針，並將所獲得的混合物雜交。在此cDNA微陣列中，一種PCR片段被用作內部對照基因。
附圖2顯示在含有大約1,300個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列中的乾旱-或冷-誘導基因的鑑定方法。而且，在含有大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列的情況下，也可以按照附圖2所示的相同方法對乾旱-、冷-或高鹽-誘導基因進行鑑定。1)來源於脫水或冷處理的植物中的mRNA分子和來源於未脅迫的野生型植物的mRNA分子，均用於製備Cy3和Cy5標記的cDNA探針。混合這些cDNA探針，然後與cDNA微陣列雜交。在此實施例中，使用作為一種內部對照基因的α-微管蛋白基因，此基因的表達水平在兩種不同的試驗條件下基本上保持恆定。表達水平高於(乾旱/未脅迫或冷/未脅迫的)α-微管蛋白基因的表達水平的兩倍的基因，被確定作為一種乾旱-或冷-誘導基因(附圖2)。2)來源於一種35SDREB1A轉基因植物的mRNA分子和來源於一種未脅迫的野生型植物的mRNA分子，均用於製備Cy3和Cy5標記的cDNA探針。混合這些cDNA探針，然後與cDNA微陣列雜交。在此實施例中，使用作為一種內部以照基因的α-微管蛋白基因，此基因的表達水平在兩種不同的試驗條件下基本上保持恆定。其在35SDREB1A轉基因植物中表達水平高於未脅迫野生型植物表達水平兩倍的基因，被確定作為DREB1A靶基因(附圖2)。
來源於一種脫水-或冷-處理的植物的mRNA分子和來源於一種未脅迫的野生型植物的mRNA分子，均用於製備Cy3和Cy5標記的cDNA探針。混合這些cDNA探針，然後與cDNA微陣列雜交。為了評價微陣列分析的再現性，相同的試驗重複5次。當相同的mRNA樣品與各種類型的微陣列雜交時，觀察到了良好的相關性。表達水平高於(乾旱/未脅迫或冷/未脅迫的)α-微管蛋白基因表達水平的兩倍的基因，被確定作為一種乾旱-或冷-誘導基因(附圖2)。(4)序列分析為進基因序列的同源性檢測，用一種質粒製備裝置(NA100，Kurabo)提取一種質粒DNA，用這種質粒DNA進行序列分析。用一種DNA測序儀(ABIPRISM3700，PE Applied Biosystems，CA，USA)，通過染料終止子循環測序法測定DNA序列。基於GenBank/EMBL資料庫，用BLAST程序完成序列的同源性檢測。(5)cDNA的擴增將λZAPII(Caminci等，1996)用作製備cDNA文庫的一種載體。應用與位於cDNA.兩側的載體序列互補的引物，通過PCR方法，擴增這種插入文庫載體的cDNA。
引物的序列如下FL正向12245′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA(序列號19)FL反向12335′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA(序列號20)
將一種質粒(1至2ng)加入100μl的PCR混合物(0.25mM dNTP，0.2μM PCR引物，1XExTaq緩衝液，1.25UExTaq聚合酶(Takara Shuzo))中，充當模板。在下面的條件下進行PCR在94℃進行起始反應3分鐘，在95℃進行1分鐘、60℃進行30秒和72℃進行3分鐘的反應進行35次循環，以及在72℃進行終止反應3分鐘。用乙醇將PCR產物沉澱後，將這種沉澱物溶解至25μl的3×SSC中。進行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，以確認所得DNA的性質和PCR的擴增率。(6)cDNA微陣列的生產應用一種基因頂部微陣列標記儀，GTMASS SYSTEM(Nippon Laser Electronics Lab.)，從384-孔微量滴定板加樣0.5μl的PCR產物(100至500ng/ml)，並且將每5nl的產物點滴在6個以280μm厚度包被了聚L-賴氨酸的微載玻片上(S7444，Matsunami)。為了使點滴的DNA量相等，打上印記後，在裝有熱蒸餾水的燒杯中弄溼載玻片，然後在100℃乾燥3秒。然後將這些載玻片放在載玻片架上，並將此架放進玻璃箱中。然後將一種封閉溶液(含有15ml 1M硼酸鈉(pH8.0)、5.5g琥珀酸酐化合物(Wako))和335ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(Wako))倒入此玻璃箱中。將裝有載玻片架的玻璃箱上下反轉5遍後，再將它輕輕搖晃15分鐘。然後，將載玻片架移至裝有沸水的玻璃箱中，並將其搖晃5遍，然後將其靜置2分鐘。然後將載玻片架移至含95％乙醇的玻璃箱中，並搖晃5遍，接著將其離心(800rpm)30分鐘。(7)植物原料和RNA的分離有兩種植物體用作植物原料，一種植物體是野生型擬南芥植物體，它被種在一種瓊脂培養基(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994)上生長3周，另一種是擬南芥(哥倫比亞種)植物體，其中導入了與花椰菜花葉病病毒的35S啟動子連接的DREB1A cDNA(Kasuga等，1999)。按照Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki的方法(1994)進行乾旱處理和冷處理。即從瓊脂培養基中拔出植物體，將其放在一種濾紙上，然後在22℃和60％相對溼度的條件下完成脫水處理。通過將這種生長在22℃下的植物移至4℃的條件下進行冷處理。通過在一種含有250mM NaCl的溶液中進行水培而完成高鹽處理。
野生型植物體接受脅迫處理2或10小時後，對它們進行抽樣，然後用液氮將它們深低溫保存。野生型和DREB1A超量表達型轉化體均可用於鑑別DREB1A靶基因的試驗，所述DREB1A超量表達型轉化體是在一種不含卡那黴素的瓊脂培養基中培養的。對DREB1A超量表達型轉化體不進行脅迫處理。應用ISOGEN(日本基因，東京，日本)從植物體中分離整個RNA，然後用Oligotex-dT30 mRNA提純試劑盒(Takara，東京，日本)對mRNA進行分離和純化。(8)探針的螢光際記在Cy3dUTP或Cy5dUTP(Amersham Pharmacia)的存在下，每個mRNA樣本都進行逆轉錄。逆轉錄緩衝液(30μl)的成分如下含6μg寡(dT)18-鏈節的聚(A)+RNA 1μg10mM DTT500μM dATP、dCTP和dGTP200μM dTTP100μM Cy3dUTP或Cy5dUTP400單位SuperScriptII逆轉錄酶(Life Technologies)1X Superscript第一鏈緩衝液(Life Technologies)共30μl在42℃反應1小時後，混合兩樣本(一個樣本用Cy3標記，另一個樣本用Cy5標記)，加入15μl0.1M NaOH和1.5μl 20mM EDTA，並在70℃將此混合物處理10分鐘。然後再向基保加入15μl 0.1MHCl，然後將此樣本移至一種Micro con30微量濃縮器(Amicon)中。加入400μl TE緩衝液，接著離心，使緩衝液的量變成10至20μl，然後丟棄流出液。在向其中加入400μl TE緩衝液和20μl 1mg/ml人Cot-1 DNA(Gibco BRL)後，再次離心此混合物。通過離心收集標記的樣本，並加入幾μl的蒸餾水。將2μl的10μg/μl酵母菌tRNA、2μl的1μg/μlpd(A)12-18(Amersham Pharmacia)、3.4ml 20×SSC和0.6μl的10％SDS加入所得到的探針。然後，在100℃下，將此樣本變性1分鐘，在室溫下放置30分鐘，然後用於雜交。(9)微陣列雜交和掃描應用臺式微量離心機，將探針高速離心1分鐘。為避免產生泡沫，將此探針放在陣列的中心，在其上放一蓋玻片。在一個載玻片上滴4滴5μl 3×SSC，將箱保持在適宜的溼度下，以避免雜交中探針脫水。將載玻片放進一種雜交盒中(THC-1，BM machine)，並密封，然後在65℃處理12至16小時。從此雜交盒中取出載玻片，放在一種盒架上，並在此溶液1(2×SSC，0.1％SDS)中小心除去蓋玻片。然後搖動此架進行衝洗，並將它移至溶液2中(1×SSC)，衝洗2分鐘。然後，再將此架移至溶液3中(0.2×SSC)，留置2分鐘，然後進行離心(800rpm，1分鐘)，以進行乾燥。
應用一種掃描雷射顯微鏡(ScanArray4000；GSI Lumonics，Watertown，MA)，以每像素10μm的解析度掃描微陣列。分析這種微陣列數據的程序使用的是Imagene版本2.0(BioDiscovery)和Quant Array(GSI Lumonics)。(10)Northern分析應用全RNA進行Northern分析(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994)。將通過PCR方法從擬南芥全長cDNA文庫中分離的DNA片段用作進行Northern雜交的探針。(11)啟動子區的測定根據資料庫中擬南芥的基因組信息(GenBank/EMBL，ABRC)，用進行基因分析的BLAST程序分析啟動子區。2、結果(1)脅迫誘導基因通過Cy5-dUTR存在下的逆轉錄，由從非脅迫擬南芥植物分離的mRNA製備螢光標記cDNA。由冷處理植物(2小時)製備用Cy3-dUTP標記的第二探針。這兩種探針同時與包含大約1300個擬南芥cDNA克隆的cDNA微量陣雜交，然後產生一種假色象(附
圖1)。
紅色信號和綠色信號分別代表冷脅迫誘導的基因和抑制的基因。黃色信號代表兩種處理水平幾乎相等時所表達的基因。每個斑點的長度與每個基因表達水平的絕對值相一致。可以看到紅色信號代表一種冷誘導基因(rd29A)，而黃色信號代表一種α-微管蛋白基因(一種內部對照基因)通過cDNA微陣列分析的方法，鑑定了全部44個乾旱誘導基因(表1和2)。表1

表2通過cDNA微陣列分析鑑定的乾旱和冷-誘導基因和DREB1A靶基因

在表2中，為乾旱誘導和寒冷誘導的基因，以及DREB1A靶基因(35SDRER1A)的基因是rd29、cor15A、kin2、erd10、kin1、rd17、erd4、FL3-5A3、FL5-77、FL5-94、FL3-27和FL5-2I22。為乾旱誘導和寒冷誘導的基因，但不是DREB1A靶基因的基因是FL5-2024、FL5-1A9、FL5-3M24和FL5-3A15。特異乾旱誘導基因是rd20、FL6-55、FL5-3J4、FL2-56和FL5-2D23。特異寒冷誘導基因是DREB1A和FL5-90。這些基因分類的結果見圖4。
另外表2的＂編碼的蛋白/其它特徵＂列顯示一個基因產物的推定功能，它是通過序列同源性推測的。
「乾旱」列的「比率」是通過下面的等式獲得的(FI螢光強度)比率＝[(乾旱條件下的每個cDNA的FI)/(無脅迫條件下的每個cDNA的FI)]÷[(乾旱條件下的α-微管蛋白的FI)/(無脅迫條件下的α-微管蛋白的FI)]「寒冷」列的「比率」是通過下面的等式獲得的(FI螢光強度)比率＝[(寒冷條件下的每個cDNA的FI)/(無脅迫條件下的每個cDNA的FI)]÷[(寒冷條件下的α-微管蛋白的FI)/(無脅迫條件下的α-微管蛋白的FI)]「35SDREB1A」列的「比率」是通過下面的等式獲得的(FI螢光強度)比率＝[(35SDREB1A植物的每個cDNA的FI)/(野生型植物的每個cDNA的FI)]÷[(35SDREB1A植物的α-微管蛋白的FI)/(野生型植物的α-微管蛋白的FI)]「乾旱」列中的名詞「新或已報導」是指，當一個基因還未報導是一種乾旱誘導基因時，即顯示為「新」；當一個基因已報導是一種乾旱誘導基因時，即顯示為「已報導」。「寒冷」列中的寒冷誘導基因和「35SDREB1A」列中的DREB1A靶基因也是如此。
表2所述的基因中，14個基因(cor15A、kin1、kin2、rd17、rd19A、rd20、rd22、rd29A、erd3、erd4、erd7、erd10、erd14、AtP5CS)先前已報導是乾旱誘導基因(Bohnert，H.J.等(1995)植物細胞7，1099-1111；Ingram，J.和Bartels，D.(1996)植物分子生物47，377-403；Bray，E.A.(1997)植物科學趨勢2，48-54；Shinozaki.K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)植物生理115，327-334；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1999)對於旱脅迫反應的分子高級植物對寒冷、乾旱、熱和鹽脅迫反應的分子，Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.主編，R.G.LandesCompany；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000)植物生物學最新觀點、(Curr.Opin.Plant Biol.)3，217-223；Taji，T.等，(1999)植物細胞生理40，119-123；Takahashi，S.等，(2000)植物細胞生理41，898-903.)。
這些結果顯示本發明人的cDNA微陣列系統有益地具有發現脅迫誘導基因的功能。在其餘的30個新乾旱誘導基因中，所發現的cDNA分子(FL-5A3、FL6-55、FL5-1N11、FL5-2024、FL5-2H15和FL1-159)表現出與推定的冷順應蛋白(編號AC006438)、LEA76型1蛋白(編號X91919)、非特異性轉脂蛋白(LTP1；編號M80567)、推定的水通道蛋白(編號AC005770)、T45998EST和HVA22同系物(編號AB015098)的同一性。
另外，通過cDNA微陣列分析已經確定了全部19個冷誘導基因(表1和2)。這些基因中有9個已經報導是冷誘導基因，即rd29A、cor15a、kin1、kin2、rd17、erd10、erd7和erd4(Kiyosue等，1994；Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki，1997，1999，2000；Taji等，1999；Thomashow，1999)和DREB1A基因(Lui等，1998)。
同樣，在其餘的新冷誘導基因中，發現了cDNA分子(FL3-5A3、FL5-3A15、FL5-3P12、FL5-90、FL5-2I22和FL1-159)，它們表現出與推定的冷順應蛋白(編號AC006438)、鐵蛋白(編號X94248)、EXGT-A2(編號D63510)、β-澱粉酶(編號AJ250341)、DC1.2同系物(編號X80342)、和HVA22同系物(編號AB015098)的同一性，而且還發現了cDNA分子(FL5-1A9、FL5-95和FL5-3M24)它們表現出與結瘤素樣蛋白(編號CAA22576)、水稻乙二醛酶I(編號AB017042)和LEA蛋白同系物(SAG21；編號AF053065)的序列相似性。
而且，本發明人應用全長cDNA微陣列確定了DREB1A轉錄因子控制的脅迫誘導基因。圖2顯示了DREB1A靶基因鑑定的一種方法。由轉基因擬南芥植物(一種35SDREB1A轉基因植物)製備的mRNA(其在CaMV 35S啟動子的控制下超量表達DREB1A cDNA)和由一種野生型對照植物製備的mRNA分別用於製備Cy3標記和Cy5標記的cDNA探針。混合這些cDNA探針，然後將它們與一種cDNA微陣列進行雜交。在35SDREB1A轉基因植物中的表達水平比在野生型對照植物的表達水平高兩倍以上的基因被確定為一種DREB1A靶基因。
通過cDNA微陣列分析已經鑑定了全部12個DREB1A靶基因(表1和2)。這些基因中的6個已經報導為DREB1A靶基因，rd29A/cor78、cor15a、kin1、kin2、rd17/cor47和erd10(Kasuga等，1999)。同樣，在其餘6個新DREB1A靶基因中，發現了cDNA分子(FL3-5A3、FL5-2I22、FL5-94和FL5-77)，它們表現出與推定的冷順應蛋白(編號AC006438)、DC 1.2同系物(編號X80342)、烯醇化酶(編號X58107)和peroxiredoxin TPX1(編號AFl2l355)的序列同一性，而且發現了一種cDNA分子(FL3-27)表現出與豇豆半胱氨酸蛋白酶抑制劑(編號Z21954)和crd4cDNA(Kiyosue等，1994；Taji等，1999)的序列相似性。
將所鑑定的乾旱-誘導或冷-誘導基因分入下列3組中(圖4)1)乾旱-和冷-誘導基因2)特異性乾旱誘導基因3)特異性冷誘導基因對於下面21個基因，難以將它們分入上面的3組，所以不對它們進行這樣的分類erd3、FL3-519、FL3-3A1、FL5-1F23、FL2-1F6、FL3-5J1、FL5-1N11、FL5-2H15、FL5-2G21、FL5-2I23、FL5-1C20、FL2-1H6、FL5-2E17、FL3-3B1、FL5-3E18、FL3-2C6、FL5-1P10、FL2-5G7、FL2-1C1、FL2-5A4和FL5-3P12。
最後，將已鑑定的基因分類為20個乾旱-和冷-誘導基因、5個特異性乾旱誘導基因和2個特異性冷誘導基因。然後，乾旱-和冷-誘導基因分入下列2組1)DREB1A靶基因2)非DREB1A靶基因的基因因此，有16個乾旱-和冷-誘導基因分為12個DREB1A靶基因和4個非DREB1A靶基因的基因。(2)RNA凝膠印跡分析在cDNA凝膠印跡分析中，用最小的努力挖掘出適宜的數據是重要的。本發明人用下列方法對cDNA微陣列分析的有效性進行評價。
首先，鑑定具有高於α-微管蛋白表達率(乾旱2小時/未脅迫)2倍的表達率的80種基因。對這80種推定的乾旱誘導基因進行RNA印跡分析，其中44種被鑑定為實際的基因。來自微陣列分析的結果和來自RNA印跡分析的結果之間的差異是由下列引起的(1)基因的低表達，(2)高背景，(3)cDNA斑點上劃痕或灰塵，和(4)具有低特異活性的糟糕的cDNA探針。因而，將上述實驗數據進行標記並將其中的一半從下列分析中排除。數據處理後，基於cDNA微陣列分析最終鑑定出44個乾旱誘導基因、19個冷誘導基因和12個DREB1A靶基因。此後，進行RNA凝膠印跡分析，以證實用cDNA微陣列所獲得的結果。通過對鑑定的44個乾旱誘導基因、19個冷誘導基因和12個DREB1A靶基因的微陣列分析所獲得的表達數據結果，與通過用RNA印跡分析所獲得的結果一致。
附圖3顯示微陣列分析結果與RNA印跡分析結果在6個新DREB1A靶基因(FL3-5A3，FL3-27，FL5-2z22，FL5-94，FL5-77和erd4)方面的比較。所有6種基因均通過乾旱和冷處理誘導，並在未脅迫條件下在35SDREB1A植物中過量表達。
對來源於乾旱處理的野生型植物(脫水2或10小時(置於一張濾紙上))、冷處理的野生型植物在(4℃下冷卻2或10小時)、或未處理的35SDREB1A轉基因植物(35SDREB1A對照)的樣品，用Cy3-dUTP進行螢光標記，而對來源於未處理的野生型植物的樣品(對照)，用Cy5-dUTP進行螢光標記。這些樣品與cDNA微陣列雜交，然後通過掃描計算相對表達率，並顯示於一個附圖(附圖3)中。此附圖顯示了乾旱-和冷-處理野生型植物和35SDREB1A轉基因植物的RNA印跡分析圖像。用Genflank，EMBL和DDBJ資料庫對兩種DREB1A靶基因(FL3-5A3和FL3-27)的全長cDNA序列獨立註冊，登記號分別為AB044404和AB3044405。
同樣，用一種含有大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列，分離出301個乾旱誘導基因、54個冷誘導基因和211個高鹽脅迫誘導基因。(3)啟動子區域的鑑定作為啟動子區域鑑定的結果，獲得了8種類型的基因(FL3-5A3、FL5-2H15、FL5-3M24、FL5-90、FL5-2I22、FL6-55、FL1-159和FL5-2D23)的啟動子區，它們是在含有大約1,300個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列中獲得的。這些啟動子的序列顯示於序列號1至8中。
基因名 啟動子區域序列FL3-5A3序列號1FL5-2H15 序列號2FL5-3M24 序列號3FL5-90 序列號4
FL5-2I22 序列號5FL6-55 序列號6RL1-159序列號7FL5-2D23 序列號8作為啟動子區域鑑定的結果，獲得了10種類型的基因(PL05-08-P24、FL05-09-G08、FL05-09-P10、FL05-10-N02、FL05-18-I12、FL05-21-F13、FL06-10-C16，、FL06-15-P15、FL08-10-E21和FL09-11-P10)的啟動子區，它們是在含有大約7,000個擬南芥屬全長cDNA分子的全長cDNA微陣列中獲得的。這些啟動子的序列顯示於序列號9至18中。基因名序列號FL05-08-P24 序列號9FL05-09-G08 序列號10FL05-09-P10 序列號11FL05-10-N02 序列號12FL05-18-I12 序列號13FL05-21-F13 序列號14FL06-10-C16 序列號15FL06-15-P15 序列號16FL08-10-E21 序列號17FL09-11-P10 序列號18已知一種保守序列「PyACGTG(G or T)C」(其中，Py代表一個嘧啶鹼基，即C或T)在許多ABA-反應基因中充當一種ABA-反應性元件(ABRE)(Ingram，J.，和Bartels，D.(1996)植物分子生物47，377-403；Bray，E.A.(1997)植物科學趨勢，2，48-54；Shinozaki，K.，和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1999).對乾旱脅迫反應的分子。高等植物對冷、乾旱、熱和鹽脅迫反應的分子，Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.，編輯R.G.Landes公司)。而且，還已知由9個核苷酸組成的保守序列「TACCGACAT」組成的序列(乾旱反應元件DRE)，對rd29A在乾旱-、冷-和高鹽-脅迫條件下表達的誘導控制是必須的，但是，沒有作為一種ABA-反應元件(ABRE)的功能(Yamaguchi-Shinozaki，K.，和Shinozaki，K.(1994)植物細胞6，251-264)。還已知CRT或LTRE，它們是DRE或DRE-相關的核心基序(CCCAG)，存在於乾旱-和冷-誘導基因的區域(例如kin1、kin2、rd17/cor47和cor15a)(參見表3，Baker，S.S.等，(1994)植物分子生物24，701-713；Wang，H.等(1995)植物分子生物28，605-617；Iwasaki，T.等(1997)植物生理115，1287)。表3cDNA微陣列分析a)鑑定的DREB1A靶基因啟動子區域中觀察到的ABRE、DRE和CCGAC核心序列

在表3中，a)，b)和c)如下定義a)ABRE、DRE和CCGAC核心序列是指在被分離出的最長的cDNA 5′-末端的上遊1,000bp觀察到的序列。b)圓括號中的數據代表在被分離出的cDNA 5′-末端開始的核苷酸。減號的含義是一種存在於推定的轉錄起始位點5′-末端上遊的核苷酸。c)由9個核苷酸組成的每種序列，含有一個CCGAC核心基序，而且這些序列一種與另一種相互重疊。
本發明人通過cDNA微陣列分析鑑定了12個DREB1A靶基因。在與FL3-5A3和FL3-27的cDNA分子相對應的基因的啟動子區域觀察到9bp的一個DRE序列(表3)。在與FL3-5A3、FL5-2I22、FL5-77和FL5-94的cDNA分子相對應的基因的啟動子區域觀察到一種核心，序列「CCGAC」(表3)。幾乎所有的乾旱-和冷-誘導的基因均為DREB1A靶基因，其中每種基因在其啟動子中均包含一種DRF/CRT順式作用元件(表3和附圖4)。在已鑑定的12種DREB1A靶基因中的6個啟動子區域觀察到一種ABRE序列(「PyACGTG(G或T)C」(表3)。這表明許多乾旱-和冷-誘導基因受依賴ABA的和不依賴ABA的兩種途徑控制。但是，一些乾旱-和冷-誘導基因(FL5-3M24、FL5-3A15、FL5-1A9和FL5-2024)在35SDREB1A轉基因植物中沒有增加(附圖4)。這表明這些基因不是DREB1A靶基因。在FL5-3M24的cDNA的5′-末端上遊的2,000bp的區域沒有發現核心序列＂CCGAC＂。這表明與乾旱-和冷-誘導基因的表達有關的一種新順式作用元件存在於FL5-3M24基因的啟動子區域中的可能性。(4)各種脅迫處理時間與表達率之間的關係關於上述分離出的18種類型的脅迫誘導基因的各種脅迫處理時間與表達率之間的關係的分析結果，顯示於下列附圖5至39中。基因名脅迫結果(顯示結果的附圖)FL3-5A3 冷(附圖5)，乾旱(附圖6)和高鹽(附圖7)FL5-2H15 冷(附圖8)，乾旱(附圖9)和高鹽(附
圖10)FL5-3M24 乾旱(附
圖11)和高鹽(附
圖12)FL5-90冷(附
圖13)FL5-2I22 冷(附
圖14)，乾旱(附
圖15)和高鹽(附
圖16)FL6-55乾旱(附
圖17)和高鹽(附
圖18)FL1-159 乾旱(附
圖19)FL5-2D23乾旱(附圖20)和高鹽(附圖21)FL05-08-P24 乾旱(附圖22)FL05-09-G08 乾旱(附圖23)FL05-09-P10 乾旱(附圖24)和ABA(附圖25)FL05-10-N02 高鹽(附圖26)FL05-18-I12 乾旱(附圖27)，高鹽(附圖28)和ABA(附圖29)FL05-21-F13 乾旱(附圖30)和冷(附圖31)FL06-10-C16 乾旱(附圖32)，高鹽(附圖33)和ABA(附圖34)FL06-15-P15 乾旱(附圖35)，高鹽(附圖36)和ABA(附圖37)FL08-10-E21 乾旱(附圖38)FL-9-11-P10 高鹽(附圖39)如附圖5至39所示，通過本發明的方法分離出的脅迫誘導基因具有不同的分布型，但是均可以通過施加各種類型的脅迫來誘導表達。本發明的效果本發明提供了一種脅迫反應啟動子。本發明的啟動子是有用的，它可以被用於抵抗環境脅迫植物的分子育種。
序列表110理化學研究所(RIKEN)豐田自動車株式會社(TOYOTA MOTOR CORPORATION)120環境脅迫效應因子130xxxxx150JP 2001-3099841512001-10-05150JP 2000-3566521512000-11-2216020170PatentIn Ver.2.021012112072212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4001tgggcttttg atccacatga cgatcatata gttctttcct tcaacacaaa acacttgaag 60tgtatcttat caactaaact ctattccagc aaaattattt caaaattaga tatatgggag 120aatttttaca ggccattcta gattttcatt aacgctgtga tttatccgtt aataagtacg 180attaagagta aaacgacgtc gtttgcaatt gaaacaaaaa tccccaattc agaaataaga 240aaccctagat cctcaaatct cttcttcttt tcttcttcga attcactcct gtattttgaa 300atcaaagtga attgcaaggc acaaagttca tgctttaaag cactgcaaat ggcgaagtca 360tgatttatat ggcatttttc ctgtttttgt ttcaattgca aacgacgtcg ttttgctctt 420aaacggtctc attaacggat aaatcacatc ttctaattgc tctgtttatt cagttgatgt 480tgtgactaat ttggctctgt caacgaaagt tagtgatttt atctgaagtc aacacgtaat 540tgatgatttt aatcacaaag tacaaagttt atgtttaaag caccacaaat tgcgaagtcg 600tgatttaaat gacatttttc ccgttctggt taaactaagt ttctattatt taatatggat 660attgtggagc gtagtgtcag cactcagcag cttatttaac gtgatactct ttaaccgagt 720aacaactagt gaggtcatat tcaggaccga tccaacaata ttgagggttt tactccaagt 780aaaattttag ttttattttt aattatcata aacgacataa atataatatg gaaagatcac 840aaatactgat taaaaactaa aatcatcaaa acgaaaaaga aaaaagaaaa aattgggttc 900aactctcatg agttattaaa cattttaggt tttaggctta aatctttaaa aaaaatcaga 960actgaaaaac gaaaaattct aattttattt tggactctga ttcatagctt atgtcgctta 1020tgtagttatg ctagggatga atctgtattt cgttaccgta atgagagttc gatactctct 1080tacttgttac gattctggag catgttacat ttttttcttt ccgtcaacaa caactttaat 1140atggtaaaac aaaatttatt tttatttggc tggtcctact caagacaaat cttctgccga 1200catcacataa tcatattaaa aaccataact tctgccactc tgtttttttt tttttttgta 1260accattaact gattggattt tgatccatct catctgattt tttagctcaa caatttactt 1320gcacattttc tatttggttt tatttatact tagttacata tatgattatc gaactagtat 1380ctctttataa ttaagtattt ttctattttt ttttaattta gatttttgtg aattcattta 1440cagtagaaaa ctgtaaaacc atatggtcta attatagaat gaaaacttca acgaatccat 1500acaacttatt ggctaaatat aataaatctg cttgaagcat attgttatta tttagttgga 1560tttgacgatc tctgacttta atgtataccg acatacccta tgatttagat gttgattttt 1620cccattctta atatatccat gttaagagat tccaccataa catatctaat tatttgcatt 1680gtaataaata ttatcattaa aaaaaaatac aactggacag ctggctcgtc ccattgtttc 1740ttacgtccac caattacatt tgttaaagca aacttattag aacgttcatg tgtgagaagt 1800tggtgtcgac atgtgtctaa ggtctatgtc agaaatcgga ttagcttatt aagtaaacta 1860tactatatca ttgttaatat agataaaata tctagttcgt ccaaattaaa ctattttcat 1920aactgccacg tggcgtaaac gtatccatcg agtcacttgt aatatcttta taaccaaagt 1980cttccaacac attcatcacc atctatctac tctttactct cttctcttct cacatcaatt 2040attcatagtt ctctcttctc cggcaagaaa ag 207221022112000212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4002ctcctgtttc atgatcatat ataaaaggaa agagattgat tcagctaatc aaattcataa 60acatggataa gatatcacaa actctaaacc tagctcaaac tatgaacaat agaggataac 120cacttgaaac ctaattttaa tcagaagatt ttagtacttg tgctgcttat tcaaaattcc 180tttgcccaaa aaaaaaaagt ttgacttacc ttttgaaaga cgaacgtatc cactatggaa 240caatctttcg taatctcact ttctagtttg gtatttaaaa aacccaaaat ttgattgtca 300aattaaatac aataagagat tcctaaaccc agaattcaat tgcgaaatca aacagagacg 360atacagagag agcgagagag cgagagagag agagtgattt acgtgagaac gaatcggata 420aacggaaatt tccagaagcc ggatgagttt cccgctattg tgatgagtaa caaaacaaat 480tcgggagttg tctatttaat acttatcaat agcccatgaa cgcagagacg tatggacgcg 540agaatcgtta gtacgtgaca cgtgtaaacc agtgacgtca ccgctctcgt cacaaacccg 600ctagtattgt cctcttctat tttatctcac acaatcatgt taggttatca tagtaccact 660aaacatttat gtgagaatgg atggatatta gacaaccgac gacaaataaa acaaacaaaa 720gtagatagac gaccataaat taaactataa acgaagattg agggaaaaaa tcattggttt 780agattttcga acaaatatcg tgaaaagttt ttcatcttgt agtttttgta attaatggtg 840tatgaaaaat cattggtttg tttagttgaa ttaaatttca gtaaacggtt tagagtatga 900acccactcaa taaagatttg actgccaagc gttactggtg tctggtggat tgaatagtta 960agagtataag gtttgggcca ttatgtggtt tttattaaag ttgaaggtct catttattaa 1020ttccttagag ctgatggcta atgtacaacg aatttgattc aggagtaaga taaacggtac 1080acccaaacac gcgacgcgag cgaagaagac gatgacgaac aaggagaaag ctcgagagag 1140aagggagaaa 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200021032112000212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4003catataccaa ccgcctaaca ttacagcctg tccccatccc ctatctttat ttttcttttt 60ggctcattta gcttcaactt tttttaatag gtgtgattag aacatactaa aaaaaacata 120tgttttaact tatattatat gaataaagtg ttgtttttaa tagtttatat ttctattaca 180agtacaatat ataggatatt ttggttaaca attttaaatt taaaagatat tgtgagtaca 240aatcattaag cttaacacaa atgttcattg cttcttaatt cttacaatcg gaaaatttgg 300acaaaaaatc tagactaatc tccaaaacat tgtgaaaaat tgggggtttt ttttatcatt 360taaattgtct atagtggtca atcattatta aaaaaaattg ttttttgttg aaattttaaa 420ttataaaaaa aaaacacgtt tatacataaa atgcaaaaac ttttcttaaa ccaaattaca 480gagaaaggct atcaccatcc ttgtcttgat gccaaccaca cttgtaatcc caaaatacat 540acttaaacta tactatacta acatgaattg gttatacgat tatctatcta gttagctaca 600taattcatat aattagtttt ttaaaatata cttatgtaat gatagtaact aaaaaatata 660ctatctcgag aaatccaacc aaaatgctat gatagtatat aaaataaaat gaaagaaaga 720ggaaccaagt tgtgaaacca tttaccaaga agaagaagaa aaaaacaaga tggtcgagtc 780tcgtgatagt atgaagctgg ggccgaaacc acgaatcaaa 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1680aaaagactca aaggccagaa ttgacgcagc cgtttatgag aagtgagaag acaatttcgg 1740agtcacttcc tttatttcct ctcttccttc actctctcct atataaacct tcctctcctc 1800ttcctctctt ctcatctctt caaaccattt tcgaaagcct tgagagagag aacacagacg 1860ataccaactt tcttcaatct cgttgccgca gtataattat ctcattcctc ggatatatct 1920ctccttctgc ggcggcgaca agaagctaca agaataaaaa gtctgttttc tctcttttca 1980agaaaccact tacttcgaaa 200021042112000212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4004agcaagtagg ttacgtggaa ggaagatatc aacgcacaaa aagagaaaca ctcaacgtta 60agggaccaac cacaaatctt ggatttttgc tgatgcagtg tgtgaaaaca ggtccacacg 120ctttgtactt ttttcatcat cggtctacaa taaagctcaa gtctttccat ggacagagat 180aagcaagaaa aagtattaac attgttcacc tcaaaataat ttaggaaaat gacaatgaga 240tttttacctc aaaagccaaa atcaacatct acccattctt tcactcgtca caatcatgag 300tttcttacaa tgcttacctt agagtttaga gacatattct cacaaaaaaa gcttgtgtct 360atttcaaatt cttgaccgta gatgtcacaa catgcatata tcattgaaaa cagagcaaca 420caggaaacca agcatatgta tctagatata cttagcaaga cataactata gtctttgaat 480caacataggg attaatgata gagaatgagg aagctcaaga ttttatactc agtttcttac 540aaaacaaatt tctctctaac tgcaaaaaca ccaattagga tttgaagagc gtacctgttt 600gagtcaatgt ccaatgtcgt ccccccgcct tctacatttc ttagcctgct gaataaaagc 660acaagccaaa atgagaaggt gccaaaggcg ataaggatca atttctacca ttcaaaaaac 720taatggtgag aattagaaac gagagaaaac tacttgttga ggaaatagcc aaaagcgcaa 780tcttcgtcac ctgaataaag accaaaccgt cactttcaat gagtcagcaa gaaaaagaga 840gagagagaga gagagattct ctataacatt tgagtcgaca tggattctaa tgcatcaaaa 900gtcatctcca ataaacaaac acttgaaact cacatggcta atagaacaag atcaaagcct 960taagtattaa gcattacaga cactactggc taacttttga cacatgttct taagtaacat 1020agtatcaata tccgtgaatc acatcgaaca cacacaacaa gggcttaatg catcaaagtc 1080ctgttatttc catataacaa catatttcat ttacaaacag aatgcagcat tcaggcagtc 1140caaatggaaa ggttgacaaa aaaatataat cttgtaactc tacatatatg gcagaatgta 1200ataaccaggc aagaaaaaaa cagaataaac agatcaatga gtatgatata aaaaaaagtc 1260acaaagaatg tgccacagtg aacaagaggg ccatgagaag aaattttcaa agaaaatatt 1320agcattgtta gaattttttg ggtcaatgga 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tctacacacg acagtaaagg 180acccactcaa acaataatta gttttcaact ctttcagaat atattttagt gacactaaaa 240tagcatatca taaacacaac agaggccaac gactctgaat gatccgtacc gcagtggaaa 300taacagtccg gttatgtcgg taggctatat aagccactac tttcatttca atttctcaac 360tttgttgtac ttagttcgta tcctatcagt ttatcatcac tttaatttgt taccatatag 420tatctgtaaa aactaattaa tatttatgaa tcatgctcat attttcaaat cttagagcta 480ctcaacagaa cacacacaca tacagtcaaa attttatact acataatttt tgttttaagt 540ttacagttat aaaccaaaca aatcacctca caaaagtata tagttatacc aaaccaagca 600cctcataaat gaaaacaaaa ttaaaaataa taatatatat aataagaaat attcatcaat 660actaacgttc aattttagta aattggcaaa aataaaatat tagtatcact tccagagatt 720acattattat ttggtgaatt tggcaaaaat aaaatatttc gttggtggat gctttgctgg 780gacgactttg tttattaccg tcatattgta gtaacctaat tttattacct aacattcatt 840tgaacattaa aaacattaat gtcatttgat tggaagagtt tattaatgac cattatttcc 900ttatttccaa acctaataaa cccattattt ccttatatta aattatggct tgattggtgc 960aatttctttc tagctctttc tgtttccgtc ttgattcgaa taaaaacgac aaatgttatc 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1.一種環境脅迫反應啟動子，它包括下列(a)、(b)or(c)的DNA(a)由選自序列號1至8的任意核苷酸序列組成的DNA；(b)由含有相對於選自序列號1至8的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一個或多個核苷酸的一種核苷酸序列組成的並具有充當一種環境脅迫反應啟動子功能的DNA；以及(c)在嚴格條件下與由選自序列號1至8的任意核苷酸序列組成的DNA雜交，並且具有充當一種環境脅迫反應啟動子功能的DNA。
2.一種環境脅迫反應啟動子，它包括下列(a)、(b)or(c)的DNA(a)由選自序列號9至18的任意核苷酸序列組成的DNA；(b)由含有相對於選自序列號9至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一個或多個核苷酸的一種核苷酸序列組成的並具有充當一種環境脅迫反應啟動子功能的DNA；以及(a)在嚴格條件下與由選自序列號9至18的任意核苷酸序列組成的DNA雜交，並且具有充當一種環境脅迫反應啟動子功能的DNA。
3.權利要求1或2的啟動子，其中所述的環境脅迫是至少一種選自冷脅迫、乾旱脅迫、鹽脅迫和高光脅迫的環境脅迫。
4.一種表達載體，所述表達載體包括權利要求1至3任一項的啟動子。
5.權利要求4的表達載體，其中還插入了一種所需基因。
6.一種轉化體，所述轉化體包括權利要求4或5的表達載體。
7.一種轉基因植物，所述的轉基因植物包括權利要求4的表達載體或 5的重組載體。
8.權利要求7的轉基因植物，其中的植物是一種植物體、植物器官、植物組織或植物培養細胞。
9.一種用於生產抗脅迫植物的方法，它包括培養或栽培權利要求7或8的轉基因植物。
全文摘要
本發明提供了一種脅迫反應啟動子。本發明的環境脅迫反應啟動子包含下列(a)、(b)or(c)的DNA;(a)由選自序列號:1至18的任意核苷酸序列組成的DNA;(b)由含有相對於選自序列號:1至18的任意核苷酸序列缺失、取代或添加了一個或多個核苷酸的一種核苷酸序列組成的並具有充當一種環境脅迫反應啟動子功能的DNA;以及(c)在嚴格條件下與由選自序列號:1至18的任意核苷酸序列組成的DNA雜交,並且具有充當一種環境脅迫反應啟動子的DNA。
文檔編號A01H5/00GK1373222SQ01145739
公開日2002年10月9日 申請日期2001年11月22日 優先權日2000年11月22日
發明者筱崎一雄, 關原明, 楠城時彥 申請人:理化學研究所, 豐田自動車株式會社