適合抑制哺乳動物感染的環聚糖的製作方法
2023-05-22 09:20:31
專利名稱：適合抑制哺乳動物感染的環聚糖的製作方法
技術領域：
本發明具體涉及具有環形或環狀基本結構的同聚環聚糖用於預防病原體對哺乳動物細胞的入侵和感染，以及用於對抗由此類病原體導致的疾病的用途，其中環聚糖的環上有2至40個單糖，本發明還涉及含有此類環聚糖的食品、營養品和藥物組合物。
病原體生物以及破壞細胞的物質對哺乳動物細胞表面的粘附是細胞感染或破壞的第一步以及必要前提。病原體和細胞之間的相互作用由配體-受體關係形成。在此種配體-受體關係或相互作用中，糖苷的結構起到重要的作用。
影響此種配體-受體關係的一種可能性是阻斷和/或在結構上改變細胞表面或配體上的各自受體。
使用特定的試驗系統可以證明，各種糖類混合物減少或者甚至完全阻止如微生物對細胞表面的粘附，參見Kunz，C；Rudloff，S.ActaPaediatr.1993，82，903-912.其他物質，諸如作為選擇素(selectines)(在內皮細胞和淋巴細胞中的粘著蛋白)的糖配體的路易斯結構，調節淋巴細胞和內皮的相互作用，例如在炎性過程中在滾動(rolling)，自導引和入侵的範圍內調節(Norman，K.E.；Anderson，G.P.；Kolb，H.C.；Ley，K，；Ernst，B.Blood 1998，91，475-483)。與基本細胞功能以及特定的功能，例如細胞粘附、遷移、趨化性、增殖、凋亡、神經突生長同時發生的另一個重要的生理作用由識別半乳糖的凝集素，半乳糖凝集素(galectins)完成(Cooper DN Barondes SH，Glycobiology 1999 9(10)979-984)。這可以由美麗隱杆線蟲(C.Elegans)證明，其半乳糖凝集素LEC-1可以與具有不同特異性的含半乳糖的寡糖衍生物結合(ArataY.Hirabayashi J.Kasai K，JBC，2001276，5，3068-3077)。在小鼠模型中，使用半乳糖特異性的凝集素能夠降低實驗的李斯特氏菌的致死性(Stoffel B.，Beuth J.，Pulverer G.，Zentralbl.Bakteriol.1996，284439-442)。但是微生物對宿主細胞的粘附也可以引發外源病原體及內源細胞中的信號級聯信號。
另一個可能性是在分子生物學水平上獲得對細胞過程(cellularprocesses)的影響。這可以導致例如下列事實在哺乳動物細胞內引發防禦機制，或者，降低或防止病原體微生物中毒性機制表達(例如通過阻斷中央調節劑抑制細菌內的毒性基因)。通過這種方式，可以通過特定的糖，例如纖維二糖成功地阻止李斯特氏菌病原體的特定表面結構的表達，所述特定的表面結構是入侵宿主細胞的原因(Park SF，Kroll RH，Mol Microbiol 1993，8653661WO-A 94/02586)。
本發明的目的是說明如何藉助糖降低病原體對哺乳動物細胞的入侵和感染以及如何有效地對抗由此種病原體導致的疾病。
通過權利要求書的教導實現上述目的。
根據本發明，使用特定的環聚糖實現本發明的目的。下文將此類環聚糖稱作本發明的環聚糖。
根據本發明，可以單獨使用本發明的一種環聚糖和組合使用本發明的多種環聚糖。而且，可以使用本發明的一種環聚糖或幾種環聚糖，或者也可以糖混合物的形式使用本發明的眾多環聚糖與不在本發明環聚糖範圍之內的其他糖類的混合物。
本發明的環聚糖在環上有2至40個單糖；這些是相互鍵合的單糖單元，為了便於表達，在此簡單稱作單糖。這些單糖構成了環形聚合物。因此，本發明的環聚糖可以在環上有2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，35，36，37，38，39和40個單糖。
優選地，本發明的環聚糖由6至40，特別優選6至20，進一步特別優選6至8個單糖組成。
更優選地，本發明的環聚糖是同聚環聚糖。換句話說，環狀或環形基本結構僅有一種類型的單糖，或由相同的單糖組成。
優選環聚糖的環由D-果糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-N-乙醯基葡糖胺、D-N-乙醯基半乳糖胺、D-木糖、唾液酸(例如N-乙醯基神經氨酸)、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-阿洛糖、D-塔羅糖、L-艾杜糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、阿卓糖、D-半乳糖和葡萄糖組成。這些單糖相互鍵合成環狀並特別構成本發明的同聚環聚糖的環。
在這些環聚糖中，環上和連接到環上的環聚糖上的糖苷鍵可以是α1-2，α1-3，α1-4，α1-6，α2-3，α2-6，α2-8，β1-2，β1-3，β1-4，β1-6，β2-1，所述糖苷鍵將在下文詳細描述。
優選單糖彼此間的鍵是α-糖苷鍵或β-糖苷鍵。優選的本發明的環聚糖是那些在環上有6、7或8個葡萄糖單元以α-1-4-糖苷鍵鍵合的環聚糖。其中包括α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精以及本說明書中提到的其衍生物。
特別優選的是非衍生的環糊精。因此，據推測，正是本發明的環聚糖的環狀結構才對本說明書範圍內所描述的效果負責，但本發明不受此種解釋的限制。
正如本說明書所提到的，本發明的環聚糖也可以衍生自的，也就是一種或多種單糖基團、二糖基團和/或其他官能基團。取代作用可以存在於環本身上或者在構成環的單糖的自由羥基上。換句話說，其中一個、二個或多個糖單元可以通過糖苷鍵結合在環上。
優選的衍生環聚糖是那些滿足下列一項、二項或全部標準的環聚糖1.在形成環的一個或多個單糖上由一種或多種下列單糖基團通過糖苷鍵鍵合在其上形成環聚糖衍生物D-果糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-N-乙醯基葡糖胺、D-N-乙醯基半乳糖胺、D-木糖、唾液酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-阿洛糖、D-塔羅糖、L-艾杜糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、阿卓糖、D-半乳糖和葡萄糖；2.在形成環的一個或多個單糖上由一種或多種下列二糖基團通過糖苷鍵鍵合在其上形成環聚糖衍生物乳糖、麥芽糖、蔗糖和N-乙醯基半乳葡糖胺(galacto-N-acetyl glucosamine)；3.形成環的一個或多個單糖的一個或多個OH基團由NH2基團、SH基團、磷酸基、硫酸基團、硝酸基團、烷基、羥基烷基或羧基烷基取代。在烷基、羧基烷基和羥基烷基中，優選烷基有1至6個碳原子。因此形成環的單糖可以被例如一個或多個甲基、乙基、羥乙基、羧甲基和羥丙基等衍生；4.形成環的單糖的一個或多個羥基以及NH2和SH基團(如果存在)以醚、酯、醯胺和亞胺的形式形成衍生物。這些衍生物例如可以是琥珀醯、酯醯(尤其是含有1-25個碳原子，而且尤其是1，2，3，4，5或6個碳原子，例如乙醯基)甲基丙二酸酯、磷酸甘油基(phosphoglyceryl)和磷酸膽鹼基(phosphocholinyl)衍生物。所述酯醯衍生物尤其包括那些具有營養價值的飽和或不飽和含12至22碳原子的脂肪酸。
進一步優選的本發明的環聚糖是下列物質糖基-α-環糊精、麥芽糖基-β-環糊精、羥丙基環糊精、cyclofructines，cyclomannines，cyclogalactines和cycloaltrines。
構成分子的單糖總數是2-250，不論這些單糖是否在環內或結合在環上並形成衍生物。
2-250的範圍代表該範圍內所有的單個數值，因此代表下列數值2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30.....50，51，52，53，54，55.....70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80.....100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120.....137，138，139，140，141，142....158，159，160，161，162，163....179，180，181，182，183，184....199，200，201，202，203，204，205，206，207，208.....219，220，221，222，223，224，225，226....239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250。
本發明的環聚糖是已知的化合物或者可以按照已知的方法製備。小環的環聚糖(例如，環上僅有2個單糖)在下列文獻中有描述Armspach D.，Gattuso G.，Kniger R.，Stoddart JF，Cyclodextrins inBioorganic ChemistryCarbohydrates.(SM Hecht編)Oxford Univ.PressNew York 1999。
本發明的環聚糖包括環糊精，其中的環由單糖或單糖單元葡萄糖構成。它們以α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精的天然方式存在。按照本發明，優選使用這些環糊精。通過環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTases)，一種微生物酶(例如，軟化芽孢桿菌(bacillus macerans))的作用，在酶催化下由澱粉獲得這些環糊精。這三種天然環糊精的區別是基於所包括的葡萄糖的分子數。α-環糊精包括以α-1-4-糖苷鍵鍵合在環上的6個，β-環糊精包括7個以及γ-環糊精包括8個吡喃型葡萄糖單元。通常具有高達10個單糖單元的更大分子的其他環糊精例如描述在MJPlayne R.Crittenden，Commercial available oligosaccharides，Bulletinof the IDF 313，1996，10-22中。其他的環聚糖，優選β-1-2-鍵合的環聚糖，被發現存在於各種細菌的周質空間。由高達40個可被衍生(尤其是在自由羥基)的單糖單元組成的環形分子例如描述在下列文獻中參見Talaga P.，Stahl B.，Wieruszeski J.-M.，Hillenkamp F.，Tsuyumu S.，Lippens G.，Bohin J.-P.，Cell-associated Glucans of Burkholderiasolanacearum and Xanthomonas Campestris pv.Citria New Family ofPeriplasmic Glucans；Journal of Bacteriology 1996，178，8，2263-2271。
可以按照適當的已知方法，以化學或酶催化的方法，或者上述二種技術的組合方法製備本發明的環聚糖。此種組合由單糖組分或通過修飾適當的寡糖原料系統地發生。在酶促合成中，既使用轉移酶(Leloir或非-Leloir)，也使用水解酶(反向水解或轉糖基作用)。在這種情況下，酶可以自由地或結合地(例如，膜反應器)或共價地連接在載體上(例如，小球，色譜材料或濾膜)。也可以使用原核細胞或真核細胞用於合成，只要這些細胞含有合適的酶即可。對於本發明的環聚糖組成進一步的詳細描述，例如可以參考Carbohydrates in Chemistry and Biology(Ernst，Hart，Sinay編；Wiley VCH-Weinheim 2000，Vol.I-IV)。
本發明的其他環聚糖描述在下列文獻中或者可以由其中所描述的方法製備Armspach D.，Gattuso G.，Kniger R.，Stoddart JF，Cyclodextrins inBioorganic ChemistryCarbohydrates.(SM Hecht編)p.458，Oxford Univ.Press New York 1999。Robyt JF，Cyclodextrins inEssentials of Carbohydrate Chemistry(CR Cantor ed.)Springer，New York，1998。
作為額外的信息，引述下列參考如果本發明的環聚糖僅由2個單糖組成，那末它是非取代的，相反，它僅由該二個單糖的環組成。
令人驚奇的是，已經發現本發明的環聚糖至少可以減少或者甚至防止病原體對哺乳動物細胞的入侵和感染，並且可以用於對抗由此類病原體導致的疾病。這些病原體包括侵襲性的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體細菌，例如，細胞內的細菌，尤其是李斯特氏桿菌和致病性病毒，例如輪狀病毒。
例如，已經發現本發明的環聚糖可以防止李斯特氏桿菌，尤其是單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)對哺乳動物細胞的入侵和感染。實驗的結果清楚地表明吞噬作用和侵入的李斯特氏桿菌的複製均未被抑制。其中，本發明的環糊精被證明具有特別強的抑制性。
總之，可以確定本發明的環聚糖對李斯特氏桿菌和沙門氏菌感染具有抗感染或抑制作用。本發明的環聚糖可以防止李斯特氏桿菌對巨噬細胞系的入侵。由於細胞感染前通常發生病原體的粘附和入侵，所有病原體均存在遷移性，其感染的進程與李斯特氏桿菌的機制一致。首要的是沙門氏菌和大腸桿菌(E.Coli)。
到目前為止，僅知道本發明的環聚糖能夠絡合其他物質和物質類以改進其溶解性。但是，根據本發明，發現環聚糖具有抗感染的性能，這使得這些化合物可以用於預防或治療感染，而不需要加入其他物質。如果需要，當然可以將其他活性試劑與本發明的環聚糖一起使用。
本發明的環聚糖可以作為自由或非連接的環狀寡糖使用，也可以結合或固定在，例如吸附在載體上。所述載體可以是肽/蛋白質(例如，BSA)、脂質(糖脂，神經醯胺)、聚合物或生物聚合體物(例如，碳水化合物dendrimer，多糖，聚丙烯醯胺)或任何其他aglykone。
本發明的環聚糖不管是未結合或自由的環聚糖還是與載體結合的環聚糖，可加入各種食品、營養品或藥物組合物中。所有這些組合物可以是適合於所希望的給藥的形式，特別是流體或固體形式。在此所使用的術語「食品組合物」不但包括實際的食品組合物，也包括食品增補劑、飲料和包括嬰幼兒配方的食品組合物。術語「嬰幼兒配方」尤其指所有人工製備的配方。「人工」指由植物或不包括人的動物製備的食品組合物。可以按照任何需要的方式給人或動物服用這些食品組合物。這也包括作為輸液和胃探針進食的方式給藥。但是，也可以將本發明的環聚糖加入天然奶，尤其是動物奶中。
例如，本發明的環聚糖可以作為摻合劑或添加劑加入下列產品中，但此種列舉並不是窮盡性的奶和奶製品、嬰幼兒配方食品、巧克力塊、酸奶飲品、乾酪、香腸和肉製品、合成代謝食品、探針進食食品和孕婦及免疫抑制用產品。
除本發明的環聚糖外，在本發明的組合物中也可以存在其他碳水化合物，因此，本發明的組合物包括碳水化合物的混合物，而本發明的環聚糖是該碳水化合物的混合物的一部分。
也可以將本發明的環聚糖單獨或與一種或多種其他活性劑一起作為藥物組合物的形式給藥。這些組合物例如可以配製成片劑/膠囊。對於此類藥物製劑，可以使用常規的輔劑、載體、助劑、稀釋劑、溼潤劑、增稠劑、調味劑、甜味劑等。
可以按照任何常規的方法給患者(即人或動物)施用藥物組合物。但是，出於方便，它們可以是適合口腔、舌、鼻腔、腸道、支氣管、陰道、局部(皮膚和黏膜)和口服給藥的組合物並配製成適合給藥途徑的製劑。
含有至少一種本發明的環聚糖的食品、營養組合物和藥物組合物尤其可以用於預防和對抗胃腸道(例如李斯特氏菌)，血液系統、呼吸系統、泌尿生殖道以及鼻咽的感染，以及用於保護內皮、上皮細胞和黏膜。因此，可以將其局部塗敷在皮膚上或者也可以用於黏膜上。這些黏膜包括鼻、腸道、支氣管和陰道黏膜。因此，也可以將本發明的環聚糖例如加入漱口水中。所有年齡段的群體，從新生嬰兒直到老年人均可成為本發明的環聚糖的目標用戶群體。特殊的應用領域是用於孕婦、病人、體質虛弱者和老年人的防護和治療，對於上述群體，預防例如李斯特氏菌是特別重要的。
含有至少一種本發明的環聚糖的示例性營養品和藥物列舉如下。它們是下列本發明的環聚糖α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、cyclofructines(DP 6-8)、cyclomannines(DP 6-8)、cyclogalactines(DP6-8)、cycloaltrines(DP 6-8)、periplasmic環聚糖(DP 6-25)。出於簡便，在實施例中將這些環聚糖均稱作「環聚糖」。該術語代表了上述每種本發明的環聚糖及其混合物。
實施例1為了製備香粉(sachets)，在每種情況下均在乾燥狀態下將100mg環葡聚糖與990mg麥芽糖糊精混合，然後包裝成香粉。在每天進餐時給藥這些香粉三次。
實施例2將一種含有18.8g蛋白質、8.6g脂肪、62.8g碳水化合物、3.3g礦物質和維生素的丸狀產品(bead product)形式的已知藥用食品(即，MilupaHN 25，平衡膳食)以本身已知的組成與環聚糖混合，混合的量是在100g球形終產品中含有50mg環聚糖。
對於液體藥用食品的組合物，則將100ml的已知藥用食品MilupaHN 25液體(2.3g蛋白質、1.6g脂肪、8.5g碳水化合物、37g礦物質和維生素)與7mg環聚糖混合。
實施例3孕婦用產品按照本身已知的方法，通過混合200至500mg環聚糖製備一種泡騰片劑(成品重量4.15g)(Neovin，來自Milupa)。每天1片溶解於150ml水中飲用。
實施例4老年人和體質虛弱人群用產品按照本身已知的方法，通過向每100g粉劑中加入100mg至1000mg的環聚糖製備含有22.5g蛋白質、7.7g脂肪、60.8g碳水化合物、5.4g礦物質和維生素的平衡粉狀藥用食品(Dilsana，來自Milupa)。每天將多達3×50g的該食品溶解在150ml水中服用。
實施例5茶將100g按照常規方法製備的速溶茶粉與2g環聚糖混合。將3.8g茶粉溶解在100ml熱水中並且每天服用3次。
實施例6按照常規的方法以丸狀產品的形式製備含有11.8g蛋白質、56.9g碳水化合物、24.9g脂肪、2.5g礦物質和維生素以及45mg牛磺酸的蛋白質型嬰兒配方奶(Aptamil，來自Milupa)，在每100g該嬰兒配方奶中混合有100mg至1000mg的環聚糖。
權利要求
1.具有環形基本結構的環聚糖用於減少或防止病原體對哺乳動物細胞的入侵和感染以及用於對抗由此類病原體所導致的疾病的用途，其中環聚糖的環上有2至40個單糖，並且所述環聚糖是未被取代的或者可以在形成所述環的單糖上由一個或多個單糖或二糖和/或一個或多個官能團形成衍生物，其中構成環聚糖分子的單糖的總數是2至250，並且所述環聚糖可以結合或固定在惰性載體上。
2.權利要求1的用途，其特徵在於所述環聚糖是同聚環聚糖和/或所述環聚糖的環由6至40個，尤其6至20個單糖構成。
3.權利要求1或2的用途，其特徵在於環聚糖的環由D-果糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-N-乙醯基葡糖胺、D-N-乙醯基半乳糖胺、D-木糖、唾液酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-阿洛糖、D-塔羅糖、L-艾杜糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、阿卓糖、D-半乳糖和葡萄糖構成。
4.前述權利要求中任何一項的用途，其特徵在於滿足下列一項、二項或全部標準1)所述環聚糖在形成所述環的一個或多個單糖上由一種或多種下列單糖基團通過糖苷鍵鍵合在其上形成衍生物D-果糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-N-乙醯基葡糖胺、D-N-乙醯基半乳糖胺、D-木糖、唾液酸、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-阿洛糖、D-塔羅糖、L-艾杜糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、阿卓糖、D-半乳糖和葡萄糖；2)所述環聚糖在形成所述環的一個或多個單糖上由一種或多種下列二糖基團通過糖苷鍵鍵合在其上形成衍生物乳糖、麥芽糖、蔗糖和N-乙醯基半乳葡糖胺；3)形成所述環的一個或多個單糖的一個或多個OH基團由NH2基團、SH基團、磷酸基、硫酸基團、硝酸基團、烷基、羥基烷基或羧基烷基取代；4)形成所述環的單糖的一個或多個羥基以及如果存在的NH2和SH基團衍生成醚、酯、醯胺和亞胺的形式。
5.前述權利要求中任一項的用途，其特徵在於所述環上的單糖的鍵是α-糖苷鍵或β-糖苷鍵，其中通過β-糖苷鍵連接的單糖尤其是周質聚糖。
6.前述權利要求中任一項的用途，其特徵在於所述環聚糖在環上含有6、7或8個單糖並且尤其是葡萄糖單元。
7.權利要求1的用途，其特徵在於所述環聚糖是α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、cyclofructines，cyclomannines，cyclogalactines和cycloaltrines，其中上述環聚糖可以按照權利要求4所述的方式形成衍生物。
8.權利要求7的用途，其特徵在於所述衍生的環聚糖是葡糖基-α-環糊精、麥芽糖基-β-環糊精和羥丙基環糊精。
9.前述權利要求中任一項的用途，其特徵在於所述載體是肽、蛋白質、脂質、類脂、聚合物或生物聚合物。
10.前述權利要求中任一項的用途，其特徵在於將所述環聚糖加入液體或固體食品組合物、營養組合物或藥物組合物中，用於給人或動物施用或用於製備此類組合物。
11.權利要求10的用途，其特徵在於所述組合物用於口腔、舌、鼻腔、支氣管、陰道、局部(皮膚和黏膜)以及口服給藥，用於通過探針向人或動物的胃給藥，或用作輸液給藥。
12.前述權利要求中任一項的用途，其特徵在於以至少每千克體重1毫克的量向人或動物每日施用一次所述環聚糖。
13.前述權利要求中任一項的用途，用於預防和治療胃腸道、血液系統、呼吸道、泌尿生殖道以及鼻咽的感染，尤其是李斯特氏菌感染。
14.前述權利要求中任一項的用途，其特徵在於所述病原體是侵入性的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原性細菌，尤其是李斯特氏菌和病原性病毒。
15.含有權利要求1至9中任何一項的環聚糖或多種此類環聚糖的食品組合物、營養組合物和藥物組合物。
16.權利要求15的組合物，其特徵在於它可以含有一種或多種權利要求1所述的環聚糖以外的其它碳水化合物，一種或多種其他活性劑和/或一種或多種已知的並且適合於相應的組合物的其他成分，其中在藥物組合物的情況下，可以存在一種或多種常規的助劑，包括稀釋劑、溼潤劑、增稠劑、調味劑、甜味劑和載體。
17.減少或防止病原體入侵和感染哺乳動物細胞的方法，以及對抗由此種病原體導致的人和動物的疾病的方法，其特徵在於向人或動物施用至少一種如權利要求1至9中任一項的環聚糖或權利要求15或16的組合物，尤其是以每千克體重至少1毫克環聚糖的量向人或動物每日一次提供所述環聚糖或組合物。
18.用於減少或防止病原體對哺乳動物細胞的入侵和感染以及用於對抗由此類病原體所導致的疾病的具有環形基本結構的環聚糖，其中環聚糖的環上有2至40個單糖，並且所述環聚糖是未被取代的或者可以在形成所述環的單糖上由一個或多個單糖或二糖和/或一個或多個官能團形成衍生物，其中構成環聚糖分子的單糖的總數是2至250，並且所述環聚糖可以結合或固定在惰性載體上。
全文摘要
本發明具體描述了具有環形基本機構的同聚環聚糖用於預防病原體對哺乳動物細胞的入侵和感染的用途，以及用於對抗由此類病原體所導致的疾病的用途，其中所述環上有2－40個單糖。本發明還描述了含有這些環聚糖的食品組合物、營養組合物和藥物組合物。
文檔編號A61K31/715GK1627949SQ03803167
公開日2005年6月15日 申請日期2003年1月20日 優先權日2002年2月1日
發明者貝恩德·施塔爾, 貝恩特·芬克, 約阿希姆·施米特, 維爾納·格貝爾, 約爾格·斯拉吉烏什, 京特·伯姆 申請人:N.V.努特裡西阿