K-ras基因突變的定量檢測方法

2023-05-22 11:31:16 2

專利名稱：K-ras基因突變的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及K-ras基因突變的檢測，尤其涉及一種K-ras基因突變的 定量檢測方法。
背景技術：
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突變在胰腺癌的發生發展中起重 要作用。已報導，在胰腺癌組織、胰液或糞便、血液中可檢測出K-ras 基因第12、 13或61密碼子點突變(Takahashi， et al. Gastrointestinal Endo 2005.61:76—9; Luigi L， et al. Oncogene 2002.21:4301—6; Tada M， et al. Cancer Res 1993. 53: 2472—4; Lu XH, et al. Natl Med J China 2001. 81: 1050 — 3; N van Heek， et al. J. Clin. Pathol. 2005. 58:1315-1320)。
研究表明，檢測體細胞DNA中K-ras基因突變與否可作為胰腺癌早 期診斷的一種方法。但在一些實驗中發現慢性胰腺炎及膽道結石等良性疾 病中也存在K-ras基因突變，單純定性分析，特異性較差，定量分析能更 好反映突變程度，以便於良惡性鑑別。目前普遍應用的K-ras基因突變檢 測方法為限制性片斷長度多態性分析法(RFLP法)和擴增受阻突變體系 法(ARMS法)。
RFLP法是將PCR與限制性酶切相結合的方法。但是該方法存在以下 缺點(1) 步驟煩瑣，需要2天時間才能完成鑑定；
(2) 只能作定性研究，即只能明確是否存在K-ms基因突變，若要 求定量，則需用其他方法進行進一步檢測；
(3) 存在第一輪酶切不完全導致的假陽性。 ARMS法的原理是根據3'端錯配原則，在進行擴增反應時，若3'
端鹼基對形成錯配，鏈延伸反應就會因3' ， 5' 二磷酸二酯鍵形成的障 礙而受阻，因此，只有模板鏈是特定的等位基因時，才會檢測出特異的擴 增產物。在ARMS的反應體系中，引物上標記2個不同螢光素，或加入熒 光探針等方法都是以實時螢光PCR為基礎的基因分型方法。 ARMS法的步驟包括
(1) 設計針對K-ms基因某一種突變類型的特異性引物或探針；
(2) 對已知突變量的標準品進行實時定量PCR檢測，得出標準曲線；
(3) 對未知樣本進行實時定量PCR檢測，根據上述標準曲線，得出未 知標本突變量。
但是，該方法的缺點是
(1 )每種特異性引物或探針只能針對某一種基因突變類型進行鑑定，
而K-ms基因在第12、 13密碼子的突變類型可有十餘種，需要逐一檢測；
(2)可能出現由於單一鹼基錯配造成的假陽性。
肽核酸(P印tide Nucleic Acid， PNA)是一種DNA類似物，其骨架 由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯糖，其較之傳統DNA探針具有 不少優點1. PNA十分穩定，正確配對的DNA/PNA的穩定性遠遠高於相 應的DNA/DNA，同時在PCR反應過程中PNA不可作為Taq酶的底物，亦不會被其他酶所降解；2.對於錯配的PNA/DNA，哪怕只有一個鹼基的錯配， 也會造成其融解溫度下降9一1(TC左右。目前，肽核酸己在多個領域得到 應用(張兵波等，《高分子通報》2006， 9:62-68; Egholm M， et al. Nature, 1993， 365:566 568)。
SYBR Green I是一種綠色螢光染料，它與雙鏈DNA結合發出螢光，通 過檢測螢光不但可以檢測反應體系中的DNA擴增量，同時還能測定擴增產 物的DNA融解溫度。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種K-ras基因突變的定量檢測方 法，該方法只需設計一種針對野生型的PNA，並將該PNA與SYBR實時定 量PCR相結合，可對K-ras基因在第12、 13密碼子的所有突變類型進行
為了解決上述技術問題，本發明K-ras基因突變的定量檢測方法， 包括以下步驟
(1) 設計一種PNA，該PNA與野生型K-ras基因第一外顯子中第12密 碼子和/或第13密碼子進行雜交，用於封閉野生型K-ms基因擴增；
(2) 構建突變型標準品和野生型標準品，該突變型標準品包含K-ras 基因第12和/或第13密碼子的突變型序列，該野生型標準品包含野生型 K-ras基因序列； .
(3) 對已知拷貝數的突變型標準品進行加入PNA的SYBR—RT—PCR 定量檢測，得出用於突變型K-ras基因定量的標準曲線；對己知拷貝數的 野生型和/或突變型標準品進行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量檢測，得出用於總體K-ras基因定量的標準曲線；
(4) 由步驟(3)的SYBR-RT—PCR定量檢測，得出用於定性判斷待測 樣品為野生型或突變型或突變/野生混合型的PCR產物融解曲線；
(5) 在與步驟(3)相同的反應條件下，用所述PNA對待測樣品核酸進 行SYBR—RT—PCR定量檢測，並根據步驟(4)的融解曲線的差異對待測樣 品核酸進行定性判斷後，根據步驟(3)的標準曲線得出待測樣品核酸的 K-ras基因突變量及其佔總體K-ras基因的比例。
所述突變型標準品和野生型標準品至少包括質粒、基因組DNA或人 工合成序列中的一種。
優選的，所述突變型標準品為質粒，該質粒包含K-ras基因第12和 /或第13密碼子的突變型序列；所述野生型標準品為質粒，該質粒包含野 生型K-ras基因序列。
所述步驟(2)和步驟(3)之間，還包括對待檢樣品中的核酸進行提 取、純化和濃度測定。
所述步驟(5)中待測樣品核酸的K-ras基因突變量為突變K-ras基因 的拷貝數量，所述比例為拷貝數比值。
所述待檢樣品包括糞便、血液、組織液、細胞株或組織。
本發明K-ras基因突變的定量檢測方法，將PNA與SYBR實時定量PCR 的結合應用於K-ms基因檢測，由於PNA能同時覆蓋K-ras基因第一外顯 子中第12、 13密碼子的6個鹼基，任一突變均可導致PNA/DNA的錯配， 使得融解溫度發生明顯改變，因此只需設計一種針對野生型的PNA，進行 一次PCR反應，即可將K-ras基因在第12、 13密碼子的十餘種突變型與野生型區分開。本發明方法操作簡便、敏感性高、特異性高，可實時定量
檢測K-ras基因突變量，並可應用於胰腺癌等疾病的早期輔助診斷。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
圖1是本發明實施例1的質粒測序結果圖2是本發明實施例1的標準品擴增曲線圖3是根據圖2繪製的標準曲線圖4是本發明實施例1的擴增產物的融解曲線圖5是本發明實施例1的定量方法示意圖。
具體實施例方式
以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例 中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人， 分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
本發明採用聯合肽核酸(PNA)的實時定量PCR法檢測K-ras基因點 突變。所述K-ras基因可以是從慢性胰腺炎及胰腺癌患者的胰液、糞便及 血液中提取的DNA中的基因。因為PNA同時覆蓋了 K-ras基因第一外顯子 中第12、 13密碼子的6個鹼基，任一突變均可導致PNA/DNA的錯配，使 得融解溫度發生明顯改變，故只需設計一種針對野生型K-ras基因的PNA， 進行一次PCR反應，即可區分野生型與突變型。
實施例1對已知突變量的質粒標準品進行實時定量PCR檢測
l.主要試劑來源1.1 設計PNA
PNA是針對野生型K-ras基因第12、 13密碼子設計的PNA，其序列 為Ac-ACGCCACCAGCTC-Lysine-C00H (SEQ ID NO: 1)，由韓國panagene 公司合成。
1.2 PCR引物
本發明用於擴增K-ras基因靶序列的引物，包括以下引物對 上遊引物Fl: 5' -TACTGGTGGAGTATTTGATA-3' (SEQ ID NO: 2); 下遊引物Rl: 5' -CAAGATTTACCTCTATTGTT-3' (SEQ ID NO: 3); 上述PCR引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。
1.3 TA克隆試劑盒
TA克隆試劑盒(Target Clone)購買於TOYOBO公司。 1.4質粒抽提試劑盒 質粒抽提試劑盒購買於TIANGEN公司。
1. 5 SYBR Green realtime PCR Master Mix購買於ABI公司。
2. 細胞株DNA抽提
選取胰腺癌細胞株Panc-1、 BxPC-3、 CFPAC及SW1990 (細胞株來自 本實驗室)，用酚提取法常規抽提細胞株DNA，並使用DNA純化試劑盒 (Tiangen公司)進行純化。
使用Gene公司NanoDrop ND1000型核酸微量測量儀測定所抽提DNA 濃度(OD260/OD280二1. 0 2. 0)。經檢測，DNA濃度分別為Pane-1， 517ng/ Pi; BxPC-3， 337ng/ul; CFPAC， 425ng/ul; SW1990， 425ng/ul。
3. PCR方法克隆構建含突變型和野生型檢測靶序列的質粒標準品3. 1 PCR反應液配製
PCR反應體系包括10 X Ex Taq緩衝液2 y 1 ， dNTP混合液200 u M， 引物F1 (SEQIDN0: 2)、 Rl (SEQIDN0: 3)各O. 5線DNA模板100ng， Taq酶1U用無菌雙蒸水定容至20 ii 1 。
3. 2 PCR反應
所用儀器為德國Eppendorf公司5331型Thermal Cycler PCR儀。 PCR反應條件:94。C預變性5min， 94。C變性30s， 52。C退火40s， 72。C延 伸40s ，共35個循環，72'C延伸10min。
3.3電泳
2. 0%瓊脂糖凝膠電泳確定產物正確性。
4. PCR產物克隆入質粒 4. 1菌株構建
將PCR產物純化後，通過T載體連接，構建出攜帶突變和野生檢測 靶序列的質粒，此質粒在E.coli DH5a (該大腸桿菌由本實驗室培養所 得)進行大量擴增，並抽提純化獲得，測序正確後作為標準品。
4. 1. 1通過以下公式求得構建質粒時Xu 1以上的PCR產物X = 5 0Y + Z (Ykb: PCR產物的大小、Zng/ul: PCR產物濃度)。按以下組成 配製T載體連接液包括滅菌蒸餾水2u 1、 2X連接緩衝液1、 pTA2載 體(50ng/ul) lul、 T4 DNA連接酶lul、 PCR產物lyl，共10ul。 將反應液於室溫(15 25°C)進行30分鐘反應。
4. 1. 2製備感受態細胞，並加入上述連接液，用氯化鈣方法轉化大 腸桿菌，並進行X-gal和IPTG篩選(具體方法見《分子克隆實驗指南》第三版上冊第96-99、 103頁)。 4. 2質粒提取
挑取篩選所得的白色菌落，加入5ml預先加入氨苄青黴素(100mg/ml) 的LB培養基中，37"C振搖12 16小時。用Tiangen普通質粒小提試劑盒 (離心柱型)提取質粒。
4. 3質粒測序
質粒測序由invitrogen公司承接。
測序結果BxPC-3為野生型K-ras基因(第12、 13密碼子為GGTGGC)， Pane-1、 CFPAC及SW1990為突變株，第12、 13密碼子分別突變為G^TGGC、 GXTGGC、 GGTG^C (見圖1)。
5. SYBR—RT—PCR實時定量檢測K-ras基因突變 5.1標準品配製
根據測序結果，選取突變型細胞株Pane-1為標準品模板。 模板拷貝數換算拷貝數二質量/分子量X6. 02X1023 質粒分子量計算MW= (A鹼基數X312) + (C鹼基數X288) + (G
鹼基數X328) + (T鹼基數X303) —61"鹼基數X324. 5;或是使用軟
件DNAMAN計算。
本實驗中合成的質粒為3457bp， 19Kda，因此lng質粒拷
貝數約為3X108。
將模板倍比稀釋為107、 106、 105、 104、 103拷貝，作為標準品模板。 5.2 SYBR—RT—PCR螢光嵌合反應
在實時定量反應中以非特異性雙鏈嵌合螢光染料SybrGreen I進行螢光標記，PCR反應後根據融解曲線判斷PCR產物的特異性。實驗中PNA 能將野生型基因的擴增進行抑制，因此儀器所檢測的螢光量可反應突變基 因的拷貝量。
5. 2. 1反應體系及反應條件
儀器選用ABI公司的7500型實時定量PCR儀。
突變型K-ras基因檢測反應體系包括2XTaqman realtime PCR Master Mix,引物F1 (SEQ ID NO: 2)、 Rl (SEQ ID NO: 3)各O. 4線 PNA (SEQ ID NO: 1) 3. 75線DNA標準品模板為108、 107、 106、 105、 104、 103、 102拷貝，用無菌雙蒸水定容至25 u 1 。設定純水為陰性對照(NTC)。
總體K-ras基因檢測(不加PNA，針對突變/野生混合型)反應體系 包括2XTaqman realtime PCR Master Mix,弓l物Fl (SEQ ID NO: 2)、 Rl (SEQ ID NO: 3)各0.4nM， DNA標準品模板為108、 107、 106、 105、 104、 103、 102拷貝，用無菌雙蒸水定容至25 p 1 。設定純水為陰性對照(NTC)。
PCR反應條件95。C預變性60s， 95。C變性15s， 70。CPNA結合10s， 60。C退火60s，共40個循環；之後，95。C變性15s後，再以0. 7°C/s從 95"C降至6(TC，進行融解曲線分析。
5.2.2標準曲線繪製
根據步驟5. 2. 1中檢測的結果分別繪製出相應突變型K-ras基因檢 測標準曲線和總體K-ms基因檢測標準曲線。
圖2為突變型K-ras基因檢測標準曲線，在該圖中，上升的八條曲 線自左向右依次分別代表稀釋倍比為108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 IO拷貝的突變型質粒標準品模板。圖2中，橫軸指循環數，縱軸指螢光檢測值。由圖2進一步繪製用十計算的標準曲線(見圖3)。在圖3中， 橫軸指拷貝數的對數值，縱軸指Ct值，標準曲線的斜率為-3.01，截距 (Interc印t)為39. 06， R2為0. 997。
同樣，可繪製出總體K-ras基因檢測標準曲線(圖略)。
5.2.3擴增產物的融解曲線分析
PNA分別封閉野生型和突變型序列後，擴增產物的融解曲線如圖4所 示。多次重複測定可獲得，野生型與突變型融解溫度分別為83.5X:士0.5 (n=15)和80.8。C士0,6 (n=15)。在圖4中，橫軸指溫度，縱軸指螢光 強度變化的導數(derivative),融解曲線1代表純野生型不加PNA的產 物融解曲線，其Tm值為83.9'C;融解曲線2代表純突變型不加PNA的產 物融解曲線，其Tm值為83.2'C;融解曲線3代表純野生型或突變/野生 混合型，加入PNA未能完全抑制野生型擴增的產物融解曲線，其Tm值也 為83. 9°C;融解曲線4代表純突變型或突變/野生混合型，加入PNA能完 全抑制野生型擴增的產物融解曲線，其Tm值為80.5"。 5.2.4定量方法
選用同一系列倍比稀釋的質粒標準品(Panel)，分成兩組， 一組標 準品反應體系中不加PNA，另一組加入PNA(終濃度為3.75uM)。同時， 待檢模板也同樣分為兩組。這四組在同一條件下進行SYBR RT—PCR，反 應結束後，根據PNA加入和不加入的情況分別製作突變型和總體K-ras 基因定量檢測標準曲線，並分別進行待檢樣本的定量。其中，對於未加入 PNA的反應，野生型與突變型均擴增，結果計算出的模板量為野生型基因 與突變型基因的總拷貝數；而加入PNA的反應，因為野生型基因受到抑制而無擴增，結果所得的模板量即為樣本中所含的突變型基因的拷貝數(見 圖5)。但應當注意，在定量時，應先進行上述的融解曲線分析，若根據
融解曲線判斷樣本為純野生型或突變型時，只需進行總拷貝數計算；若判 斷為突變/野生混合型時，在PNA加入突變型K-ras基因檢測反應中，野 生型擴增完全抑制的前提下，依據突變型K-ras基因檢測標準曲線，計算 出K-ras突變基因拷貝數，在PNA不加入的總體K-ras基因檢測反應中， 依據總體K-ras基因檢測標準曲線，計算出K-ras基因總體拷貝數。並由 此計算出樣本中突變佔總體拷貝數的比例。
實施例2臨床樣品(以血液和糞便樣品為例)中K-ras基因突變的
1. 收集臨床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人的糞便及血液，抽提
DNA。
2. 血液DNA抽提方法①抗凝全血0.5 12ml;②加入500 700ul TT緩衝液，劇烈振蕩後，低溫離心機以每分鐘12000轉離心5分鐘；③ 收集沉澱，重複2， 3步驟，直至沉澱為無色； 加入200ulPCR裂解液A; ⑤37。C水浴過夜；⑥抽取PCR裂解物(約200ul)，加入200ul酚氯仿， 充分混勻後，以每分鐘12000轉離心20分鐘；⑦取上清，加入200ul氯 仿充分混勻，12000轉/分離心10分鐘；⑧取上清，加入100ul乙酸銨及 2倍體積無水乙醇(約700ul)充分混勻，靜置1分鐘後，12000轉/分離 心10分鐘；⑨棄上清加入lml 70%乙醇洗滌，12000轉/分離心5分鐘; ⑩棄上清，自然風乾，用100ulTE液溶解沉澱，分裝於一80。C保存。
3. 糞便DNA抽提方法採用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool MiniKit試劑盒進行。
4. DNA濃度測定方法同實施例1的步驟2。
5. 按照實施例1的5. 2. 1，對標本進行K-ras基因的PNA鉗制SYBR -RT-PCR檢測。
6. 結果分析根據標準曲線，得出胰腺癌K-ras基因突變拷貝數及 突變型與野生型的比例。序列表
〈110〉上海長海醫院
〈120〉 K-ras基因突變的定量檢測方法
〈130〉 NP-07-11857
〈160〉 3
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 1
13
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
1
acgccaccag etc 13
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
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<222〉 (l).'咖
〈223〉 引物
〈400〉 2
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〈211〉 20
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—feature
〈222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
〈400〉 3
caagatttac ctctattgtt 20
權利要求
1. 一種K-ras基因突變的定量檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)設計一種PNA，該PNA與野生型K-ras基因第一外顯子中第12密碼子和/或第13密碼子進行雜交，用於封閉野生型K-ras基因擴增；(2)構建突變型標準品和野生型標準品，該突變型標準品包含K-ras基因第12和/或第13密碼子的突變型序列，該野生型標準品包含野生型K-ras基因序列；(3)對已知拷貝數的突變型標準品進行加入PNA的SYBR—RT—PCR定量檢測，得出用於突變型K-ras基因定量的標準曲線；對已知拷貝數的野生型和/或突變型標準品進行不加入PNA的SYBR—RT—PCR定量檢測，得出用於總體K-ras基因定量的標準曲線；(4)由步驟(3)的SYBR—RT—PCR定量檢測，得出用於定性判斷待測樣品為野生型或突變型或突變/野生混合型的PCR產物融解曲線；(5)在與步驟(3)相同的反應條件下，用所述PNA對待測樣品核酸進行SYBR—RT—PCR定量檢測，並根據步驟(4)的融解曲線的差異對待測樣品核酸進行定性判斷後，根據步驟(3)的標準曲線得出待測樣品核酸的K-ras基因突變量及其佔總體K-ras基因的比例。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述突變型標準品和野 生型標準品至少包括質粒、基因組DNA或人工合成序列中的一種。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述突變型標準品為質 粒，該質粒包含K-ras基因第12和/或第13密碼子的突變型序列。
4. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述野生型標準品為質 粒，該質粒包含野生型K-ras基因序列。
5. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述步驟(4)和步驟(5) 之間，還包括對待檢樣品中的核酸進行提取、純化和濃度測定。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(5)中待測樣 品核酸的K-ras基因突變量為突變K-ras基因的拷貝數量，所述比例為拷 貝數比值。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述待測樣品包括糞便、 血液、組織液、細胞株或組織。
全文摘要
本發明公開了K-ras基因突變的定量檢測的方法，包括以下步驟設計一種與野生型K-ras基因第一外顯子中第12密碼子和/或第13密碼子進行雜交的PNA；用所述PNA分別對已知拷貝數的突變型標準品和野生型標準品進行SYBR-RT-PCR定量檢測，得出標準曲線和融解曲線；用所述PNA對待測樣品核酸進行SYBR-RT-PCR定量檢測；根據所述融解曲線判斷待測樣品核酸為野生型或突變型或突變/野生混合型後，根據所述標準曲線得出待測樣品核酸的K-ras基因突變量。本發明方法操作簡便、敏感性高、特異性高，並可應用於胰腺癌等疾病的早期輔助診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101434985SQ200710094239
公開日2009年5月20日 申請日期2007年11月15日 優先權日2007年11月15日
發明者李兆申, 杜奕奇, 寒 林, 軍 高, 龔燕芳 申請人:上海長海醫院