用蛋白酶水解法製備高鐵含量血紅素多肽複合物方法

2023-05-22 14:37:36

專利名稱：：用蛋白酶水解法製備高鐵含量血紅素多肽複合物方法
技術領域：
：本發明涉及血紅素多肽複合物的方法，尤其是提供一種用蛋白酶水解製備高鐵含量血紅素多肽複合物的水解法，屬生物工程
技術領域：
。
背景技術：
：血紅素是含鐵的卟啉(鐵卟啉)化合物，是血液紅細胞所含血紅蛋白的重要組成成分。血紅蛋白是血紅素的結合蛋白，其血紅素是通過鐵原子以配價鍵與珠蛋白的組氨酸殘基(配位體)結合，形成結合蛋白質。血紅素可以直接被小腸吸收，不受植物性食物所含的妨礙鐵離子吸收的物質的影響，其吸收利用率要比無機鐵鹽及植物性食物所含鐵離子高得多。動物血是血紅素的豐富來源，但要在胃腸道內將蛋白質消化，血紅素釋出後才能吸收利用。傳統用化學方法從血液中提取血紅素，可得純度高的氯化血紅素，是結晶化合物，但不溶於酸性水溶液，難於吸收。
發明內容本發明提供一種用蛋白酶水解製備高鐵含量血紅素多肽複合物，克服了傳統化學法提取的血紅素製品不溶於酸性水溶液的缺點。本發明還公開了上述血紅素多肽複合物的製備方法，具有工藝簡單，容易控制等優點，製成含鐵量較高親水性強的血紅素多肽。本發明提供的用蛋白酶兩次水解製備高鐵含量血紅素多肽複合物方法，可以通過以下技術方案製得將動物血加水或稀酸調到pH3-7，加入蛋白酶，在攪拌下保溫將血紅蛋白水解，水解10-48小時，使化學反應達到平衡，停止保溫，高速離心棄去不沉澱的胺基酸和小肽，收集沉澱物，即得血紅蛋白第一次水解產物，為分子量較大的血紅素多肽。根據化學平衡原理，分離胺基酸及小肽後繼續加酶水解，即可打破原來的平衡狀態，趨向新的平衡，得到更徹底的水解產物，即含鐵量更高的、分子量更小的血紅素多肽複合物，滿足軟膠囊生產原料的要求。若水解時應用兩種不同的蛋白酶，如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，由於酶的作用特異性不同，水解肽鏈的位點不完全一致，相互補充，則水解的效果更佳，更容易獲得較小分子量的血紅素多肽產物。本發明高鐵含量血紅素多肽複合物的製備方法，包括以下步驟將動物血加等量水或稀鹽酸調到pH3-7，加入蛋白酶(每公斤加入1-4克)，在攪拌下保溫將血紅蛋白水解，水解10-40小時，停止保溫，離心收集沉澱物，加熱烘乾後粉碎，得血紅素多肽粗提物；將血紅素多肽粗提物加水1-5倍，加等量水或稀鹽酸調到pH3-7，再加蛋白酶(每公斤加入1-4克)保溫水解，水解10-40小時，停止保溫，高速離心收集沉澱物，加熱烘乾後粉碎，即得濃縮血紅素多肽產物。本發明涉及的動物血是指豬血或其他屠宰動物的血液。本發明涉及的蛋白酶包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意一種或雙酶聯用。3本發明方法製得的血紅素多肽複合物，可使血紅素有親水多肽的結合，通過用鹽析、等電點沉澱、三氯乙酸沉澱等方法處理，都不能將血紅素和多肽分離，說明血紅素多肽是相當穩定的複合物而不是簡單的混合物。tableseeoriginaldocumentpage4親水性質保證血紅素鐵在腸道裡的消化吸收，多肽含有大量氨基和羧基等親水基團，是親水性物質，它的結合使不溶於水的血紅素轉變為可溶於酸性水溶液的物質，即血紅素與多肽結合而成的親水複合物。本發明的積極效果在於採用兩次蛋白酶水解血紅蛋白，血紅素與蛋白水解產生的肽類結合成血紅素與多肽的複合物(血紅素多肽)，這種複合物的結合相當牢固，不易將它們分離開來，兩次酶水解能夠實現血紅素多肽中的肽類更進一步分解，提高了血紅素多肽中血紅素含量，降低了多肽的含量，血紅素鐵含量高；由於血紅素有親水的多肽的結合和覆蓋，使複合物具有一定的親水性，易溶於胃酸、醋酸等酸性溶液，容易消化吸收。而且應用高速離心技術可簡便地將血紅素多肽分離，使得血紅素多肽能夠製成製備膠囊劑的原料，滿足生產的需要。具體實施例方式實施例1取10kg新鮮豬血加等量水溶血，加熱至沸，冷卻至攝氏40度，加入木瓜蛋白酶20克，攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎即得第一次水解產物。然後加兩倍重量的水攪拌，再加入木瓜蛋白酶20克，保持攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎，即得鐵含量較高的血紅素多肽的第二次水解產物。tableseeoriginaldocumentpage4實施例2取10kg新鮮豬血加等量水溶血，加熱至沸，冷卻至攝氏40度，加入木瓜蛋白酶40克，攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎即得第一次水解產物。然後加兩倍重量的水攪拌，再加入木瓜蛋白酶40克保持攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎，即得鐵含量較高的血紅素多肽粉。tableseeoriginaldocumentpage5實施例3取10kg新鮮豬血加等量水溶血，加熱至沸，冷卻至攝氏40度，加入木瓜蛋白酶10克，攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎即得第一次水解產物。然後加兩倍重量的水攪拌，再加入木瓜蛋白酶10克保持攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎，即得鐵含量較高的血紅素多肽粉。tableseeoriginaldocumentpage5實施例4取10kg新鮮豬血加等量水溶血，加熱至沸，冷卻至攝氏40度，加入木瓜蛋白酶20克，攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎即得第一次水解產物。然後加兩倍重量的水攪拌，再加鹽酸調PH3，加入胃蛋白酶20克，保持攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，加碳酸鈉調至pH5.0，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎，即得鐵含量更高的血紅素多肽粉。tableseeoriginaldocumentpage5實施例5取10kg新鮮豬血加等量水溶血，加熱至沸，冷卻至攝氏40度，加入木瓜蛋白酶40克，攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎即得第一次水解產物。然後加兩倍重量的水攪拌，再加鹽酸調PH3，加入胃蛋白酶40克，保持攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，加碳酸鈉調至pH5.0，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎，即得鐵含量更高的血紅素多肽粉。tableseeoriginaldocumentpage6實施例6取10kg新鮮豬血加等量水溶血，加熱至沸，冷卻至攝氏40度，加入木瓜蛋白酶10克，攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎即得第一次水解產物。然後加兩倍重量的水攪拌，再加鹽酸調PH3，加入胃蛋白酶10克，保持攝氏40度下攪拌20小時。停止加熱保溫，加碳酸鈉調至pH5.0，高速離心收集漿狀沉澱物，烘乾粉碎，即得鐵含量更高的血紅素多肽粉。tableseeoriginaldocumentpage6結果說明實施例4、5、6的先木瓜蛋白酶後胃蛋白酶的效果最佳，兩次木瓜蛋白酶的實施例1、2、3的效果最差；無論何種方式，兩次酶水解的效果都優於一次酶水解。權利要求一種用蛋白酶兩次水解製備高鐵含量血紅素多肽複合物，可以通過以下方法得到將動物血加等量水或稀鹽酸調到pH3-7，加入蛋白酶(每公斤加入1-4克)，在攪拌下保溫將血紅蛋白水解，水解10-40小時，停止保溫，離心收集沉澱物，加熱烘乾後粉碎，得血紅素多肽粗提物；將血紅素多肽粗提物加水1-5倍，加等量水或稀鹽酸調到pH3-7，再加蛋白酶(每公斤加入1-4克)保溫水解，水解10-40小時，停止保溫，高速離心收集沉澱物，加熱烘乾後粉碎，即得濃縮血紅素多肽產物。2.根據權利要求1所述高鐵含量血紅素多肽複合物的製備方法，包括以下步驟將動物血加等量水或稀鹽酸調到pH3-7，加入蛋白酶(每公斤加入1-4克)，在攪拌下保溫將血紅蛋白水解，水解10-40小時，停止保溫，離心收集沉澱物，加熱烘乾後粉碎，得血紅素多肽粗提物；將血紅素多肽粗提物加水1-5倍，加等量水或稀鹽酸調到pH3-7，再加蛋白酶(每公斤加入1-4克)保溫水解，水解10-40小時，停止保溫，高速離心收集沉澱物，加熱烘乾後粉碎，即得濃縮血紅素多肽產物。3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於動物血是指豬血或其他屠宰動物的血液。4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於蛋白酶包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意一種或雙酶聯用。全文摘要本發明公開一種用蛋白酶兩次水解法製備高鐵含量血紅素多肽複合物，用兩次酶水解血液製備血紅素多肽的方法，水解蛋白質產生的多肽包裹血紅素，形成血紅素多肽複合物；採用兩次蛋白酶水解血紅蛋白，血紅素與蛋白水解產生的肽類結合成血紅素與多肽的複合物(血紅素多肽)，這種複合物的結合相當牢固，不易將它們分離開來，酶水解能夠實現血紅素多肽中的肽類更進一步分解，提高了血紅素多肽中血紅素含量，降低了多肽的含量，血紅素鐵含量高；由於血紅素有親水的多肽的結合和覆蓋，使複合物具有一定的親水性，易溶於胃酸、醋酸等酸性溶液，容易消化吸收。文檔編號C12P21/06GK101748181SQ20101003083公開日2010年6月23日申請日期2010年1月15日優先權日2010年1月15日發明者嶽海濤,王友聯,謝海泉,麥蔭喬申請人:白求恩醫科大學製藥廠