能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法
2023-05-22 14:13:26 2
能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法，包括以下步驟：1）、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液（PBS,pH7.0）中加入100～150mg兒茶素和1.0～2.0g的Tween80於40～60℃攪拌，得兒茶素PBS溶液；2）、稱取100～200mg丙磺舒、0.1～0.5g卵磷脂和100～500mg膽固醇溶於10～20ml二氯甲烷中，使用注射器注入步驟1）所得的溫度為40～60℃的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌，得懸浮液；3）、將懸浮液旋轉蒸發以除去二氯甲烷；再於350～400W功率的超聲波下超聲處理8～12min，得兒茶素複方納米脂質體。
【專利說明】能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法
【技術領域】
[0001]兒茶素為茶葉中最主要的天然活性成分，具有多種藥理和保健活性。本發明涉及一種能夠提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法。
【背景技術】
[0002]茶多酚(Tea Polyphenols, TP)是茶葉中多酚類及其衍生物的總稱，主要有兒茶素、黃酮類、花青素和酚酸等物質組成，其中兒茶素類佔茶多酚總量60%-90%。兒茶素具有很強的生物活性，大量研究均表明兒茶素具有抗氧化清除自由基、抗心血管疾病、抑菌消炎等多種保健和藥理作用。但是制約著兒茶素或茶多酚高效利用的關鍵技術問題一直沒有得到有效解決，其關鍵問題是兒茶素類化合物在機體內的胃腸道生物膜轉運率較低，從而導致較低的生物利用度。因此，通過改變兒茶素類保健品的劑型來增強其生物利用度，必將為兒茶素的深入研究與開發奠定堅實的基礎。
[0003]痛風是由單鈉尿酸鹽沉積所致的晶體相關性關節病，與嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排洩減少所致的高尿酸血症直接相關，特指急性特徵性關節炎和慢性痛風石疾病，主要包括急性發作性關節炎、痛風石形成、痛風石性慢性關節炎、尿酸鹽腎病和尿酸性尿路結石，重者可出現關節殘疾和腎功能不全。痛風常伴腹型肥胖、高脂血症、高血壓、2型糖尿病及心血管病等 心腦血管性疾病。目前對高尿酸血症的治療主要包括抑制尿酸生成的藥物，如別嘌醇類藥物；另一類為促進尿酸排洩加快的藥物，如丙磺舒類藥物。
[0004]目前由於經濟快速發展、人們生活節奏的加快，加之生活水平的提高、飲食結構的改變，導致的高尿酸血症和各種心腦血管慢性病逐漸呈現升高的趨勢，往往相伴有高血壓、高血脂、高血糖等現代內分泌、代謝紊亂性疾病。由於生活和工作壓力過大，往往導致內分泌發生紊亂，從而導致機體機能和各種複合疾病進一步發生和加劇，大部分人都處於亞健康狀態。加之各種應酬增多、抽菸、酗酒、熬夜、長期處在電腦輻射狀態下，使得人們在不知不覺中體內積聚了大量的自由基，同時可能會慢慢滋生各種疾病。因此，開發符合現代人生活方式並能夠快速清除體內自由基的新型保健品，具有重要意義和市場前景。
[0005]由於高尿酸血症和高血脂、高血壓等心腦血管類疾病往往伴隨發生，而且此類疾病一般需要長期連續服藥，同時由於丙磺舒具有抑制細胞上皮多藥耐藥外排蛋白的獨特功效。
[0006]目前與兒茶素或茶多酚相關的保健品層出不窮，傳統保健品劑型有片劑、膠囊，新型保健品劑型有微球、微囊、脂質體、環糊精包合劑及固體分散劑等，其中部分劑型(如茶多酚片劑、茶多酚膠囊等)在臨床進行了推廣和應用，但臨床效果並不十分理想。這些製劑均以單一的兒茶素作為主要活性成分，然而關於兒茶素和其他藥品或保健品組成的複方製劑，鮮見報導。結合本實驗室前期研究積累和大量文獻報導可知，由於兒茶素類化合物極性較大、水溶性較高，生物膜滲透性較差，加之小腸上皮細胞膜中轉運蛋白(P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白等)對兒茶素髮揮「外排」作用，從而使得該類化合物口服後難以通過小腸上皮細胞進入全身血液循環，以致兒茶素類化合物在機體內的生物利用度較低，大部分在腸道中被各種酶或微生物所代謝和降解，或隨糞便排洩到體外，從而使得該類化合物難以在體內發揮有效作用。因此，如何提高兒茶素類化合物生物膜轉運速率，從而提高其生物利用度和增強兒茶素類化合物在作用靶部位的富集，是解決限制兒茶素大規模應用這一重要「瓶頸」的關鍵共性問題。
[0007]目前在提高兒茶素生物膜轉運方面的研究主要集中在兒茶素衍生化物的製備和應用上，近來年也有學者開展了兒茶素/茶多酚納米粒製劑或注射用納米乳劑的研究，但此類研究主要是針對如何促進兒茶素跨膜轉運進行的有益探索。然而關於兒茶素與其他活性成分組成的複方製劑，從而發揮協同功效的研究尚未見報導。目前也沒有丙磺舒和兒茶素的複方製劑被報導。
【發明內容】
[0008]本發明要解決的技術問題是提供一種兒茶素複方納米脂質體的製備方法，採用該方法能製備出能夠提高兒茶素生物利用度的複方製劑。
[0009]為了解決上述技術問題，本發明提供一種兒茶素複方納米脂質體的製備方法，包括以下步驟:
[0010]1、能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法，其特徵是包括以下步驟:
[0011]I)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.0)中加入100~150mg兒茶素和1.0~2.0g的Tween80於40~60°C (最佳為50°C)攪拌，直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液；
[0012]2)、稱取100~200mg丙橫舒、0.1~0.5g卵憐脂和100~500mg膽固醇溶於10~20ml 二氯甲烷中，使用注射器以1.5~2.5ml/分鐘的速度(較佳為2ml/分鐘)注入步驟I)所得的溫度為40~60°C (最佳為50°C)的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌20~40min (較佳為30min),得懸浮液；
[0013]3)、將懸浮液旋轉蒸發以除去二氯甲烷；再於350~400W(較佳為380W)功率的超聲波下超聲處理8~12min (較佳為lOmin)，得兒茶素複方納米脂質體。
[0014]該兒茶素複方納米脂質體一般為10-100納米。
[0015]作為本發明的能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法的改進:卵磷脂為蛋黃卵磷脂或大豆卵磷脂。
[0016]作為本發明的能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法的進一步改進:依次進行以下步驟:
[0017]1)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7.0)中加入150mg兒茶素和1.6g的Tween80於50°C攪拌，直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液；
[0018]2)、稱取150mg丙磺舒、0.5g蛋黃卵磷脂和200mg膽固醇溶於IOml 二氯甲燒中，使用注射器以2ml/分鐘注入步驟I)所得的溫度為50°C的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌30min,得懸浮液；
[0019]3)、將懸浮液於旋轉蒸發儀上以除去二氯甲烷；再於380W功率的超聲波下超聲處理lOmin，得兒茶素複方納米脂質體。
[0020]在本發明中，0.05mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7.0)的製備方法為:準確稱取磷酸氫二鈉0.05396g、磷酸二氫鉀0.08432g於燒杯，加水至20ml，從而配製0.05mol/L磷酸鹽緩衝液(PBS, ρΗ7.0)。此為公知技術。
[0021]本發明在發明過程中，使用了如下的檢測方法:
[0022]方法一、
[0023]採用向0.3mL空白血漿中加入兒茶素EGCG標準品的方法，配製濃度範圍為
0.l-200mg/L的兒茶素EGCG標準樣品，再向其中加入30 μ L20% (質量百分濃度)的抗壞血酸，再加入30 μ LlOO μ g/mL香蘭素作為內標，混合後加入3mL乙酸乙酯進行萃取，振蕩lmin, 6000r/min高速離心5min,分別得有機相(位於上層)和水相(位於下層);將水相(位於下層)用3mL乙酸乙酯重複萃取一次(萃取條件同上)，合併兩次萃取有機相，於45°C水浴中氮氣流(弱氮氣流)吹乾，所得殘渣用0.lmL20% (體積％)的乙腈水溶液溶解，超聲振蕩後，18000r/min高速離心3min,取20 μ L上清液HPLC進樣分析。
[0024]具體為:以日本島津高效液相色譜，兩元高壓泵，紫外檢測器，大連伊利特Hypersil BDS C18柱(5 μ m, 250mmX 4.6mm),流動相為乙腈:0.1% (質量％)檸檬酸水溶液=10: 90 ;柱溫 300C，波長 280nm ;流速為 1.0mL.mirT1 ;進樣量為 20 μ L。
[0025]備註說明:空白血漿即為沒有加入EGCG的純血漿。
[0026]根據HPLC檢測結果，以兒茶素EGCG峰面積與內標香蘭素峰面積之比(Y)為縱坐標，以兒茶素EGCG濃度的質量濃度(X)為橫坐標，繪製標準曲線，求出曲線方程和相關係數(r)。同時製備含兒茶素EGCG曲線範圍內高、中、低濃度血漿樣品0.2，10.0,50.0mg/L作為質控樣品(QC)，分別按照上述樣品處理方法處理後進樣分析，每個濃度樣品重複5次，以樣品中EGCG峰面積與直接溶於流動相下所測峰面積之比，計算高、中、低3種濃度下方法回收率(即，樣品中EGCG峰面積與直接溶於流動相下所測峰面積之比=EGCG回收率)。比較以上樣品於日內5次和日間5次測定的峰面積的變化，計算日內精密度和日間精密度。
[0027]備註說明:「日內精密度和日間精密度」主要用於評價上述方法一(即HPLC檢測方法)的精密度和準確性，以此來判斷最終檢測結果的可靠性。
[0028]結果為:
[0029]按照上述方法所得處理血漿中EGCG在0.l_200mg/L濃度範圍內標準曲線為Y=0.004x+0.0002 Cr > 0.999)，在標準曲線範圍內高、中、低濃度兒茶素EGCG回收率均大於85%以上，日內精密度和日間精密度均小於10%，見表1。
[0030]表1.血漿中兒茶素EGCC的回收率和精密度(n=5)
1..............................'mmi bhw...(%>1....mg/L__日內日間
[0031]IOJ8d2i 土 Iltf I 6.729.47
I10.09LS6±7J5 [ 5J87J?
50J9436±627 6 64TM
[0032]根據上述結果，我們能得知:本發明所設置的上述檢測方法一能滿足本發明的兒茶素生物利用度的檢測的要求。
[0033]方法二、[0034]在本發明中，將一定體積(約2mL)的兒茶素納米脂質體懸浮液(本發明步驟2)所得的懸浮液)用超濾離心管(10000MWC0，密理博中國有限公司)在4000r/min下離心IOmin,取濾膜(10000MWC0孔徑濾膜，即，為留在濾膜上的化合物最小分子量為10000的超濾膜)下層的濾液lmL，置於離心管中，按照方法一中相同色譜條件，取離心管中的超速離心(6000r/min離心5min)後得到的過濾液進樣分析。計算脂質體包封率，包封率(％) ={(兒茶素初始含量-濾液中兒茶素含量)/兒茶素初始含量} X 100%。
[0035]方法三、
[0036]80隻SPF級ICR雄性小鼠購於浙江省醫學科學院實驗動物中心，合格證號SCXK(浙)20080033,體重25±2g，實驗組40隻小鼠隨機分為8組，每組5隻，於實驗前適應性養殖一周，口灌前12h禁食、不禁水，按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的兒茶素複方製劑(即，本發明所得的兒茶素複方納米脂質體，上述120mg為兒茶素複方製劑中的兒茶素量)，同時設立兒茶素生理鹽水溶液組作為對照。
[0037]對照中:兒茶素生理鹽水溶液的濃度為15mg/mL，兒茶素的有效用量同上述兒茶素複方製劑中兒茶素的有效用量；對照組也為:40隻小鼠隨機分為8組，每組5隻，於實驗前適應性養殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
[0038]將上述實驗組和對照組，分別按照上述劑量口灌兒茶素複方納米脂質體和兒茶素生理鹽水溶液，均於口灌後 5min、lOmin、15min、30min、60min、120min> 180min 和 240min眼球取血，每組採血5隻小鼠，然後將所取血液於肝素化離心管中，6000r/min離心後，取
0.3mL血漿於IOmL離心管中，同時參照上述方法一處理後進HPLC分析。將所測血漿中兒茶素EGCG峰面積代入上述標準曲線方程(方法一所得)中，計算血漿中兒茶素EGCG濃度，繪製血藥濃度——時間曲線，比較兒茶素複方製劑(本發明)和市售片劑及單方製劑血藥濃度，以此來評價複方製劑中丙磺舒對」L茶素在機體內生物利用度的影響。
[0039]即，本發明利用實驗動物整體小腸吸收模型，通過定量檢測本發明所得的兒茶素與丙磺舒複方製劑在體內生物利用度，製備一種能夠發揮丙磺舒和兒茶素協同功效的新型製劑，在發揮治療高尿酸血症同時治療心腦血管疾病中的應用。
[0040]綜上所述，本發明採用了 RP-HPLC方法分析檢測了血漿等生物樣品中兒茶素EGCG的準確、定量檢測手段，檢測限達到微克級，完全能夠滿足小鼠血樣中兒茶素EGCG的檢測。在兒茶素複方製劑配製中，採用丙磺舒與兒茶素製成複方脂質體，丙磺舒在吸收和代謝消除過程中均能增強兒茶素的生物利用度，同時兩者又那能起到協同功效。
[0041]即，本發明在製備兒茶素和丙磺舒複方納米脂質體基礎上，探索丙磺舒與兒茶素的協同作用，從而拓展兒茶素新型功效和應用領域，充分發揮兒茶素的生物活性，服務於臨床。
[0042]本發明的兒茶素複方納米脂質體的實際用法和用量為:口服，2~IOg兒茶素/人.天。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]下面結合附圖對本發明的實施結果作進一步詳細說明。
[0044]圖1是兒茶素EGCG的標準色譜圖；
[0045]圖2是空白血漿的色譜圖；[0046]圖3是服用實施例1所述的兒茶素複方製劑後小鼠血漿色譜圖；
[0047]圖4是實施例1所述的兒茶素複方製劑與市售片劑組EGCG濃度——時間曲線對比圖； [0048]圖5是實施例1所述的兒茶素複方製劑與兒茶素單方製劑EGCG濃度——時間曲線對比圖；
[0049]圖6是實施例1所述的兒茶素複方製劑與兒茶素+丙磺舒的混合物的EGCG濃度——時間曲線對比圖；
[0050]圖7是實施例2和實施例3所述的EGCG濃度——時間曲線對比圖；
[0051]其中峰I為兒茶素EGCG色譜峰；峰2為內標。
【具體實施方式】
[0052]實施例1、一種能提高兒茶素生物利用度的兒茶素複方納米脂質體的製備方法，依次進行以下步驟:
[0053]I)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7.0)中加入150mg兒茶素和1.6g的Tween80於50°C攪拌，直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液；
[0054]2)、稱取150mg丙磺舒、0.5g蛋黃卵磷脂和200mg膽固醇溶於IOml 二氯甲燒中，使用注射器以一定速度(2ml/分鐘)注入步驟I)所得的溫度為50°C的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌30min，得懸浮液；
[0055]3)、將懸浮液於旋轉蒸發儀上以除去二氯甲烷(45°C水浴加熱)；再於380W功率的超聲波(頻率為28KHZ)下超聲處理lOmin，得兒茶素複方納米脂質體約24.15g。
[0056]實施例2、一種兒茶素複方納米脂質體的製備，依次進行以下步驟:
[0057]I)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7.0)中加入150mg兒茶素和1.6g的Tween80於50°C攪拌，直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液；
[0058]2)、稱取IOOmg丙磺舒、0.5g蛋黃卵磷脂和200mg膽固醇溶於IOml 二氯甲燒中，使用注射器以一定速度(2ml/分鐘)注入步驟I)所得的溫度為50°C的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌30min，得懸浮液；
[0059]3)、同實施例1 ;得兒茶素複方納米脂質體約23.86g。
[0060]實施例3、一種兒茶素複方納米脂質體的製備，依次進行以下步驟:
[0061]I)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7.0)中加入150mg兒茶素和1.6g的Tween80於50°C攪拌，直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液；
[0062]2)、稱取200mg丙磺舒、0.4g蛋黃卵磷脂和400mg膽固醇溶於IOml 二氯甲燒中，使用注射器以一定速度(2ml/分鐘)注入步驟I)所得的溫度為50°C的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌30min，得懸浮液；
[0063]3)、同實施例1 ;得兒茶素複方納米脂質體約24.21g。
[0064]實驗1、檢測脂質體包封率:
[0065]將實施例1、實施例2、實施例3的步驟2)所得的懸浮液按照上述方法二進行檢測，結果如下:
[0066]實施例1所得的懸浮液的包封率(％) =99.21% ；
[0067]實施例2所得的懸浮液的包封率(％) =98.84% ；[0068]實施例3所得的懸浮液的包封率(％) =82.94%。
[0069]實驗2、將實施例1、實施例2、實施例3所得的兒茶素複方納米脂質體按照上述方法三所述的方法進行檢測；同時設立兒茶素生理鹽水溶液組、市售片劑組EGCG、兒茶素+丙磺舒的混合物(由150mg兒茶素和150mg丙磺舒組成)作為對照。
[0070]備註說明:
[0071]市售片劑組EGCG中:EGCG的有效量為3.5mg/g。
[0072]具體為:[0073]按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的實施例1所得的兒茶素複方製劑，
[0074]按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的實施例2所得的兒茶素複方製劑，
[0075]按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的實施例3所得的兒茶素複方製劑，
[0076]按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的市售片劑組(將市售片劑組溶於生理鹽水而得)，
[0077]按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的兒茶素生理鹽水溶液(EGCG溶於生理鹽水而得)，
[0078]按照120mg兒茶素/kg體重給小鼠口灌配製的兒茶素+丙磺舒的混合物(將該混合物溶於生理鹽水而得)。
[0079]結果如圖4、圖5、圖6、圖7所述。
[0080]上述結果表明:本發明中所製備的複方兒茶素納米脂質體在不同採血時間點血液中EGCG濃度均顯著高於市售片劑和兒茶素單方製劑，說明複方製劑生物利用度顯著高於市售片劑和單方製劑。
[0081]對比例1、將實施例1中的丙磺舒由150g改成200g ;其餘同實施例1。
[0082]對比例2、將Tween80由1.6g改成3.2g，其餘同實施例1。
[0083]對比例3、將蛋黃卵磷脂改成大豆卵磷脂；其餘同實施例1。
[0084]對比例4、將步驟I)和步驟2)中的溫度由50°C改成80°C ;其餘同實施例1。
[0085]對比例5、將步驟I)中的0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液改成0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液，其餘同實施例1。
[0086]對比例6、將步驟3)中的超聲功率由380W改成480W，其餘同實施例1。
[0087]對比實驗:將上述對比例I~6按照上述方法三所述的方法進行檢測；即，控制上述每個組別中EGCG用量同實施例1中EGCG用量。
[0088]最終結果如下表2。
[0089]表2不同對比例中兒茶素EGCG血藥濃度——時間數據(mg/L)
[0090]
【權利要求】
1.能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法，其特徵是包括以下步驟: 1)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS, pH7.0)中加入100~150mg兒茶素和1.0~2.0g的Tween80於40~60°C攪拌,直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液； 2)、稱取100~200mg丙橫舒、0.1~0.5g卵憐脂和100~500mg膽固醇溶於10~20ml 二氯甲烷中，使用注射器以1.5~2.5ml/分鐘的速度注入步驟I)所得的溫度為40~600C的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌20~40min，得懸浮液； 3)、將懸浮液旋轉蒸發以除去二氯甲烷；再於350~400W功率的超聲波下超聲處理8~12min，得兒茶素複方納米脂質體。
2.根據權利要求1所述的能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法，其特徵是:所述卵磷脂為蛋黃卵磷脂或大豆卵磷脂。
3.根據權利要求1或2所述的能提高兒茶素生物利用度的複方納米脂質體的製備方法，其特徵是依次進行以下步驟: 1)、在20mL0.05mol/L的磷酸鹽緩衝液(PBS，ρΗ7.0)中加入150mg兒茶素和1.6g的Tween80於50°C攪拌，直至兒茶素和Tween80均溶解；得兒茶素PBS溶液； 2)、稱取150mg丙磺舒、0.5g蛋黃卵磷脂和200mg膽固醇溶於IOml 二氯甲燒中，使用注射器以2ml/分鐘注入步驟I)所得的溫度為50°C的兒茶素PBS溶液中，恆溫攪拌30min，得懸浮液； 3)、將懸浮液於旋轉蒸發儀上以除去二氯甲烷；再於380W功率的超聲波下超聲處理IOmin,得兒茶素複方納米脂質體。
【文檔編號】A61K9/127GK103536589SQ201310462701
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】葛建, 韓寶瑜, 王夢馨 申請人:中國計量學院