杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物及其製備與應用的製作方法
2023-05-12 11:33:21 1
專利名稱：杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物及其製備與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於中藥領域，涉及杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物製備工藝及其在開 發抗炎、抗細菌、抗耐藥菌株、治療宮頸炎疾病等新型藥物中的應用。
背景技術：
杏香兔耳風(Ainsliaea fragrans Champ.)是菊科兔耳風屬植物，為《江西省中 藥材標準》1996年版收載。其具有清熱解毒、利溼、止血等功效，民間以全草入藥，主治虛勞 骨蒸，肺癆咳血、婦女崩漏、溼熱黃疸、水腫、癰疽腫毒、瘰癧結核、跌打損傷、毒蛇咬傷。分布 於江蘇、浙江、江西、福建等地。現代藥理試驗表明，杏香兔耳風中主要的藥效活性成分主要 含3-咖啡醯基奎寧酸、3，5-二咖啡醯基基奎寧酸、4，5-二咖啡醯基基奎寧酸等，具有提高 免疫功能、抑制炎症介質如組胺、前列腺素等釋放、對宮頸炎大鼠宮頸黏膜PGE2及外周血T 淋巴細胞亞群的調節作用，尤其是抗耐藥菌株等方面具有一定的作用。宮頸炎的患病率居婦科病之首，高達39. 30%，其發病原因主要有化學物質或機械 性刺激(損傷)後造成感染、病原體感染而導致炎症。宮頸炎也是誘發不孕症和宮頸癌的高 危因素之一。目前，治療宮頸炎的藥品很少，上市藥品大多對輕度單純宮頸炎療效尚可，但 對耐藥性病原菌感染、深度感染等宮頸炎療效欠佳。目前，在已發表的文獻中，杏香兔耳風提取物製備以總酚酸或總黃酮的含量為考 察指標，通過紫外分光光度計檢測含量，提取物成分複雜，主要藥效成分不明確，在一定程 度上將導致製劑的藥效成分含量低，日服劑量大。例如一種杏香兔耳風提取物及其製備方 法(中國，專利號ZL200510075384.4)，針對黃酮及內酯類成分，經水提，聚苯乙烯型大孔 樹脂精製，得到總黃酮含量為廣60%的提取物。經藥理研究該提取物表明其具有抗炎活性， 並可製成片劑、膠囊、顆粒劑或口服液劑型。杏香兔耳風總酚酸提取物及其製備方法(中國， 申請號200810111902. 7)，針對杏香兔耳風總酚酸，經醇提、大孔樹脂精製，得到總酚酸含 量大於60%、綠原酸含量為廣5%的提取物。經藥理研究表明其對盆腔炎具有抑制作用。一 種杏香兔耳風有效部位及其製備方法和應用(中國，申請號200810106926. 3)針對杏香兔 耳風總酚酸，經醇提、大孔樹脂精製，得到總酚酸含量為廣80%的提取物，含有0. 05 20%的 綠原酸，0. 5^50%的3，5- 二咖啡醯基奎寧酸、4，5- 二咖啡醯基奎寧酸。經藥理研究表明其 具有抗炎、抑菌、抗病毒作用。並且，上述專利研究表明杏香兔耳風提取物具有抗炎抑菌作 用，但未見涉及其對宮頸炎和耐藥菌抑制作用的研究。
發明內容
針對目前杏香兔耳風提取物的藥效成分含量低、日服劑量大，本發明主要採用 藥效活性成分咖啡醯奎寧酸類物質為考察指標，對杏香兔耳風藥材進行提取、純化，得到 UV含量大於70%，HPLC含量大於50%的咖啡醯奎寧酸類物質，其中3-咖啡醯基奎寧酸和 3，5- 二咖啡醯奎寧酸含量均高於10%。本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物，其特徵在於提取物中以3-咖啡醯
3基奎寧酸，3，4- 二咖啡醯奎寧酸、3，5- 二咖啡醯奎寧酸、4，5- 二咖啡醯奎寧酸為主。本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物，其特徵在於提取物以咖啡醯奎寧酸 類成分計算，UV含量為70%以上，HPLC含量為50%以上。其中3-咖啡醯基奎寧酸和3，5-二 咖啡醯奎寧酸含量均高於10%。本發明的提取物通過以下步驟製備得到
a)取杏香兔耳風乾燥藥材，切段，用5 20倍體積的濃度為4(Γ80%的乙醇在6(TlO(TC 下加熱回流提取2、次，每次1-3小時，過濾，合併得提取液A ；
b)提取液A經4(T60°C減壓濃縮至1/Γ1/8倍，即得到濃縮液B；
c)濃縮液B用稀鹽酸調pH至到廣3，將酸性濃縮液經大孔樹脂吸附，先用去離子水 衝洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為50 70%之間的洗脫液，經40 60°C減壓濃縮去醇後，得濃縮液D ；
d)再將濃縮液D用稀鹽酸調pH至到1 3，經大孔樹脂吸附，先用去離子水衝洗樹脂， 再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為40 70 %之間的洗脫液，合併，真空乾燥，即 得杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物。以上述方法提取的提取物以咖啡醯奎寧酸類成分計 算，UV含量為70%以上，HPLC含量為50%以上。其中3-咖啡醯基奎寧酸和3，5- 二咖啡醯 奎寧酸含量均高於10%。本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在於製備步驟a 中提取溶媒選用40% 80%的乙醇。本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在於製備步驟a 中提取溶媒優選50%的乙醇。本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在於所述的大孔 吸附樹脂選自 AB-8、HPD-400、NKA-9、HPD-擬6。本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在於大孔吸附樹 脂 HPD-826。本發明還涉及一種藥物組合物，其特徵在於包含本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧 酸類提取物和藥學上可接受的輔料。所述藥物組合物的劑型為片劑、膠囊、顆粒劑、散劑、丸 劑、浸膏劑、口服液或糖漿劑。本發明還涉及杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物在製備抗炎、抗細菌、抗耐藥菌 株的藥物中的應用。特別是在製備抗宮頸炎的藥物中的應用。針對杏香兔耳風提取物成分複雜，主要藥效成分不明確這一問題，本發明的杏香 兔耳風提取物製備工藝採用活性引導分級分離方法，並結合HPLC跟蹤檢測目標，選取中級 性苯乙烯型HPD-^6大孔吸附樹脂，進行兩次連續吸附解析，避免了目標成分了流失，同時 使藥效成分的含量得到明顯提高，所得提取物具備主要藥效成分更明確、提取率高的優勢。 具體表現在本發明杏香兔耳風提取物不僅經紫外分光光度計檢測咖啡醯奎寧酸類成分含 量約70%，而且經HPLC檢測主要藥效成分含量大於50%，其中3-咖啡醯基奎寧酸和3，5- 二 咖啡醯奎寧酸含量均高於10% ；並且其中主要含有3-咖啡醯基奎寧酸、3，4- 二咖啡醯基奎 寧酸、3，5- 二咖啡醯基奎寧酸、4，5- 二咖啡醯基奎寧酸等咖啡醯奎寧酸類成分。本發明所得的杏香兔耳風提取物具有抗炎、抗細菌、抗耐藥菌株藥效作用，並無明 顯急性毒性作用。具體表現在對大鼠肉芽腫的增生、二甲苯致小鼠耳腫脹具有顯著的抑制作用；對宮頸炎大鼠病變組織病變有明顯改善作用，對白細胞數量有降低作用；對抗耐藥 性病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌感染小鼠具有較好的抗感染作用。解決了目前相關產 品對耐藥性病原菌感染、深度感染等宮頸炎療效欠佳的問題。因而，本發明的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取工藝在藥材利用率、明確主要藥 效成分，減小日服劑量，提高療效等方面具有明顯的優勢。本專利藥理試驗結果顯示，杏香兔耳風藥材中咖啡醯奎寧酸類成分對宮頸炎動物 模型具有明顯改善作用，並具有明顯抗耐藥菌等作用，無明顯急性毒性作用，可見將其進一 步開發成具有抗耐藥菌株作用的抗宮頸炎藥物，具有廣闊的市場前景。
圖1杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類成分測定標準曲線圖。圖2對照品HPLC圖。圖3杏香兔耳風提取物HPLC圖。圖4 宮頸炎模型大鼠病理組織切片。
具體實施例方式藥效成分含量測定
(1)杏香兔耳風提取物中咖啡醯奎寧酸類成分含量測定 對照品溶液製備
取3，5_ 二咖啡醯基奎寧酸對照品適量，置於棕色容量瓶，加50%甲醇製成濃度為 0. 041mg/ml的溶液，備用。標準曲線的繪製
精密移取對照品溶液0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. Oml,分別置於IOml容量瓶中，加甲醇 定容至刻度，搖勻。在328nm處的吸光度，以吸光度Y對質量濃度X(mg/ml)繪製標準曲線。 得到回歸方程:Y=0. 279Χ+0. 016，R2=O. 999。標準曲線如附圖1。樣品測定與對照品的測定方法相同。(2)咖啡醯奎寧酸類有效成分含量測定
色譜條件色譜柱:Diamonsil(5ymX4. 6 mmX250 mm);柱溫:30°C;檢測波長:328nm ； 流速lml/min ；流動相乙腈一0.覬磷酸梯度洗脫(0 min， 20:80 ； 8min, 21:79 ； llmin, 23:77)。對照品溶液的製備
精密稱取3-咖啡醯基奎寧酸、3，5-二咖啡醯基奎寧酸、對照品適量，加50%乙醇製成每 1 mL含3-咖啡醯基奎寧酸0. 034mg/mL,3, 5- 二咖啡醯基奎寧酸0. 0425mg/mL的混合對照 品溶液，備用。對照品HPLC結果見附圖2。按上述色譜條件，對樣品進行測定，其HPLC結果見附圖3。實施例1
取杏香兔耳風乾燥藥材lOOOg，切斷(2 5cm)，用10倍的50%乙醇，85°C加熱回流提取 3次，過濾，合併得提取液A，6 0°C減壓濃縮至提取液A的1/6倍，即得到濃縮液B。濃縮液 B用稀鹽酸調pH至2，將酸性濃縮液B經已處理好的大孔吸附樹脂AB-8，先用去離子水衝洗樹脂，用20%乙醇洗脫2個柱體積，然後用50%乙醇洗脫10個柱體積，收集乙醇濃度50% 洗脫液，經60°C減壓濃縮去醇，得濃縮液C，濃縮液C再用稀鹽酸調pH至2，經大孔吸附樹 脂HPD-826，先用去離子水衝洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為50%洗脫 液，合併，經真空乾燥，即得杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物20g，其UV含量70%，HPLC含 量52%。其中3-咖啡醯基奎寧酸含量為15%，3，5-二咖啡醯基奎寧酸含量為13%。實施例2
杏香兔耳風乾燥藥材lOOOg，切斷(2 5cm)，用15倍的60%乙醇，85°C加熱回流提取3 次，過濾，合併得提取液A，6 0°C減壓濃縮至提取液A的1/7倍，即得到濃縮液B。濃縮液用B 稀鹽酸調PH至1，將酸性濃縮液B經已處理好的大孔吸附樹脂HPD-826，先用去離子水衝洗 樹脂，用30%乙醇洗脫2個柱體積，然後用60%乙醇洗脫8個柱體積，收集乙醇濃度60%洗脫 液，經60°C減壓濃縮，得濃縮液C，濃縮液C再用稀鹽酸調pH至1，經大孔吸附樹脂HPD-826， 先用去離子水衝洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為60%洗脫液，合併，經 真空乾燥，即得杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物16g，其UV含量79%，HPLC含量55%，其 中3-咖啡醯基奎寧酸含量為19%，3，5-二咖啡醯基奎寧酸含量為15%。實施例3
杏香兔耳風乾燥藥材lOOOg，切斷(2飛cm)，用20倍的70%乙醇，85°C加熱回流提取3 次，過濾，合併得提取液A，6 0°C減壓濃縮至提取液A的1/8倍，即得到濃縮液B。濃縮液B 用稀鹽酸調PH至3，將酸性濃縮液B經已處理好的大孔吸附樹脂HPD-826，先用去離子水衝 洗樹脂，用30%乙醇洗脫2個柱體積，然後用70%乙醇洗脫6個柱體積，收集乙醇濃度70% 的洗脫液，經60°C減壓濃縮，得濃縮液C，濃縮液C再用稀鹽酸調pH至3，經大孔吸附樹脂 HPD-826,先用去離子水衝洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度70%的洗脫 液，合併，經真空乾燥，即得杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物12g。咖啡醯奎寧酸類提取物 的UV含量為74%，HPLC含量50%，其中3-咖啡醯基奎寧酸含量為13%，3，5- 二咖啡醯基奎 寧酸含量為10%。實施例4
採用苯酚膠漿造模後進行杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物抗宮頸炎實驗研究。杏香 兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物高、中、低劑量組及陽性組大鼠每天灌予對應藥物，共10天。 經10天給藥後，各大鼠眼球取血測白細胞總數，處死動物立即取陰道、子宮稱重並於福爾 馬林溶液中固定。結果見表1，陽性組(噴哚美辛)及杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物組均有降低 模型大鼠子宮器指數的作用；陽性藥及杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物組對宮頸炎模型 大鼠白細胞總數具有顯著的抑制作用；組織病理學檢查結果見附圖4，正常組陰道、宮頸組 織無病理學改變，而模型組陰道明顯的上皮脫落，宮頸黏膜增厚、嗜酸性粒細胞浸潤；與模 型組比較陽性組的嗜酸性粒細胞明顯減少，上皮無脫落無增厚；杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸 類提取物高劑量組嗜酸性粒細胞明顯減少，上皮無脫落無增厚；中劑量組子宮少量嗜酸性 粒細胞浸潤，陰道上皮有一定脫落；低劑量陰道上皮無見明顯脫落，與模型組比較宮頸嗜酸 性粒細胞浸潤無明顯改變。
權利要求
1.杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物，其特徵在於提取物中藥理活性成分以3-咖啡 醯基奎寧酸、3，4-二咖啡醯奎寧酸、3，5-二咖啡醯奎寧酸、4，5-二咖啡醯奎寧酸為主；提取 物以總咖啡醯奎寧酸類成分計算，UV含量為70%以上，HPLC含量為50%以上，其中3-咖啡 醯基奎寧酸和3，5- 二咖啡醯奎寧酸含量均高於10%。
2.權利要求1所述杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵是所述提取 物通過以下步驟製備a)取杏香兔耳風乾燥藥材，切段，用5 20倍體積的濃度為4(Γ80%的乙醇在6(TlO(TC 下加熱回流提取2、次，每次1-3小時，過濾，合併得提取液A ；b)提取液A經4(T60°C減壓濃縮至1/Γ1/8倍，即得到濃縮液B；c)濃縮液B用稀鹽酸調pH至到廣3，將酸性濃縮液經大孔樹脂吸附，先用去離子水 衝洗樹脂，再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為50 70%之間的洗脫液，經40 60°C減壓濃縮去醇後，得濃縮液D ；d)再將濃縮液D用稀鹽酸調pH至到1 3，經大孔樹脂吸附，先用去離子水衝洗樹脂， 再用水-乙醇依次梯度洗脫，收集乙醇濃度為40 70 %之間的洗脫液，合併，真空乾燥，即 得杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物。
3.根據權利要求加所述的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在 於步驟a)所述的乙醇濃度為50%。
4.權利要求2所述的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在於所述 的大孔樹脂選自AB-8、HPD-400、NKA-9和HPD-擬6。
5.權利要求2或4所述的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物的製備方法，其特徵在於 所述的大孔樹脂為HPD-826。
6.一種藥物組合物，其特徵在於包含權利要求1所述的提取物和藥學上可接受的輔料。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於所述藥物組合物的劑型為片劑、膠 囊、顆粒劑、散劑、丸劑、浸膏劑、口服液或糖漿劑。
8.權利要求1所述的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物在製備抗炎、抗細菌、抗耐藥 菌株的藥物中的應用。
9.權利要求1所述的杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類提取物在製備抗宮頸炎的藥物中的 應用。
全文摘要
本發明涉及一種杏香兔耳風咖啡醯奎寧酸類為主的提取物及其製備方法與應用，杏香兔耳風藥材經乙醇回流提取，過濾濃縮去醇，鹽酸調pH至1~3，上大孔吸附樹脂，水洗後乙醇梯度洗脫，收集乙醇濃度為50~70%之間的洗脫液，濃縮去醇，再用鹽酸調pH至1~3後，上大孔吸附樹脂，依次用水-乙醇梯度洗脫，收集乙醇濃度為40~70%之間的洗脫液，合併，真空乾燥即得本發明的提取物，其咖啡醯奎寧酸類提取物的UV含量可達70%以上，HPLC含量可達到50%以上，3-咖啡醯基奎寧酸和3,5-二咖啡醯奎寧酸均可達10%以上。其具有抗炎、抗細菌、抗耐藥菌株等作用，對宮頸炎大鼠病變組織有較好的改善，對子宮指數及白細胞數量有明顯的降低作用，可單獨或與其它藥物配合開發成治療宮頸炎藥物。
文檔編號A61P29/00GK102100720SQ20111003836
公開日2011年6月22日 申請日期2011年2月15日 優先權日2011年2月15日
發明者孫勇兵, 張武崗, 楊世林, 羅曉健, 陳蘭英, 魏慧珍, 黃愷 申請人:江西本草天工科技有限責任公司