可光硫化的藥糖氨基聚糖衍生物，交聯葡糖氨基聚糖及其生產方法

2023-05-12 21:08:06

專利名稱：可光硫化的藥糖氨基聚糖衍生物，交聯葡糖氨基聚糖及其生產方法
技術領域：
本發明涉及通過將一光反應活性的化合物以化學方法連接到一葡糖氨基聚糖(以後有時縮寫為「GAG」)上而製備的各種可光硫化的葡糖氨基聚糖，和通過使所述衍生物進行光化反應使光反應活性化合物進行二聚而得到的具有三維網狀結構的交聯葡糖氨基聚糖，涉及製備它們的方法，進一步地，涉及含有它們的醫用的良好生物相容材料。
含有疏水聚合物體系以進行光二聚作用而交聯的可光硫化的樹脂迄今已被尤其用於平版印刷，繪畫和印刷。相反，只有很少的已知例子其中親水聚合物被光交聯。
另一方面，人們曾試圖通過醛、環氧化合物、二乙烯基碸化合物等交聯GAGs，它們是典型的親水聯合物，以延長GAGs在體內的作用，或用於製備作醫用的以膜或粉末形式的材料，例如用於防止組織粘連。然而，由於GAGs是大分子，而形成的交聯的GAGs衍生物的分子量更高，這使得從交聯的GAG衍生物中完全除去未反應物和/或催化劑十分困難。因而當給生物體給藥或移植時，所述衍生物將不斷產生副作用，故它們不適於實際應用。另外，交聯的GAG衍生物以凝膠或固體存在，因而在交聯後不易塑模，故不適於實際應用。此外，至於它們在持續或受控制釋放的藥物製劑(JP-A-62-129226對應於美國專利5128326;這裡所用的述語「JP-A」表示未審查的日本公開特許)中作載體時，活性成份的持續釋放只有利用交聯的GAG衍生物的粘性才能獲得，這一缺點使得它們不適於實際應用。這些方法和交聯的GAG衍生物很難控制藥物的釋放速度。
已知通過微生物或植物衍生的多糖如支鏈澱粉，直鏈澱粉和甘露聚糖的羥基與作為光二聚功能基的肉桂醯基酯化而製備的光敏材料可用作吸附劑，酶載體或色譜的載體或用於生產PS板或光刻膠或其它應用[JP-B-56-14969，對應於美國專利 3960685，(這裡所用的述語「JP-B」表示審定的日本特許)，JP-A-60-219202]。
然而，上述光敏材料有一個保證安全性的問題，難以控制細胞粘接且在人體內的生物共容性差，因而它們不適於用作直接應用於生物體的醫用材料，尤其是人造器官，用於覆蓋傷口或外科中的醫用產品，藥物製劑中的載體，或用於其它醫療的其它材料。
據此，本發明的一個目的是提供可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物和從其衍生的交聯的葡糖氨基聚糖，它具有高度的安全性和生物相容性。
本發明的另一目的是提供一製備在需要時容易塑模，例如通過用溶劑鑄造，的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物的方法，通過該方法，尤其將產生副作用的未反應物可以容易地除去，以及一種從其生產交聯的GAGs的方法。
本發明的第三個目的是提供醫用的材料，它們以所述的可硫化的GAG衍生物或交聯的GAGs為基礎，並可廣泛應用於各種目的。
本發明的第四個目的是提供含有交聯的葡糖氨基聚糖的無粘性防護材料，它與組織粘連但隨創傷癒合的速度而生物降解，它們的機械強度可以根據應用部位的機械張力而容易地調節，以及含有在體內經光照射時容易轉化成交聯的葡糖氨基聚糖的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物的無粘性防護材料。
本發明的第五個目的是提供用於實現受控藥物釋放的材料或製劑，它們含有交聯的葡糖氨基聚糖並使藥物釋放的速率適合於其中包括，夾帶或包埋的藥物，並適合於藥物應用的目的，以及含有可光硫化的葡糖氨基聚糖的用於實現受控藥物釋放的材料，在上述材料或製劑中用作載體或作為原料。
本發明提供一種可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物(以後有時簡稱為「可光硫化的GAG」)它包括一葡糖氨基聚糖的與其結合的光反應活性化合物，以及交聯的葡糖氨基聚糖(以後有時簡稱為「交聯的GAG」)，它通過使所述可光硫化的GAG與所述光反應活性化合物進行交聯反應而製備。所述可光硫化的GAG最好通過使葡糖氨基聚糖的羥基或羧基與光反應活性化合物的酯化反應，通過活化葡糖氨基聚糖的羧基並使該活化的羧基與光反應活性化合物醯胺化，或通過使葡糖氨基聚糖的羧基與光反應活性的化合物在縮合劑的存在下醯胺化而製備。交聯的葡糖氨基聚糖可通過用光照射可光硫化的GAG，由此引發光反應活性化合物部分之間的交聯反應而製備。以所述交聯的GAG為基礎的材料適於醫用。給出所述交聯的GAG的可光硫化的GAG也可用作醫用材料。
附

圖1給出在實施例1中用於測定結合的肉桂酸的量的1H-NMR光譜。
附圖2給出UV/VIS光譜，說明實施例1中所製備交聯的透明質酸膜曝光時在279nm的衰減吸收。
附圖3圖示了接觸角與在各種交聯的透明質酸膜中肉桂酸殘基取代度(DS)的關係。
附圖4圖示了溶脹性與在各種交聯的透明質酸膜中肉桂酸殘基的DS之間的關係。
附圖5包括顯示細胞形態的照片，它說明隨著在交聯的透明質酸膜中肉桂酸殘基DS的不同而引起內皮細胞粘著的不同。
附圖6圖示了在硫酸軟骨素-肉桂酸酯(組分CS-Cin-2)光硫化時凝膠化程度(%)與其在PBS溶液中濃度的關係。
附圖7圖示了在交聯的硫酸軟骨素凝膠形成中的凝膠化程度(%)及溶脹度與硫酸軟骨素-肉桂酸酯(組分CS-Cin-3)在PBS中曝光時間的關係。
附圖8圖示了在交聯的硫酸軟骨素凝膠形成中的凝膠化程度(%)及溶脹度與肉桂酸殘基的DS的關係。
附圖9圖示了溶脹度與交聯的硫酸軟骨素膜中DS的關係。
附圖10圖示了接觸角與實施例8中得到的交聯的硫酸軟骨素膜中肉桂酸殘基的DS的關係。
附圖11圖示了胸腺嘧啶二聚物形成百分數與在實施例14中通過將HA-Thym-1曝露於紫外線中以形成交聯的透明質酸膜的過程中UV(紫外線)照射時間的關係。
附圖12圖示了1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶/HA摩爾比與實施例16合成的HA-Thym的DS之間的關係。
附圖13圖示了1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶/CS摩爾比與實施例17合成的CS-Thym的DS之間的關係。
附圖14圖示了實施例18中胸腺嘧啶吸收(於270nm)變化與CS-Thym膜曝光過程的照射時間之間的關係。
附圖15圖示了實施例18中凝膠化程度(%)與CS-Thym膜曝光過程中的照射時間之間的關係。
附圖16圖示了實施例18中凝膠化程度(%)與另一CS-Thym膜曝光過程中照射時間之間的關係。
附圖17圖示了實施例18中溶脹度與HA-Thym膜曝光過程中照射時間之間的關係。
附圖18圖示了實施例18中溶脹度與HA-Thym膜曝光前後的DS之間的關係。
附圖19給出了實施例20中製備的硫酸軟骨素-(7-香豆氧基)乙酸酯的1H NMR譜。
附圖20圖示了醯基氯形式香豆素/硫酸軟骨素羥基(CS-OH)摩爾比與酯形式的DS之間的關係。
附圖21圖示了在實施例21中香豆素的吸收(在320nm)變化與硫酸軟骨素-(7-香豆氧基)乙酸酯薄膜曝光照射時間之間的關係。
附圖22圖示了實施例21中溶脹度與硫酸軟骨素-(7-香豆氧基)乙酸酯薄膜曝光照射時間之間的關係。
附圖23圖示了實施例21中溶脹度與硫酸軟骨素-(7-香豆氧基)乙酸酯薄膜曝光時的DS之間的關係。
附圖24圖示了實施例21中凝膠化程度(%)與硫酸軟骨素-(7-香豆氧基)乙酸酯薄膜曝光時間之間的關係。
附圖25圖示了實施例21中凝膠化程度(%)與含有所述酯的薄膜在曝光時硫酸軟骨素-(7-香豆氧基)乙酸酯的濃度之間的關係。
附圖26圖示了從具有如實施例28中測定的10%或50%的藥物含量的光交聯的HA-Thym膜(DS＝0.7)釋放藥物的速率，與時間的函數關係，所述的速率以吸收度(在269nm)的變化來表示。
附圖27圖示了從具有如實施例28中測定的10%或50%的藥物含量的光交聯的HA-Thym膜(DS＝2.2)釋放藥物的速度，作時間的函數，所說的速度以吸收度(在269nm)的變化表示。
附圖28圖示了從具有如實施例28中測定的10%或50%的藥物含量光交聯的CS-Thym膜(DS＝0.8)釋放藥物的速度作時間的函數，所說的速度以吸收度(在269nm)的變化來表示。
附圖29圖示了從具有如實施例28中測定的10%或50%的藥物含量的光交聯的CS-Thym膜(DS＝1.3)釋放藥物的速度作時間的函數，所說的速度以吸收度(在269nm)的變化來表示。
附圖30圖示了從具有如實施例28測定的10%或50%的藥物含量的光交聯的CS-Thym膜(DS＝1.8)釋放藥物的速度作時間的函數，所說的速度以吸收度(在269nm)上的變化來表示。
這裡所用的術語「醫用材料」包括，尤其用於製備用於治療目的的診斷器的醫用設備或人造器官(人造血管，人造心臟，人造皮膚，等)的材料，構成創傷覆蓋物，修復術的材料，無粘性材料或用於控制藥物釋放的器材，及人造細胞外基質或在形成混合人造器官時用於內皮細胞，上皮細胞和平滑肌細胞的粘附和繁殖的人造基膜。
本發明的可光硫化的GAG最好具有由下面給出的式[1]至[5]中之一代表的部分結構，當進行光反應時，給出交聯的GAG。在所述各式的下面，給出了相應的反應類型，其中gag表示任何葡糖氨基聚糖的部份結構，R1是光反應活性基團(即含有至少一個1，2-亞乙烯基的基團)，而R1-COOH，R1-NH2和R1-OH分別表示光反應活性化合物。
R2a代表由具有與gag-OH(如HOOC-R3-COOH，HOOC-R3-NH2)反應能力的間隔基和光反應活性化合物的功能基衍生出的基團。 gag-OH÷HOOC-R3-COOH→gag-O-CO-R3-COOH[D-1-a] gag-O-CO-R3-COOH÷R1-OH→gag-O-CO-R3-CO-O-R1＝[4a][D-1-b] gag-O-CO-R3-COOH÷R1-NH2→gag-O-CO-R3-CO-NH-R1＝[4b][D-2] gag-OH÷HOOC-R3-NH2→gag-O-CO-R3-NH2[D-2-a] gag-O-CO-R3-NH2÷R1-COOH→gag-O-CO-R3-NH-CO-R1＝[4c][E] gag-CO-R2b-R1[5]
R2b代表由具有與gag-COOH(如HO-R3-COOH，HO-R3-OH，HO-R3-NH2，H2N-R3-NH2，H2N-R3-COOH)反應能力的間隔和光反應活性化合物的功能基衍生出的基團。[E-O-a] H2N-R3-NH2÷R1-COOH→H2N-R3-NH-CO-R1gag-COOH÷H2N-R3-NH-CO-R1[F-1]→gag-CO-NH-R3-NH-CO-R1＝[5-1][E-O-b] RNH-R3-NH2÷R1-COOH→RNH-R3-NH-CO-R1[F-2]RNH-R3-NH2-CO-R1[F-2]→H2N-R3-NH-CO-R1gag-COOH÷H2N-R3-NH-CO-R1[F-1] or[F-2]→gag-CO-NH-R3-NH-CO-R1＝[5-1]R is a protective group. gag-COOH÷HO-R3-COOH→gag-CO-O-R3-COOH[E-1-a] gag-CO-O-R3-COOH÷R1-OH→gag-CO-O-R3-CO-O-R1＝[5a][E-1-b] gag-CO-O-R3-COOH÷R1-NH2→gag-CO-O-R3-CO-NH-R1＝[5b][E-2] gag-COOH÷HO-R3-OH→gag-CO-O-R3-OH[E-2-a] gag-CO-O-R3-OH÷R1-COOH→gag-CO-O-R3-O-CO-R1＝[5c][E-3] gag-COOH÷HO-R3-NH2→gag-CO-O-R3-NH2[E-3-a] gag-CO-O-R3-NH2÷R1-COOH→gag-CO-O-R3-NH-CO-R1＝[5d] gag-COOH÷H2N-R3-OH→gag-CO-NH-R3-OH[E-4-a] gag-CO-NH-R3-OH÷R1-COOH→gag-CO-NH-R3-O-CO-R1＝[5e][E-5] gag-COOH÷H2N-R3-NH2→gag-CO-NH-R3-NH2[E-5-a] gag-CO-NH-R3-NH2÷R1-COOH→gag-CO-NH-R3-NH-CO-R1＝[5f][E-6] gag-COOH÷H2N-R3-COOH→gag-CO-NH-R3-COOH[E-6-a] gag-CO-NH-R3-COOH÷R1-OH→gag-CO-NH-R3-CO-O-R1＝[5g][E-6-b] gag-CO-NH-R3-COOH÷R1-NH2→gag-CO-NH-R3-CO-NH-R1＝[5h]R3優選地為下列之一R3a:-(CH2)n-(n＝1至10);
R3b:-(CH2)p CHY-(Y為COOH或NH2以及p為1至10);
R3c-(CH2)m-C8H4-(CH2)l-(m＝1至10，1＝1或10)。
儘管在上面的例子中，只用了一個間隔基，但也可用多個間隔基。
在製備式[4b]，[5b]或[5h]產物時，上述光反應活性的化合物[F-1]或[F-2]可用於代替R1-NH2。
原則上，作為光反應活性基團的R1可以是任意基團，條件是它至少在曝光時進行分子間和/或分子內二聚形成環丁烷環。
在上述各式中，-COOH可以能與羥基或氨基反應的反應活性衍生物的形式(例如滷化物，酸酐，活性酯)存在。
作為在式[1]，[4c]，[5c]至[5f]，等中存在的R1-CO-的特別優選的例子，可以是具有下述結構的基團
其中R4的R5可以相同或不同，各自為氫原子或低級烷基或低級烷氧基或硝基或氨基;
其中R6為氫或滷原子或低級烷基或滷代低級烷基，R7為氫或滷原子或氰基，羧基，低級烷氧羰基，低級烷基或滷代低級烷基，而R8為低級亞烷基;
其中R9，R10和R11可以相同或不同，各自獨立地為氫原子或低級烷基，而R12為低級亞烷基。
上述式[6]至[8]的基團作為與式[2]的相應的R1a-CO-NH-R3-NH中的R1a-CO-(R1a為光反應活性基團)及作為式[5-1]中的R1-CO-是特別優選的，而R3a或R3b優選作為R3。當R3為R3b時，COOH優選作為y。
作為式[3]，[4a]，[5a]，[5g]，等中的R1-O-優選例子，可以是具有下述結構的殘基
其中R13是氫或滷原子或低級烷基或滷代低級烷基，R14為氫或滷原子或氰基，羧基，低級烷氧羰基，低級烷基或滷代低級烷基，而R15為低級亞烷基;
其中R16和R17可以相同或不同，各自為氫原子或低級烷基或低級烷氧基或硝基或氨基。
下面舉例給出的式子的基團也可作為R1的構成單元
本發明可光硫化的GAG在曝光時可分子間二聚，於是包含在光反應活性化合物分子中的光反應活性基團(至少含有一個乙烯基的基團)成對反應，以下面給出的方程形成環丁烷環，給出相應的交聯的GAG，它們具有二或三維網狀結構，具有所需的交聯度。分子內的二聚也與光硫化有關。
因此，根據本發明，具有所需交聯度，因而具有所需物理性質(例如，機械結構支撐性，水保留性，親水性，潤滑性，藥物釋放速度)和適於其應用的所需生物學性質(例如細胞粘連，生物降解性-吸收性、生理活性)的生物相容的光交聯GAGs可通過選擇或控制光反應活性化合物和GAG(例如化學結構，分子量等)和其中的光反應活性化合物的含量(由光反應活性化合物取代的程度(DS))而形成。這裡所用的術語「取代程度(DS)」定義為連接在GAG中每個重複的二糖單元(每單元含一個糖醛酸和一個己糖胺)上的光反應活性化合物或基團的摩爾數。因而，例如，每個這種二糖元具有4個羥基(可取代的羥基)的透明質酸當用光反應活性的化合物或基團在所有羥基上連接時，給出DS為4，而硫酸軟骨素每個二糖單元中的三個羥基被光反應活性化合物或基團完全連接時產生的DS為3。
這裡所用的術語「葡糖氨基聚糖」或「GAG」包括多聚乙醯神經氨糖酸，透明質酸(HA)，軟骨素，硫酸軟骨素(CS)，糖醛酸磷壁酸質，硫酸皮膚素，肝素，硫酸乙醯肝素，硫酸角質(硫酸角質素)，多硫酸解質，幾丁質，脫乙醯幾丁質，及它們的衍生物(醯化衍生物，多硫酸化物，去硫酸產品，去醯化產品，等)。術語「低級」指上述的碳鏈，可以是直鏈或支鏈的，由1至6個碳原子組成。術語「滷原子」包括氯，溴和碘原子以及術語「滷代」用於指一個或多個氫原子被這些滷原子取代。
在式[6]與式[1]，[4c]，[5-1]，[5C]至[5f]等的結合體中，R1CO-為，例如，由取代的或未取代的肉桂酸或其反應活性衍生物衍生的殘基。作為取代的肉桂酸殘基，它們是那些在苯環的任何位置上有一或二個低級烷基，低級烷氧基，硝基或氨基的基團。然而，從肉桂酸衍生的R1CO-是特別優選的。
在式[7]與式[1]，[4C]，[5-1]，[5C]至[5f]，等的結合體中，R1CO-為，例如，由在1-位有一個羧基烷基作為取代基的尿嘧啶衍生物或其反應活性衍生物衍生的殘基，在嘧啶環的5-位有由R6表示的氫或滷原子或低級烷基或滷代低級烷基，在6-位有由R7表示的氫或滷原子或氰基，羧基，低級烷氧羰基，低級烷基或滷代低級烷基，而低級亞烷基R8是由羧基烷基衍生的，並與gag的羥基在1-位形成酯鍵。尤其由1-(2-羧基乙基)胸腺嘧啶衍生的R1CO-是優選的。
在式[8]與式[1]，[4C]，[5-1]，[5C]至[5f]，等的結合體中，R1CO-為，例如，由在7-羧基烷氧基取代的香豆素衍生物或其反應活性衍生物衍生的殘基，在香豆素環的5，6和8位各自獨立地有分別由R9，R10，R11表示的氫原子或低級烷基，相應地在7位，有由羧基烷氧基衍生的低級亞烷基R12，並與gag的羥基形成酯鍵。特別優選的R1CO-基團是由7-香豆氧基乙酸衍生的基團。
在式[10]與式[3]，[4a]，[5a]，[5g]，等的結合體中，R1O-是由在1-羥基烷基取代的尿嘧啶衍生物或其反應活性衍生物衍生的殘基，在嘧啶環的5位有由R13代表的氫或滷原子或低級烷基或滷代低級烷基，在6位有由R14代表的氫或滷原子或氰基，羧基，低級烷氧羰基，低級烷基或滷代低級烷基，在1位有由羥基烷基衍生的低級亞烷基R15，並與gag的羧基形成酯鍵。
在式[Ⅱ]與式[3]，[4a]，[5a]，[5g]，等的結合體中，R1O-為，例如，由取代或未取代的肉桂基醇或其反應活性衍生物衍生的殘基。取代的肉桂基醇殘基為，例如，在苯環的任何位置有一或兩個低級烷基，低級烷氧基，硝基或氨基的基團。
原起始化合物GAGsGAGs不限其來源或分子量。根據所需目的而選擇的GAGs既可以單獨使用也可以其兩種或多種的混合形式使用。但通常使用天然來源(動物器官提取物，發酵產品、等)的GAGs，需要時也用化學或酶促合成的GAGs或用半合成方法合成的GAGs。通過改變上述這些GAGs官能團而衍生的產物也可使用。
GAG可以原有形式與光反應活性化合物反應，但經常使用的形式為其與鹼金屬如鈉，鉀等，鹼土金屬如鎂，鈣，等，叔胺如三正丁基胺，三乙胺、吡啶，等形成的鹽。
當與GAG鍵合的光反應活性化合物不溶於水時，將光反應活性的化合物加到含有GAG的有機溶劑中進行反應。
含有GAG的有機溶劑是這樣製備的例如，通過用陽離子交換劑處理GAG鈉鹽的水溶液形成羧酸根或硫酸根，將它們加到可與水混溶的有機溶劑[例如二甲基甲醯胺(DMF)，二甲亞碸(DMSO)，六甲基磷醯胺(HMPA)，吡啶，等]和叔胺(例如三正丁基胺)中形成GAG的銨鹽再蒸去水。
當光反應活性化合物是水溶性時，反應可通過將光反應活性化合物加到GAG(如鈉鹽)的水溶液中而進行。
光反應活性化合物如前所述被用於與GAGs或連接或可連接到GAGs上的間隔基的-OH，-COOH或-NH2這類基團成鍵的光反應活性化合物，具有-OH，-COOH或-NH2這類基團。
(1)當-COOH為功能團時光反應活性的化合物以酯的形式連接在GAGs或間隔基上，如式[1]，[5-1]，[5c]，[5d]，[5e]和[5f]，包括具有其中的OH或滷素，例如，連接在式[6]至[8]的基團上的化學結構的化合物，即為取代或未取代的肉桂酸，1-羧基烷基-取代的尿嘧啶和7-羧基烷氧基取代的香豆素(7-香豆氧基羧酸)，和其反應活性衍生物。作為反應活性衍生物，可以是醯基滷(如醯氯等)和酸酐。
上述7-香豆氧基羧酸的醯滷可通過將相應的，任意取代的7-羥基香豆素與滷代羧酸酯在鹼存在下縮合併水解產生的7-香豆氧基羧酸酯而得到7-香豆氧基羧酸，或通過將相應的任意取代的7-羥基香豆素與滷代羧酸縮合得到7-香豆氧基羧酸，然後將這樣得到的，對應於式[8]，可任意地帶有一個或多個取代基的7-香豆氧基羧酸與亞硫醯滷(參見如 JP-A-3-48674)反應而合成。
(2)當-NH2為功能團時下面給出的式[F-1]的光反應活性化合物可以這樣得到將前述取代或未取代的肉桂酸，1-羧基烷基取代的尿嘧啶或7-羧基烷氧基取代的香豆素(7-香豆氧基羧酸)，或其反應活性衍生物與式[X-1]化合物或通過將其氨基用叔丁氧羰基或苄氧羰基之類的氨基保護基保護而衍生的式[X-2]化合物反應，如果需要再去保護。
(3)當-OH為功能團時相應於式[9]的反應活性衍生物可用作光反應活性化合物。例如，可用在嘧啶環的1和2位間形成的環狀醚化合物。具體例子有1，2-O-橋亞乙基尿嘧啶，1，2-O-橋亞乙基胸腺嘧啶，1，2-O-橋亞乙基-5-氯尿嘧啶，1，2-O-橋亞乙基-5-三氯甲基尿嘧啶，1，2-O-橋亞乙基-6-氰基尿嘧啶，1，2-O-橋亞乙基-6-氯甲基尿嘧啶和1，2-O-橋亞乙基-6-三氯甲基尿嘧啶。
也要提到對應於式[10]的取代或未取代的肉桂基醇。
(4)優選的光反應活性化合物儘管根據所需目的，所用的光反應活性化合物應從上述那些化合物中選擇，但從醫用觀點上優選的是由既使當以未反應形式保留在交聯的GAGs中也最不可能產生副作用的化合物，如肉桂酸，胸腺嘧啶和香豆素衍生出的光活性化合物。
在本發明的實際應用中，可光硫化的GAGs可含有一個或多個連接在同一個GAG分子或多個不同的GAG分子上的光反應活性化合物。這也適用於上面的式[1]至[3]。因此，應注意到本發明的交聯的GAGs在其意義上包括通過這類可光硫化的GAGs的交聯得到的產物。(1)與gag-OH的酯化反應將一合適的GAG的叔胺鹽(例如三正丁基胺鹽，三乙胺鹽，吡啶鹽，等)，溶於一合適的溶劑(例如DMF，吡啶，DMSO，HNPA，等)，GAG的羥基與具有式[6]部分結構的取代或未取代的肉桂酸，以每摩爾GAG的羥基0.5至5摩爾的量，或其反應活性衍生物，例如醯滷，在鹼性催化劑(例如無水吡啶等)存在下進行酯化反應，或用具有式[7]或[8]部分結構的R1COOH或其反應活性衍生物在鹼性催化劑(例如2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，吡啶，等)，在0至100℃，優選70至90℃，反應幾十分鐘至幾十小時，優選1至10小時酯化，給出本發明的可光硫化的GAG。
根據需要，每種可光硫化的GAG中的取代度(DS)可通過控制反應條件而控制。例如，DS可通過增加R1COOH或其反應活性衍生物相對起始GAG的摩爾比和/或延長反應時間而增加。
反應後，往反應混合物中加入例如乙酸鈉飽和乙醇，乙醇，或甲醇，過濾收集產生的沉澱，用乙醇或甲醇洗滌，然後減壓乾燥，這樣所需產品可以白色粉末的形式得到。
產生式[5c]或[5e]化合物的反應可以與上述基本相同的方式進行。
這樣得到的，其中每個二糖單元由一分子光反應活性化合物取代的可光硫化的GAG的一些具體例子以單元的結構式在下面示出。結構不同的結構單元，例如在所鍵合的光反應活性基團的數目上和/或其鍵合位置上不同的單元可以出現在同一分子中。
1)由將肉桂酸引入透明質酸產生的可光硫化的GAG(HA-Cin)
2)由將1-(2-羧基乙基)胸腺嘧啶引入透明質酸產生的可光硫化的GAG(HA-Thym)
3)由將7-香豆氧基乙酸引入硫酸軟骨素中產生的可光硫化的GAG
(2)用gag-COOH醯胺化[尤其是當光反應活性化合物被連到間隔基上時];參見式[5-1](2-1)當R3＝R3a時當式[X-1]或[X-2]的化合物為亞烷基二胺(如1，2-乙二胺)時，將GAG的合適叔胺鹽(如三正丁基胺鹽，三乙胺鹽，吡啶鹽，等)如上面方法(1)溶於適當溶劑(如DMF，吡啶，DMSO，HMPA，等)，然後加入相對於GAG的羧基摩爾數稍過量的羥基化合物(如N-羥基琥珀醯亞胺，N-羥基鄰苯二甲醯亞胺，等)，和縮合劑(如二環己基碳二亞胺，1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺，等)，反應在0至50℃進行1至20小時，給出其羧基被活化改進的GAG。然後將該改進的GAG與式[F-1]或[F-2]化合物的氨基在0至50℃進行醯胺化反應30分鐘至20小時，給出可光硫化的GAG。
可光硫化的GAG也可通過用GAG的水溶液並使式[F-1]或[F-2]化合物的氨基與GAG的羧基在縮合劑[如水溶性碳二亞胺如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺]的存在下於0至50℃進行醯胺化反應1至20小時而製備。
(2-2)當R3＝R3b(Y＝COOH)當式[X-1]或[X-2]化合物為例如鹼性胺基酸(例如L-賴氨酸)時，GAG以水溶液的形式使用，式[F-1]或[F-2]化合物的氨基與GAG的羧基在0至50℃於縮合劑[例如水溶性碳二亞胺如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺]存在下進行醯胺化反應而給出可光硫化的GAG。
可光硫化的GAG也可以象方法(2-1)中那樣，通過GAG以合適的叔胺鹽的形式與羥基化合物如N-羥基琥珀醯亞胺在合適的溶劑如DMF中在縮合劑如二環己基碳二亞胺存在下反應，並使產生的在其羧基上活化的GAG與式[F-1]或[F-2]化合物的氨基進行醯胺化反應而製備。
與式[2]，[4b]，[5b]或[5h]有關的反應可以基本上與前述相同的方式進行。
(3)與gag-COOH的酯化作用與前述方法(1)相似，將合適的GAG叔胺鹽(例如三正丁基胺鹽，三乙胺鹽，吡啶鹽，等)溶於適當的溶劑(如DMF，吡啶，DMSO，HMPA，等)中，式[9]尿嘧啶衍生物的反應活性衍生物，例如環狀醚化合物，或取代或未取代的式[10]的肉桂基醇或其反應活性衍生物與GAG的羧基在0至100℃於鹼性催化劑(例如無水吡啶等)存在下進行酯化反應。
與式[4a]，[5a]或[5g]有關的反應可以基本與前述相同的方式進行。上述反應之後，所形成的可光硫化的GAGs可用任何通常用於分離和純化GAGs的方法來分離和純化，沒有任何特殊限制。
因而，例如，可光硫化的GAGs，即所要產物，可與未反應的GAGs或未反應的光反應活性化合物分離，並可這樣純化用陰離子或陽離子交換劑色譜的方法，利用其在有機溶劑中溶解性不同的方法(例如醇沉澱法)，鹽析或滲析。
當本領域已知的那些交聯的葡糖氨基聚糖以凝膠或固體存在，因而未反應物，催化劑，汙染的微生物，熱原和其它雜質很難從中除去，而本發明的可光硫化的GAGs由於可溶於水和/或有機溶劑因而可以較容易純化。由於這樣純化的可光硫化的GAGs在曝光時可發生光反應活性基團的分子間或分子內二聚作用，因而容易產生被未反應物，催化劑，汙染的微生物，熱原等最低程度汙染的交聯的GAGs。以上面方法合成和純化的可光硫化的GAGs的物理性質隨用作原料的GAG，其分子量，所用的光反應活性化合物，其用量及其它因素而變化，並可根據需要調節，使其適於預期的目的。一般地，它們的分子量範圍為4000至2，000，000，優選10，000至1，000，000，由光反應活性基團取代的程度(DS)範圍為0.1至4.0，優選0.1至3.0，並能溶於水和/或有機溶劑。溶解性可以根據需要控制。一般地，增加DS導致水溶性降低，但在有機溶劑如DMF中的溶解性增加。當光反應活性基為式[6]的肉桂酸衍生物，式[8]的7-香豆氧基羧酸或式[11]的肉桂基醇衍生物時，所得可光硫化的GAGs是相對疏水的。反之，當光反應活性基團為式[7]或式[10]的尿嘧啶衍生物(無其是胸腺嘧啶衍生物)時，產生的可光硫化的GAGs是相對親水的。
優選的DSs範圍隨可光硫化的GAG或交聯的GAG的預期用途，及所用的GAG和光反應活性化合物而變化。對於生產對細胞非粘連的交聯的GAGs並將它們用作組織的非粘連材料，例如，DS在透明質酸-肉桂酸酯(HA-Cin)的情況下，優選為約0.1至0.5，在硫酸軟骨素-肉桂酸酯(CS-Cin)的情況下約0.1至3.0，在透明質酸-胸腺嘧啶衍生物酯(HA-Thym)的情況下約0.2至1.0，在硫酸軟骨素-胸腺嘧啶衍生物酯(CS-Thym)的情況下約0.2至1.0。為了將生物物質，藥物等包埋在交聯的GAGs的三維網狀結構中，從而得到它們的控制釋放，1.0至2.5的DS對上述每個交聯的GAGs是優選的。
更準確地說，當可光硫化的GAG是式[1]的可光硫化的透明質酸衍生物時，分子量優選在100，000至1，000，000的範圍，而由光反應活性化合物的取代度(DS)優選在0.1至3.0的範圍。當可光硫化的GAG為式[1]的可光硫化的硫酸軟骨素衍生物時，分子量優選的範圍為10，000至60，000，而DS在0.1至3.0的範圍。
在用作醫用材料時，可光硫化的GAGs和交聯的GAGs可具有任何形式。因此它們可以各種形式應用，如溶液，凝膠，固體，等。基於所述可光硫化的GAGs或交聯的GAGs的本發明醫用材料根據需要可含有各種溶劑(如水，緩衝液，PBS，DMF，DMSO，等)，載體(如紗布，綿織或紡織纖維，非紡織纖維，軟填料或棉花狀材料，長絲或紗線，薄膜，多孔海綿，橡膠，塑料，金屬，人造器官，生物體組織表面，生物體的切口或傷口)，生物物質(膠原，明膠，肝素，硫酸軟骨素，透明質酸，硫酸皮膚素，等)，藥物，等等。對於用作醫用材料，可光硫化的GAGs可以塑模成特定形狀(膜狀，管狀，粒狀)或施加於，覆蓋在，粘貼或包埋其它物質或如上所述的載體材料在內。在這類情況下，可光硫化的GAGs在光反應之前將它們溶於水(優選淨化水)，緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝液，碳酸鹽緩衝液)或醫學上可接受級別的有機溶劑(例如，DMF，DMSO)，將該溶液在由玻璃，石英，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚氨基甲酸乙酯等製成的平板或表面或容器中放置或展開，並將其風乾或用其它方法乾燥來模塑，給出厚度為1μm至1mm的膜。交聯的GAGs可通過將用上述方法塑模的或溶液形式的可光硫化的GAGs在用於光交聯的射線或輻射曝光，從而引發光二聚反應而產生。所用波長或波長範圍隨光反應活性基團的性質而改變，但一般落在約260至400nm的範圍內。更準確地說，例如，高壓汞燈(450W)發出的光線可用於曝光(照射)，但應濾去波長短於260-270nm的射線。儘管所需的曝光(反應)時間隨波長範圍，溫度和離光源的距離等因素而變化，但優選能使反應在30分鐘內完成的條件。凝膠化(硫化)程度可通過在光反應時調節可光硫化的GAG的濃度而控制。通常，所述濃度為1至30%，優選為約2至20%。
由可光硫化的GAGs的光反應而產生的二聚物結構具體例子如下1)當光反應活性化合物是肉桂酸時
2)當光反應活性化合物為1-(2-羧基乙基)胸腺嘧啶時
3)當光反應活性化合物為7-香豆基氧基乙酸時 這樣製備的本發明交聯的GAGs的物理性質可通過如GAG的性質，光反應活性基團(化合物)的性質，可光硫化的GAG的濃度，由光反應活性化合物取代的程度(DS)，交聯度及光反應時間等因素而控制。然而，一般地，它們顯示出的溶脹性＝[(溶脹態的重量-乾燥態的重量)/乾燥態的重量]在一定範圍(0.1至200)內，因而其中可包括和存留的水的量在一定範圍。
隨由光反應活性基團(化合物)的DS和交聯度的增加，溶脹性值降低。
它們也顯示出與水的接觸角在一定範圍內(10°至100°)。接觸角反映了交聯的GAG表面的疏水性/親水性。光反應活性基團的交聯(二聚)速率的增加導致接觸角值的增加，即疏水程度的增加。
交聯度(前述光反應活性基團進行二聚化的百分數)可通過增加DS而增加。它還可通過控制所述光反應而進一步控制。
因而，交聯的GAGs的生物功能可通過改變交聯度而控制。例如，內皮細胞之類的細胞傾向於與顯示高交聯度的交聯的GAGs粘連，儘管這一趨勢根據GAG和光反應活性化合物的性質而不同。這種趨勢對不含硫酸基團的透明質酸是明顯的。(參見實施例部分的照片)，而這種趨勢對含硫酸的GAGs(例如硫酸軟骨素)是很小的。基於這一點，也可通過結合使用兩種或多種GAGs以促進或抑制細胞粘連。而且，這一性質可以用來在功能上區分人造血管的內膜(最裡面的壁)和外膜，即通過選擇GAGs和光反應活性的基團並控制DS和/或交聯度而製備細胞粘連性不同的不同的交聯的GAGs覆蓋內膜和外膜。這樣，例如，內膜可以作成對細胞非粘性的以防止血栓形成，而外膜可作成對細胞粘連的，因而允許纖維細胞與其粘連使其不漏血。本發明可光硫化的GAGs和交聯的GAGs可作為醫用材料，除了上面所述的用於製造人造血管的內膜和外膜的材料外，還包括尤其用於製作人造皮膚，組織非粘性膜或材料，創傷癒合促進材料，混合的人造器官，人造細胞外基質和人造基膜。而且，藥物包埋可以通過將可光硫化的GAG溶液與生理活性物質(如肝素，硫酸皮膚素，硫酸乙醯肝素，抗癌劑，抗炎劑，細胞激動素，激素，生長因子，或酶如組織血纖維蛋白溶酶原活化素，超氧化物歧化酶，或尿激酶)混合，並使這樣的溶液或由其得到的塑模進行交聯的光反應而實現。因此，可光硫化的GAGs和交聯的GAGs也可用作實現包埋於其中的藥物控制釋放的載體。
一些典型應用由下更具體描述[非粘連材料]本發明的交聯的GAGs可作為非粘連材料，用於防治外科創傷不希望發生的粘連並促進癒合，例如，使用交聯GAGs膜覆蓋腹膜壁和腹膜內器官(如肝等)，藉此保護腹膜中的損傷(缺損)，從而防止粘連並促進創傷癒合。所述膜可根據創傷癒合速率被降解和吸收。
溶液形式的可光硫化的GAGs可用與上所述的相同目的，通過向創傷部位注射該溶液並覆蓋表面，然後用光照射同一部位從而導致在體內形成交聯膜。更具體講，這種技術可用於防止粘連和/或填塞內窺鏡操作中的缺損。
對於其作為非粘連材料的應用，交聯GAGs(包括體內交聯GAGs在內)最好應具有適當的強度，以防止膜破裂，並阻止組織(細胞)粘連，及正比於傷口癒合速度的生物降解能力;生物降解產物應當基本上是無毒的，既使當其被活有機體吸收時也如此。通過選擇可光硫化的GAG(選擇GAG種類和光反應活性化合物，以及DS)以及照射條件(如離光源的距離，光源種類，強度，膜厚度等)來控制這些功能。
本發明的交聯GAGs可做為包嵌藥物在其三維網狀結構中以達到受控釋放藥物目的的材料(載體或賦形劑)。因而，包嵌或包合的藥物可依據藥物性質和使用方式在一定時間內釋放出來，並在需要藥物的藥物釋放的周圍維持一定範圍的藥物濃度。
受控藥物釋放的速率可通過選擇可光硫化的GAG(選擇GAG種類和光反應活性基團，以及DS)和照射條件(如曝光時間，離光源的距離，光源功率等)來控制。既然如此，儘管釋放速率通常隨著藥物的分子量和藥物與交聯GAG之間的靜電引力的增加而降低，但所述速率通過按照其相應的化學結構(根據分子量，電荷狀態(親水度或疏水度)，等)選擇上述與藥物結合的可光硫化的GAG來控制達到預定範圍。
在本發明的該目的中，藥物在溫和條件下被固定，因而在藥物分解的過程中藥物是穩定的，並且與先有技術相比可以防止其中活性的降低。
受控釋放藥物材料或製劑各自包含交聯GAG和包嵌在其內的藥物，根據藥物性質和使用方式，它們可製成任何所要形式。因此，例如，它們可被製成膜(膜，塗層)，凝膠，凍膠，乳膏，懸浮劑，微膠囊，片劑，粒劑，粉劑等等。也可以通過用包含可光硫化的GAG和藥物的組合物浸漬載體(如沙布，敷料材料，編織或紡織纖維，紙，棉花，非紡織品，膜，多孔海綿)或者把所述組合物施加到這種載體上使可光硫化的GAG成為備用狀態，隨後通過照射轉換成交聯GAG。此外，包含可光硫化的GAG和藥物的組合物可被施加到這種如人工器官(如人造血管，人工心臟)的結構的表面和內部，然後進行硫化(交聯)。
為包嵌藥物在本發明交聯GAG之內，藥物溶在或懸浮在水溶液或有機溶劑(如DMF)溶液中，所述溶液含有約1至30%重量，例如，相應可光硫化的GAG和藥物的濃度約0.001至80%，在加入所需要的各種添加劑之後，將形成的組合物塑模，乾燥，然後用光照射。交聯後，模製品就此應用或視需要得到固體，半固體或懸浮體形式的受控釋放藥物材料。
本發明的受控釋放藥物材料可用作藥物製劑。那麼，包含藥物的交聯GAGs可以本身單獨製劑或與常規藥學上可接受的添加劑如防腐劑，穩定劑，局部麻醉劑，分散劑，模壓性能改性劑，加溶劑等等一同製劑成所要劑型。例如，在調節其粒度為約0.5至40μm之後，包含藥物的交聯GAGs可與分散劑(如吐溫80，HCO60(Nippon Chemicals)，羧甲基纖維素，藻酸鈉等)，防腐劑(如對羥苯甲酸甲酯，對羥苯甲酸丙酯，苄醇，2-三氯叔丁醇等)，等滲張劑(isotonizsing agents)(如氯化鈉，甘油，山梨醇，葡萄糖等)以及其它可能需要的添加劑一同配製水懸(浮)液，或者通過將其分散在植物油如橄欖油，芝麻油，花生油，棉子油，玉米油，或丙二醇等中配製油懸(浮)液。包含藥物的交聯GAGs也可單獨或與賦形劑(如澱粉，碳酸鈣等)，粘合劑(如澱粉，阿拉伯樹膠，羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙纖維素等)，潤滑劑(如滑石，硬脂酸鎂，聚乙二醇6000等)和/或類似物的混合物通過直接壓模製備片劑或製備粉劑，粒劑等。如將粉劑，粒劑或其它製劑填入膠囊內便得到包含藥物的膠囊。此外，包含藥物的交聯GAGs本身也可塑模成膜或固定在一些其它載體上，從而得到可用於經皮吸收的製劑，眼製劑(如角膜創傷癒合促進劑)，用於包嵌在生物體內的製劑，或可的可光硫化的GAG的一些具體例子以單元的結構式在下面示出。結構不同的結構單元，例如在所鍵合的光反應活性基團的數目上和/或其鍵合位置上不同的單元可以出現在同一分子中。
1)由將肉桂酸引入透明質酸產生的可光硫化的GAG(HA-Cin)
2)由將1-(2-羧基乙基)胸腺嘧啶引入透明質酸產生的可光硫化的GAG(HA-Thym)
10.類固醇如氫化可的松，去氫氧化可的松，地塞米松，倍他米松等;
11.創傷癒合促進劑如生長因子，膠原等(參看JP-A-60-222425)。
此外，上述藥物還包括具有生理活性的多肽，激素，結核菌抑制藥，止血藥，抗糖尿病藥，血管舒張藥，抗心律不齊藥，強心劑，抗過敏劑，抗抑鬱藥，鎮癲藥，肌肉鬆弛藥，鎮咳祛痰藥，抗生素等等。
本發明的受控釋放藥物材料可作為醫學材料用作製備如人工器官(如人工血管，人工心臟等)之類結構的成分(如表面)。在這種情況下，它們尤其用作形成與血液接觸的表面的醫學材料，其中抗凝劑(如肝素，乙醯肝素硫酸鹽，血栓調節蛋白);纖維蛋白溶解激活劑(如纖維蛋白激酶，尿激酶)和/或抗血小板物質可包嵌在交聯GAGs內以得到控制釋放這些物質的目的和使所述表面變為抗血栓形成。或與細胞粘性蛋白如膠原，明膠和纖維結合素混合的或者在化學結合此處所述的這類蛋白質之後的本發明可光硫化的GAGs可轉換成交聯GAGs，這種GAGs可用作容許細胞(內皮細胞，上皮細胞，平滑肌細胞等)粘連和生長的人工細胞外基質和人工基膜(參看 JP-A-1-124465，61-128974，和62-270162)。它們還可用作雜種類型的人工器官(人工血管，人工皮膚等)。
下述實施例用於進一步說明本發明，但不能認為限制本發明的範圍。
實施例中，一些典型的物理特性和生理功能按照下述方法利用下面給定的儀器測定或評估。
1H NMR光譜使用JOEL JNM-JX270 FTNMR光譜儀測量，UV/VIS光譜利用JASCO Ubest-30 UV/VIS光譜儀測量。
各個光反應活性化合物的取代度(DS)依據1H NMR或UV數據計算，也可通過比較低分子量的典型化合物(GAG降解產物)和所連接的光反應活性化合物的紫外吸收數據測定取代度。
各個交聯GAGs衍生物的溶脹度按下所述測定溶脹度-[Wg(溶脹)-Wg(乾燥)]/Wg(乾燥)其中Wg(乾燥)表示乾燥的經光照射所製備的交聯GAG膜的重量，以及Wg(溶脹)表示交聯GAG膜在純化的水中浸漬24小時後的重量。
至於接觸角，前置接觸角和後退接觸角通過利用接觸角測角計(靜態Kyowa接觸角儀CA-D，Kyowa Kaimen Kagaku K.K.)按液滴方法測量。當單獨使用述語「接觸角」時，一般是指「前進接觸角」。
內皮細胞粘連實驗按下述方法進行。各種可光硫化的GAG通過從溶劑中鑄型製成膜，並將該膜固定在由聚苯乙烯(TCPS)製造的組織培養皿的底部。利用從牛主動脈上取得的內皮細胞在無菌條件下接種。所用的培養基是補充有10-15%胎兒的腓腸血清(FCS)的Dulbecco′s modified Eagle medium(DMEM)。在37℃培育24小時後，通過藉助相襯顯微鏡觀察判斷細胞粘連是否發生。對於細胞生長的評價，使用1-2天後的生長速率。
實施例1製備透明質酸-肉桂酸酯以及通過它們的光化反應製備交聯透明質酸(1)製備透明質酸-肉桂酸酯將無水吡啶(30ml)加到透明質酸(分子量880，000)三正丁基胺鹽的二甲基甲醯胺(DMF)(150mg/35ml)溶液中，隨後於室溫在劇烈攪拌的情況下加入26.64mg肉桂醯氯。在75℃將酯化反應進行2小時，然後向反應混合物中加入被乙酸鈉飽和的乙醇，收集產生的沉澱並用乙醇充分洗滌以除去未反應的肉桂醯氯，得到透明質酸的肉桂酸酯。組份(lot)HA-Cin-3產量95.6mg結合的肉桂酸11.0Wt.%(基於1H NMR光譜)DS0.50上述產物的1H NMR光譜見附圖1所示。典型的特徵吸收見下6-8ppm:歸因於肉桂酸苯環和肉桂酸雙鍵上的質子;
2ppm:歸因於透明質酸N-乙醯基上甲基的質子。
計算這些質子數量之間的比值並用於測定由上給出的結合的肉桂酸量，DS值。
(2)製備硫化(交聯)的透明質酸膜將30mg組分HA-Cin-3的DMF溶液置於載玻片上(24mm×24mm)並使用無菌空氣加熱至40℃乾燥。使用450-W高壓汞燈通過被水覆蓋的派熱克斯濾光片照射，使所形成的膜曝光，上述濾光片用來濾去270nm以前波長的光。這樣得到硫化(即交聯)的透明質酸膜。
279nm的吸收峰隨著照射而衰減(附圖2)。當衰減百分率穩定後停止照射(照射時間30分鐘)。
組分HA-Cin-3-2實施例2使用相同原料和實施例1中所用的方法製備透明質酸-肉桂酸酯，但透明質酸與肉桂酸間的用量比按下列表1中所述變化(透明質酸的用量保持150mg)。並且按實施例1的方法製備硫化(交聯)的透明質酸膜表1透明質酸-肉桂酸酯 交聯的透明質酸組分 產率 結合肉桂酸 DS 組分HA-Cin-1 92.3mg 2.0Wt% 0.10 HA-Cin-1-22 97.3 6.5 0.35 2-24 111.4 14.0 0.87 4-25 117.0 22.5 1.28 5-26 139.2 36.0 2.43 6-27 149.7 46.0 3.65 7-2實施例3硫化的透明質酸膜的接觸角測定由實施例1和2所得的各種硫化的透明質酸膜的前進和後退接觸角。結果列於附圖3。兩種接觸角很清楚地隨著肉桂酸殘基的DS增加而增加。
接觸角的增加反映出膜表面疏水性的增加。
實施例4硫化的透明質酸膜的溶脹度的測量通過將由實施例1和2所得到的各種硫化的透明質酸膜在純化水中溶脹24小時測量它們的溶脹度。結果見附圖4所示。
如附圖4所示，溶脹度隨著肉桂酸殘基DS的增加而降低。
溶脹度的降低反映出所述膜的疏水性的增加。
實施例5內皮細胞對硫化的透明質酸膜的粘連培育24小時之後，評估內皮細胞對實施例1和2所得到的硫化的透明質酸膜[組分HA-Cin-3-2(DS＝0.5)，4-2(DS＝0.87)，5-2(DS＝1.28)，和6-2(DS＝2.43)]的粘連力或附著力。結果見附圖5所示(像片)。
如附圖5所示，內皮細胞的粘連力隨著肉桂酸殘基的DS值的增加而趨於增加。
DS＝0.5的膜HA-Cin-3-2顯示出足夠的細胞非粘連效果。從而被發現具有組織防粘材料所需要的基本特性。
所得資料也可作為與利用本發明的交聯GAGs與細胞粘性蛋白質如膠原，明膠和纖維結合素結合製備人工細胞外基質或人工基膜，並容許內皮細胞，上皮細胞，平滑肌細胞粘附於生長於上所述基質或膜，提供雜種(hybrid type)人工器官(人工血管，人工皮膚等)有關的基本資料。
實施例6製備硫酸軟骨素-肉桂酸酯以及通過它們的光化反應製備交聯的硫酸軟骨素(1)製備硫酸軟骨素-肉桂酸酯將無水吡啶(30ml)加到硫酸軟骨素(分子量＝60，000)的三正丁基胺鹽的二甲基甲醯胺(247mg/15ml)溶液中。隨後在室溫及劇烈攪拌下，向混合物中加入19.78mg肉桂醯氯。反應在75℃進行2小時。向反應混合物中加入被乙酸鈉飽和的乙醇，收集產生的沉澱，用乙醇充分洗滌，減壓乾燥。
組分CS-Cin-1產量152mg結合肉桂酸7.52Wt.%DS0.33(2)製備交聯的硫酸軟骨素膜將上述步驟(1)中製備的產物CS-Cin-1溶在磷酸鹽緩衝溶液中，濃度15%，然後使用與實施例1中所用的相同汞燈照射產生凝膠體。
組分CS-Cin-1-2
實施例7使用與實施例6中所用的相同材料和方法製備硫酸軟骨素-肉桂酸酯，但硫酸軟骨素與肉桂酸間的用量比按下表2中所述變化(硫酸軟骨素的用量保持247mg)，並從此按與實施例1所用的相同方法製備交聯硫酸軟骨素膜。
表2硫酸軟骨素-肉桂酸酯 交聯的硫酸軟骨素組分 產量 結合的肉桂酸 DS 組分CS-Cin-2 165.7mg 11.59wt% 0.51 CS-Cin-2-23 170.0 14.0 0.65 3-24 195.3 25.8 1.37 4-25 233.8 38.6 2.43 5-2將組分CS-Cin-2(DS＝0.51)溶於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，形成不同濃度的溶液，將溶液用光照射30分鐘，然後檢查膠凝度(degree of gelalion)，所得結果見附圖6所示。如附圖6所示，膠凝度隨著濃度的增加而增加。
膠凝度(%)按下式計算百分膠凝度(%)＝100×(A-X)/(A-B)其中A＝照射前吸光度(OD 275nm)B＝充分照射至吸光度達到穩定常數後得到的吸光度(OD 275nm)，以及X＝照射30分鐘後吸光度(OD 275nm)。
將組分CS-Cin-3(DS＝0.65)的PBS 15%溶液用光照射，膠凝狀態遵循時間函數。因而，在每次曝光周期之後，將所形成的凝膠體在去離子水中浸漬24小時，除去凝膠體表面的水份後稱重。然後乾燥凝膠體，計算溶脹度。同時也測定膠凝度。所得結果見附圖7所示。
膠凝度隨著曝光時間的延長而增加，但溶脹度卻隨著曝光時間的延長而降低。
對組份CS-Cin-1至5也評估了它們在PBS中的膠凝特性，以及產生的凝膠體的溶脹度。從而所發現的膠凝度或溶脹度與肉桂酸殘基(摩爾比以載有雙糖的硫酸軟骨素單位為基準)的DS值間的關係見附圖8所示。
肉桂酸殘基的DS值的增加導致膠凝度增加，但溶脹度迅速降低。
實施例8硫化的硫酸軟骨素膜的溶脹度評估將實施例6和7中所合成的硫酸軟骨素-肉桂酸酯塑模成可光硫化膜，然後將該膜用光照射30分鐘進行交聯，得到硫化的硫酸軟骨素膜。
測量這些硫化的軟骨素膜的溶脹度，結果見附圖9所示。
結果表明與硫化的透明質酸膜不同，硫化的硫酸軟骨素膜的溶脹度在既使當肉桂酸殘基的DS值增加時也不象硫化的透明質酸膜那樣迅速降低。這大概是由於硫化的硫酸軟骨素膜具有硫酸根以及比硫化透明質酸膜高的親水性的原因。
實施例9測量實施例8中所得到的硫化的硫酸軟骨素膜的接觸角，並畫出其對肉桂酸殘基的DS值的關係曲線。結果見附圖10所示。附圖10中的圖解表示表明交聯硫酸軟骨素與交聯透明質酸比較，顯示出較小的接觸角。這大概也是由於親水性不同的原因。
實施例10內皮細胞對硫化的硫酸軟骨素膜的粘連按與實施5所述的相同方法，檢查內皮細胞對實施8所得的硫化的硫酸軟骨素膜的粘連。與硫化的透明質酸膜不同，觀察到與肉桂酸殘基的DS值無關的非粘連性。
實施例11肉桂酸衍生物與透明質酸的羧基的結合及交聯(1)合成肉桂醯基乙二胺醯胺將肉桂醯氯(1.666g)溶於100ml氯仿中，並在0℃向溶液中滴加入6g1，2-乙二胺的氯仿溶液。在40℃攪拌20小時後，反應混合物用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，然後用水充分洗滌。減壓濃縮有機溶劑層，殘餘物用乙醇重結晶，得到所要產物(1.58g，以下稱作化合物A)。
(2)合成Nα-肉桂醯基-L-賴氨酸將N∈-叔丁氧羰基-L-賴氨酸(2.58g)溶於50ml二甲基甲醯胺中，向該溶液中加入30ml無水吡啶。向混合物中加入肉桂醯氯的氯仿溶液(1.665g/20ml)，反應在40℃下進行。減壓濃縮反應混合物至幹，將殘餘物溶在3.6N HCl/二噁烷(33ml)中，放置4小時後，減壓濃縮溶液，得到所要產物(2.43g，以下稱作化合物B)。
(3)將肉桂醯基乙二胺醯胺與透明質酸結合將150mg透明質酸鈉(分子量＝1，200，000)溶在30ml水中，隨後加入42.75mg化合物A和71.9mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。反應在室溫下進行20小時。向反應混合物中加入1M碳酸氫鈉水溶液，室溫放置1小時後，再加入乙酸鈉飽和的乙醇。收集產生的白色沉澱，並用乙醇充分洗滌。
組分HA-CinA-1產量176.2mg結合的化合物A16.58Wt.%DS0.5(4)將Nα-肉桂醯基-L-賴氨酸與透明質酸結合向透明質酸的三正丁基胺鹽(分子量＝880，000)的二甲基甲醯胺溶液(150mg/35ml)內加入1.224g N-羥基琥珀醯亞胺和55mg二環己基碳化二亞胺，並將反應先在0℃進行1小時，然後在室溫進行10小時，用於活化透明質酸的羧基。向反應混合物中加入乙醚並收集產生的沉澱，乙醚洗滌，減壓乾燥，得到相應的活化的透明質酸酯。
將該活化的透明質酸溶於二甲基甲醯胺中，向該溶液中加入化合物B的二甲基甲醯胺溶液(44mg/50ml)，反應在室溫下進行20小時。向反應混合物中加入乙酸鈉飽和的乙醇，濾出所產生的沉澱並用乙醇洗滌純化。
組分HA-CinB-1產量122.1mg結合的化合物B25.92Wt.%DS0.5(5)製備硫化的透明質酸膜按與實施例1所述的相同方法，將組分HA-CinA-1和HA-CinB-1(各自30mg)模塑成膜，並利用光照射交聯。
如此製備的硫化的透明質酸膜(組分各自為HA-CinA-1-2和HA-CinB-1-2)各自顯示出溶脹度值為1.2和1.4g H2O/g凝膠體。
實施例12合成透明質酸-[(1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(1)向含有0.317g碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓的透明質酸(分子量1，000，000)(以下稱作HA100)二甲基甲醯胺(DMF)溶液(175mg/50ml)中加入0.245g 1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶和0.461g三乙胺，反應在90℃進行4小時。減壓除去DMF，加入過量乙醇，收集所產生的沉澱，用乙醇洗滌，減壓乾燥。所得到的白色沉澱是透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯。
組分HA-Thym-1產量160.0mg
結合的胸腺嘧啶9.1Wt.%DS0.46(DS值依據由1H NMR所測定的胸腺嘧啶的甲基質子的數目與透明質酸的乙醯基質子的數目間的比率來測定。)實施例13合成透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(2)按與實施例12中所述的相同方法，製備幾組透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯，但使用表3中所述條件。
表3反應條件 物理特性組份 胸腺嘧啶/ 溫度 時間 DS 溶解度(mg/ml)HA OH摩爾比 (℃) (hrs) 水 DMFHA-Thym-2 0.5/1.0 90 3 0.05 1 203 1.0/1.0 75 2 0.125 10 804 2.0/1.0 75 2 0.14 10 805 0.67/1.0 90 4 0.17 50 806 1.0/1.0 90 3 0.26 20 807 1.0/1.0 90 6 0.35 20 808 0.67/1.0 100 4 0.37 50 809 3.0/1.0 90 3 2.40 0 100
實施例14利用透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(1)的光化反應製備交聯的透明質酸按照與實施例1中所述的相同方法，利用組份HA-Thym-1(DS＝0.46)製備膜，並將膜用氬燈放射出的紫外(UV)射線照射。胸腺嘧啶二聚體形成的過程被發現可作為曝光時間的函數，見附圖11所示。
實施例15利用透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(2)的光硫化作用(光化反應)製備硫化的透明質酸膜按與實施1中所述的相同方法，將實施例13中所製得的組分HA-Thym-3，4，6，7，8和9(DS值各自為0.125，0.14，0.26，0.35，0.37和2.40)各自模塑成膜，並將各膜利用氬燈用UV照射。如此得到的硫化的透明質酸膜各自被稱作組分HA-Thym-3-2，4-2，6-2，7-2，8-2和9-2。這些膜的膠凝度(%)和溶脹度數值見下表4所示。
表4組分 膠凝度(%) 溶脹度HA-Thym-3-2 75.39 34.764-2 74.5 45.006-2 88.9 32.637-2 94.0 40.178-2 99.4 32.179-2 98.0 0.56實施例16合成透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(3)將透明質酸的DMF溶液(1.0mM)在分子篩預乾燥後再進一步脫氣4小時充分脫水。單獨將含有1-(2-羧乙基)-胸腺嘧啶(相對於透明質酸的各羥基基團改變摩爾比率，參看附圖12)，碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓(1.2mM)和三乙胺(1.2mM)的DMF的溶液在室溫攪拌30分鐘。將該溶液滴加到補充有三乙胺(1.2mM)的上述透明質酸溶液。將形成的混合物在90℃攪拌3，5或8小時。減壓濃縮反應混合物並向殘餘物中加入甲醇。濾出所生成的沉澱，甲醇洗滌，乾燥。在該情況下，得到DS值不同的透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(HA-Thym;DS＝0.2，0.4，0.6，0.7，0.9，1.3，1.8，2.2)。
所用的1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶的摩爾比率與DS值之間的關係曲線的例子見附圖12所示。
實施例17合成硫酸軟骨素-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯使用硫酸軟骨素(分子量＝60，000)進行實施例16的步驟，1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶的摩爾比相對於硫酸軟骨素的各羥基基團而變化，且酯化反應時間為3，5或9小時。向各反應混合物中加入甲醇或二乙醚用於沉澱產物。當使用二乙醚時，沉澱用甲醇充分洗滌。這樣得到DS值不同的硫酸軟骨素-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(CS-Thym;DS＝0.09，0.4，0.8，0.9，1.3，1.7，1.8，2.2)。
所用的1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶的摩爾比率與DS值之間的關係曲線的例子見附圖13所示。
DS-溶解性(在水或DMF中)的關係見表5所示。
表5溶解性DS 水 DMF0.4 溶解 溶解0.9 溶解 溶解1.3 微溶 溶解1.7 不溶 溶解實施例18利用胸腺嘧啶衍生物製備硫化的透明質酸膜和硫化的硫酸軟骨素膜使用實施例16或17中所得到的各種GAG的1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶酯製備上述膜。
例如，將各種透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(HA-Thym;DS＝0.2，0.4，0.6，0.7，0.9，1.3，1.8，2.2)和硫酸軟骨素-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(CS-Thym;DS＝0.09，0.4，0.8，0.9，1.3，1.7，1.8，2.2)溶在DMF中，得到5%溶液，將200μl溶液置於載片上(直徑14mm)，用滅菌空氣在35℃乾燥。所生成的膜用來自400W高壓汞燈通過被水覆蓋的派熱克斯濾光片的射線照射，得到交聯的GAG膜。
已發現當按上述方式照射乾燥的薄的硫酸軟骨素-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(CS-Thym)膜(DS＝0.09，厚度＝2-3μm)時，在270nm的吸收變化與曝光時間間的關係，曲線見附圖14所示。並發現在那種情況下，膠凝度(%)與曝光時間間的關係曲線見附圖15所示。具有適合實際應用厚度(10-12μm)的CS-Thym(DS＝0.09)膜也按相同方式照射;膠凝度(%)與曝光時間間的關係曲線見附圖16所示。
按照相同方式照射乾燥的透明質酸-[1-(2-羧乙基)胸腺嘧啶]酯(HA-Thym)膜(DS＝0.9，厚度＝10-12μm)，所得到的溶脹度-曝光時間的關係曲線見附圖17所示。在照射前和照射後(3小時)測量各種DS值不同的HA-Thym膜的溶脹度，並畫出DS對所得數值的關係曲線，所得曲線見附圖18所示。
本實施例中所得到的且DS值不同的幾種HA-Thym-或CS-Thym-衍生的光硫化的膜的接觸角和溶脹度值見表6所示。
表6可光硫化的GAG 接觸角(度)±SD 溶脹度HA-Thym(0.6) - 32±7HA-Thym(0.9) - 13±4HA-Thym(1.3) - 7HA-Thym(1.8) 54±3 0CS-Thym(0.9) - 40±13CS-Thym(1.3) - 22±5CS-Thym(1.8) -CS-Thym(2.2) 70±2 3實施例19內皮細胞對交聯的透明質酸膜的粘連性將內皮細胞在如實施例18中用胸腺嘧啶衍生物製備的DS值不同的交聯的透明質酸膜(DS＝0.4，0.6，1.3，1.8)中培養，待培養6小後評估細胞的粘連度。
結果，在任何DS值不同的交聯透明質酸膜上基本上沒有觀察到細胞的粘連，增大(擴展)及生長。相反，在對比TCPS的孔中發現正常結合，增大(擴展)和生長。
實施例20合成硫酸軟骨素-(7-香豆氧基乙酸)酯[Chondroitin Sulfate-(7-Coumaryloxyacetic acid)ester]將硫酸軟骨素三正丁基胺鹽的DMF溶液(10.25mg/ml)用分子篩預乾燥，並將70ml該溶液在100ml三口燒瓶中於室溫且攪拌下真空乾燥。在燒瓶內空氣被氮氣趕走後，加入15ml蒸餾過的吡啶。向該溶液中加入相對於硫酸軟骨素的各羥基基團為1摩爾當量的7-香豆氧基乙醯氯[醯氯式香豆素](1.12g)的5ml DFM溶液。反應通過在氮氣氛下於80℃回流混合物進行3小時。然後濃縮反應混合物並滴加入二乙醚，回收所產生的沉澱，並溶在去離子水中，用流動水滲析3天。將濾析液冷凍乾燥，得到硫酸軟骨素-(7-香豆氧基乙酸)酯，白色固體。
產量965.1mgDS0.021溶脹度2.8g H2O/g乾燥膠凝體1H-NMR光譜見附圖19重複上述步驟，但改變醯基氯式香豆素與硫酸軟骨素的羥基基團的摩爾比並畫出摩爾比對DS值的關係曲線。結果見附圖20所示。
實施例21由硫酸軟骨素-(7-香豆氧基乙酸)酯製備可光硫化的硫酸軟骨素膜將實施例20中合成得到的硫酸軟骨素-(7-香豆氧基乙酸)酯按實施例1中所述製成乾燥膜，將膜用紫外光(320nm)照射，得到可光硫化的硫酸軟骨素膜。
曝光時間與香豆素的吸收光譜(320nm)變化間的關係曲線見附圖21所示。測定所製備膜的溶脹度(g H2O/g乾燥膠凝體)並畫出曝光時間和DS值對溶脹度的關係曲線。結果各自見附圖22和23所示。此外，還測定了膠凝度(%)並畫出曝光時間和硫酸軟骨素-(7-香豆氧基乙酸)酯的濃度對膠凝度(%)的關係曲線，結果各自見附圖24和25所示。
實施例22交聯的透明質酸/硫酸軟骨素膜將實施例1中所得的HA-Cin-3(DS＝0.5)溶於20%DMF水溶液中，最終濃度為5%重量比。然後，將實施例7所得的CS-Cin-4(DS＝1.37)溶在上述溶液中，最終濃度達到5%重量比，得到了透明質酸/肉桂酸酯和硫酸軟骨素-肉桂酸酯的混合溶液。將該溶液按實施例1所述方法進行壓片和照射，得到交聯的透明質酸/硫酸軟骨素膜。
同樣製備含有比率為2∶1或1∶2(重量比)的HA-Cin-3和CS-Cin-4的混合溶液並測定各製備膜的防粘連效果(見下文所述)。
實施例23合成肝素-肉桂酸酯和製備交聯的肝素膜(1)製備肝素-肉桂酸酯向肝素三正丁基胺鹽的二甲基甲醯胺(DMF)溶液(500mg/125ml)中加入20ml吡啶，將混合物減壓脫水。然後於室溫和劇烈攪拌下加入69.35mg肉桂醯氯。反應在75℃進行2小時，然後在40℃將反應混合物減壓濃縮至30ml。向該殘餘物中加入乙醚，回收所生成的沉澱，減壓乾燥。將沉澱溶於5ml DMF中，隨後加入40ml PBS，將溶液充分攪拌。將溶液通過滲析膜滲析以徹底除去低分子化合物，然後冷凍乾燥，得到440mg所要的酯化合物。
組分Hep-Cin-1結合的肉桂酸量(由1H-NMR測量)，DS和溶解性見表7所示。
表7結合肉桂酸 溶解性組分 (重量%) DS DMF 水Hep-Cin-1 12.4 0.5 0 △2 21.7 1.1 0 X3 31.7 1.8 0 X4 40.2 2.5 0 X0完全溶解△非完全溶解但為類凝膠X不溶(2)製備交聯的肝素膜在DMF中溶解30mg組分(Hep-Cin-1)並將溶液置於玻璃載片(24mm×24mm)上並在40℃用滅菌熱空氣乾燥。所形成的膜用450W高壓汞燈通過被水覆蓋的派熱克斯濾光片照射，得到交聯肝素膜。
組分Hep-Cin-1-2接觸角(前進和後退接觸角)和水溶脹度見表8所示。
表8接觸角(°)組分 前進接觸角 後退接觸角 水溶脹度Hep-Cin-1-2 89.3 54.8 0.132-2 76.2 41.5 0.023-2 90.3 56.5 0.05(3)使用與上述相同的原料和方法，但改變肝素與肉桂醯氯的比率(肝素保持為500mg)來製備酯(Hep-Cin-2，Hep-Cin-3，Hep-Cin-4)。測定結果也見表7所示。此外，按相同方式製備交聯肝素膜(Hep-Cin-2-2，Hep-Cin-3-2)，這些膜的物理特性也見表8所示。
實施例24將透明質酸三正丁基銨鹽(1.5g相應於10mmol OH基團)的乾燥DMF(200ml)溶液保持在氬氣氛中並冷卻至0℃，依次加入4-二甲氨基-吡啶(0.305g，2.5mmol)，肉桂酸酐(2.78g，10mmol)，和三正丁基胺(4.76ml，10mmol)，反應在室溫下進行24小時。冷至0℃後，逐漸加入溶在水(100ml)中的5% NaHCO3並將溶液在室溫下攪拌48小時。通過逐步加入1M HCl消去過量的NaHCO3至PH4，加入1M NaOH至PH7。在攪拌下加入冷乙醇。傾析後將沉澱溶在水中，用乙醇重複沉澱步驟。離心出沉澱並溶於水中，在4℃通過Dowex50(H+)陽離子交換樹脂柱。酸用1M NaOH中和並冷凍乾燥。
實施例25光硫化的透明質酸膜的非粘連效果按與實施例1製備組分HA-Cin-3-2的相同方法製備可光硫化的透明質酸-肉桂酸酯膜，將該膜用作非粘連材料並進行下列試驗。
在麻醉條件下剖腹鼠並將腹膜壁機械損傷製備-外露肌層部位。該部位用上述製備的非粘連材料覆蓋。覆蓋後1周和2周移開植入物，利用光學顯微術(在用蘇木精-曙紅染色之後)和電子顯微術檢查評估對膜表面的組織粘合程度。將損傷部位沒被覆蓋的鼠用於比較。
在使用本發明非粘連材料的試驗中，樣品覆蓋一周和兩周後，所有樣品基本上沒發現有纖維蛋白沉澱和細胞粘連。兩周後的發現證明膜的生物降解作用早已發生。
另一方面，在對比試驗中，損傷部位相繼發生纖維蛋白沉澱，漿細胞侵入，成纖維細胞等。一周後膠原蛋白產物和腸道緊密地粘附於損傷部位。
重複上述試驗，但使用實施例22所製備的交聯HA-Cin-3/CS-Cin-4膜。與上述同類HA-Cin-3膜(HA-Cin-3-2)比較，生物降解能力增強，結果膜的生物降解作用在移植後一周內已發生，附帶有細胞侵入膜內，降解進程在兩周時已十分明顯。
實施例26光硫化的硫酸軟骨素膜(原地膠化)的非粘連效果將實施例7所製備的硫酸軟骨素-肉桂酸酯組分CS-Cin-3(DS＝0.65)溶在磷酸鹽緩衝液中，最終濃度為20%重量，得到溶液形式的非粘連材料。
製備如實施例25中所用的動物損傷器官樣本並將損傷部位用上述非粘連材料塗層。然後用紫外光照射這種材料15分鐘，原地發生膠化作用。顯微解剖學檢查顯示出形成了一與腹部腹膜組織表面緊密接觸的膠層。
按與實施例25中所用的方法相同順序觀察損傷部位，與實施例25相同顯示出非粘連性。
實施例27光硫化(交聯)的透明質酸膜和光硫化(交聯)的硫酸軟骨素膜的非粘連效果。
將按與實施例1和2所述的相同方法製備的光硫化的透明質酸-肉桂酸酯(HA-Cin)膜(DS＝0.1，0.5)和按與實施例18所述的相同方法製備的光硫化的透明質酸-胸腺嘧啶衍生物酯(HA-Thym;DS＝0.2，0.6，0.9，1.8)和光硫化的硫酸軟骨素-胸腺嘧啶衍生物酯(CS-Thym;DS＝0.4，0.9)膜用作非粘連材料並進行下述試驗。而且將各種光硫化膜(直徑14mm;厚度15-20μm)通過在70%乙醇中浸漬30分鐘，然後在無菌水中漂浮1小時滅菌。至於低DS值樣品，它們在浸漬在水中以除去乙醇之後進行乾燥並在動物試驗之前，在無菌水中浸漬漂浮10分鐘。吸收水的膜溶脹形成水凝膠。
將患有白化化病的Wistar雄鼠(300g)用乙醚麻醉並在手術前用乙醚和氧氣維持麻醉狀態。每種樣品使用一隻鼠。在鼠腹部切割出一垂直正中切口以使暴露出肝。將外露肝表面機械損傷，構成一操作的腹部部位(1平方釐米)，並施加上述溶脹的光硫化膜。由於膜不能被固定在損傷部位上，故在四個角上點上聚氨基甲酸酯粘合劑以固定上述膜。然後，用尿龍縫合施行腹壁縫合術。植入後一周和兩周，將鼠殺死並將縫合部位切割開。肉眼檢查覆蓋著肝的膜，將覆蓋部分及其周圍組織割去，利用光顯微術進行組織檢查，結果見表9所示。
表9肉眼觀察 顯微鏡觀察光交聯膜 DS 移植後時間 粘連性 粘連性 生物降解能力 膜開裂HA-Cin 0.1 1 week - - + -HA-Cin 0.5 1 week + - - -,+
HA-Thym 0.2 1 week - - ++ -HA-Thym 0.6 1 week - - + -HA-Thym 0.6 2 week - -HA-Thym 0.9 1 week - - + -HA-Thym 0.9 2 week - - ++ -HA-Thym 1.8 1 week + -
CS-Thym 0.4 1 week - - ++ -CS-Thym 0.9 1 week - - + --沒有+附加或觀察到(Added or observed)++明顯光硫化HA-Cin(DS＝0.1)膜的組織檢查，例如，在移植後一周顯示出膜表面上完全沒有細胞粘連，且膜的生物降解作用已經發生，並觀察到組織侵入。對於光硫化的HA-Thym(DS＝0.2)膜，同腹壁細胞一樣，在最外層觀察到有偏細胞(flat cells)，且生物降解作用已經發生，以及僅有少許中心部分保留。
使用未覆蓋的損傷部位作為比較，1周後進行類似觀察。結果，在肝損傷表面與腹壁之間發現有不能被鈍手術操作(如利用手術刀或手掌背面，而不用刀切割的手術)分離開的粘連。
實施例28利用光硫化的透明質酸和光硫化的硫酸軟骨素膜作為載體的藥物的受控釋放(1)消炎痛的受控釋放將實施例16所得到的具有變動DS值的HA-Thym溶於DMF中，且最終濃度為5%，並將1μg消炎痛溶於200μl上述溶液中。將產生的溶液置於玻璃載片上(直徑15mm)，利用滅菌熱空氣在35℃空氣乾燥。這樣所得的膜按與實施例18所述的相同方法照射，得到包含消炎痛的交聯透明質酸膜。藥物含量控制在10%。按相同方式製備含有30%，50%和73%藥物的交聯的透明質酸膜。此外，利用實施例17所得到具有變動DS值的CS-Thym，按相同方式製備含有10%，30%和50%藥物的交聯的硫酸軟骨素膜。
藥物從各種製備膜中釋放的試驗按下述方法進行。例如，將測試膜懸浮在水(20℃)或磷酸鹽-緩衝的鹽水中(PBS)(37℃)並攪拌。在預定時間間隔將液相採樣並測量其在269nm的紫外吸收光譜。
表10顯示了具有30%藥物含量的光硫化的透明質酸膜(DS＝0.7，1.3，1.8)的水溶解試驗數據與DS和溶脹度的關係。至於溶解試驗數據是指當20%藥物從所用膜中釋放出時的時間。
表10DS 溶脹度 20%釋放時間(分)0.7 8 251.3 5 1201.8 0.2 360從表10可以看出，很明顯作為一種趨勢，DS值越高，交聯度也越高，因此膜就越硬，其結果溶脹度降低以及藥物的釋放速率也協同降低。該發現說明膜的吸水容量對藥物釋放速率是一重要指數。關於DS值為1.3和1.8的膜，藥物釋放速率趨向於隨著藥物含量的增加而降低。
比較光硫化的透明質酸膜(DS＝0.7，2.2)和光硫化的硫酸軟骨素膜(DS＝0.8，1.3，1.8)當藥物含量為10%和50%時在PBS中的藥物釋放速率。結果見附圖26至30所示。根據這些圖，很明顯可以看出對於具有不小於一定限度DS值的膜(對於CS-Thym，DS＝1.3)，藥物受控釋放是可行的。
(2)肝素的受控釋放在20% DMF水溶液中溶解實施例7所得的硫酸軟骨素-肉桂酸酯[CS-Cin-4(DS＝1.37)CS-Cin-5(DS＝2.43)]，最終濃度為20%重量比，以及溶解實施例1和2中所得的透明質酸-肉桂酸酯[HA-Cin-3(DS＝0.50)，HA-Cin-5(DS＝1.28)，HA-Cin-6(DS＝2.43)]，其最終濃度達到10%重量比。向各10ml這些溶液中加入100mg肝素並將溶液塗層在玻璃上(10cm×10cm)，室溫乾燥1小時得到膜。該膜用450W高壓汞燈照射30分鐘。各膜的厚度大約為100μm。
將各個載在玻璃片上的膜完全浸入在含有100ml水的容器內並以60rpm攪拌。按照咔唑-硫酸法，測量隨著時間變化肝素的釋放量。結果表明所有膜都保證肝素的受控釋放。
此外，各種上述控制肝素釋放膜在試管內壁上形成，然後，按照JP-A-4-41432，加入檸檬酸化血液並測量凝結時間。所有樣品都顯示出抗血栓形成活性。
(3)生長激素釋放因子的控制釋放在20% DMF水溶液中溶解透明質酸-肉桂酸酯[HA-Cin-3(DS＝0.50)]，其最終濃度達到10%(重量比)，1ml上述溶液內混合1mg生長激素釋放因子(GRF，人體;分子量5039.8)。然後將混合物在玻璃片(3cm×3cm)上塗層並在室溫下乾燥1小時，得到膜。該膜用450W高壓汞燈照射30分鐘。該膜厚度為110μm。
將上述載於玻璃片上的膜完全侵入在含有10ml水的容器內，並以60rpm攪拌。藉助高效液相色譜測定隨時間變化釋放的GRF並計算釋放的累積量。已發現GRF的控制釋放可以成功地完成。
實施例29人造血管將具有小腔(內徑3mm)的人工血管的內表面用實施例1所製得的HA-Cin-3溶液通過旋轉塗層技術塗層，乾燥後，塗層膜利用紫外線輻射器使用小口徑光學纖維硫化，從而得到內部被硫化的透明質酸塗層的人造血管。本發明很容易通過選擇這裡具體描述的作為高度安全和生物共容原料的這些光活性化合物和氨基葡聚糖，並將前者與後者結合提供易純化的可光硫化的GAGs。本發明通過利用光照射上述可光硫化的GAGs進一步提供了醫用材料。該材料具有兩或三維網狀結構並且是高度安全，生物共容和生物可降解/吸收的。本發明通過適當選擇GAG分子量，光活性化合物的DS值，以及其它因素還進一步提供了具有醫學材料所需要的理想物理特性的交聯GAG基礎材料，因此本發明在醫學的不同領域具有十分寬廣的應用前景。
權利要求
1.一種包含葡糖氨基聚糖和與其鍵合的光反應活性化合物的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物。
2.如權利要求1所述的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物，其中所述葡糖氨基聚糖為選自多聚乙醯神經氨糖酸，透明質酸，軟骨素，硫酸軟骨素，糖醛酸磷壁(酸)質，硫酸皮膚素，肝素，硫酸乙醯肝素，硫酸角質，多硫酸角質，幾丁質和脫乙醯幾丁質及其衍生物中的至少一員，而其中所述光反應活性化合物為至少一種選自取代或末取代的肉桂酸及其反應活性衍生物，在1位上具有一羧基烷基作為取代基的尿嘧啶及其反應活性衍生物，在7位上具有一羧基烷基作取代基的香豆素衍生物及其反應活性衍生物中的化合物。
3.通過將所述光反應活性化合物進行分子間和/或分子內交聯而由權利要求1的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物所衍生出的交聯的葡糖氨基聚糖。
4.一種生產權利要求1的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物的方法，包括使葡糖氨基聚糖的羧基或羧基基團與光反應活性化合物進行酯化反應。
5.一種生產權利要求1的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物的方法，包括將葡糖氨基聚糖的羧基活化，並使產生的活化的羧基與光反應活性化合物進行醯胺化反應。
6.一種生產權利要求1的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物的方法，包括使葡糖氨基聚糖的羧基與光反應活性化合物在縮合劑存在下進行醯胺化反應。
7.一種生產交聯的葡糖氨基聚糖的方法，包括用光照射權利要求1的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物，由此引發所述光反應活性化合物的分子間和/或分子內交聯。
8.一種以包括葡糖氨基聚糖和與其鍵合的光反應活性化合物的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物為基礎的醫用材料。
9.一種如權利要求8所述的醫用材料，它被用作非粘性材料。
10.一種醫用材料，它以通過使權利要求1的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物發生所述光反應活性化合物的分子間和/或分子內交聯反應而產生的交聯的葡糖氨基聚糖為基礎。
11.一種如權利要求10所述的醫用材料，被用作非粘性材料。
12.一種如權利要求10所述的醫用材料，被用作控制藥物釋放的載體。
13.一種控制藥物釋放的材料，包括權利要求12的用於控制藥物釋放的載體和包括於其中的藥物。
14.包含葡糖氨基聚糖和與其鍵合的光反應活性化合物的可光硫化的葡糖氨基聚糖衍生物用於製備防止細胞粘連的醫用組合物。
15.包含葡糖氨基聚糖和與其鍵合的光反應活性化合物的交聯的葡糖氨基聚糖用於製備防止細胞和/或組織粘連的醫用組合物。
全文摘要
提供了高度安全和生物相容的可光硫化的葡糖氨基聚糖(GAG)衍生物和交聯的葡糖氨基聚糖，製備這類在需要時通過用溶劑鑄造而容易塑模的可光硫化的GAG衍生物的方法，用該方法可以容易地將會引起副作用的未反應物除去，以及製備交聯的GAGS的方法及以可光硫化的GAG衍生物或交聯的GAGS為基礎的醫用材料。包含葡糖氨基聚糖和與其鍵合的光反應活性化合物的可光硫化的GAG衍生物可以例如通過使葡糖氨基聚糖的羥基或羧基基團分別與光反應活性化合物進行酯化反應或醯胺化反應而生產。交聯的GAG通過將可光硫化的GAG衍生物中所鍵合的光反應活性化合物進行分子間交聯而衍生得到。
文檔編號A61L27/20GK1075970SQ9310268
公開日1993年9月8日 申請日期1993年2月5日 優先權日1992年2月5日
發明者松田武久, M·J·莫加丹姆, 櫻井勝清 申請人:生化學工業株式會社