一種多甲氧基黃酮在製備治療黑色素瘤的藥物上的應用的製作方法

2023-05-12 11:52:11

本發明涉及一種多甲氧基黃酮在製備治療黑色素瘤的藥物上的應用。

背景技術：

黑色素瘤是皮膚、黏膜和眼脈絡膜等部位的黑色素細胞發生癌變後形成的一種惡性腫瘤，是皮膚腫瘤中惡性程度最高，容易發生遠處轉移的腫瘤。黑色素瘤的原發部位多為足底、足趾、手指末端和甲下等。對於歐美等白種人，形成黑色素瘤的主要因素是當皮膚受到紫外線照射後，導致的dna突變所形成的。而對於亞洲和非洲地區的肢端黑色素瘤，其病因目前尚不明確。對於黑色素瘤的治療效果，與黑色素瘤所處時期有關，ⅰ期、ⅱ期、ⅲ期ⅳ期黑色素瘤患者的5年生存率分別為94％、44％、38％、4.6％。早期的黑色素瘤患者，在活檢確診後，一般通過原發灶擴大切除手術進行治療，中後期患者，在手術切除後，還需要進行放化療治療。由於我國患者黑色素瘤的潰瘍比例高，影響到手術切除的難度。所以，開發新的黑色素瘤治療方案，提高黑色素瘤的治療效果，顯得十分迫切。多甲氧基黃酮是一類連接了4個或4個以上甲氧基的黃酮類化合物，在植物中廣泛存在，尤其以芸香科柑橘屬植物中含量最為豐富；通過超臨界反覆矽膠柱色譜法、co2超臨界萃取法、超聲波輔助法、離子交換法、高速逆流色譜法等方法提取分離。由於多甲氧基黃酮類化合物具有抑制癌症細胞生長、抗發炎、抗氧化、預防心腦血管疾病、抑制病原菌生長等生物活性，受到廣泛的關注。

技術實現要素：

一種適用於黑色素瘤治療的藥物。該藥物為多甲氧基黃酮在製備治療黑色素瘤的藥物上的應用。

本發明所述的多甲氧基黃酮的使用濃度為0.1μmol/l-1000μmol/l，使用時按需要濃度，溶解於質量濃度為2％的dmso中。

本發明所述的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(英文名為：5-hydroxy-3,6,7,8,3′,4′-hexamethoxyflavone)對人黑色素瘤細胞系a2058和a375細胞生長抑制作用的使用方法為：在每升dmem培養基中加入100μl含31.25-500μmol5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液；分別培養24小時和48小時後，收集細胞，測定各處理人黑色素瘤細胞系a2058和a375細胞的吸光值，計算半致死率。

本發明所述的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮對接種人黑色素瘤細胞系a375細胞7天後的c57bl/6小鼠體內腫瘤生長抑制作用的使用方法為：將c57bl/6小鼠分為2組，每組8隻。按2天灌餵一次的時間間隔，dmso對照組灌餵0.4ml質量濃度為2％的dmso溶液、5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮處理組灌餵0.4ml含0.5μmol5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的dmso溶液，實驗小鼠在接種人黑色素瘤細胞系a375細胞28天後處死，檢測腫瘤生長情況。

本發明具有的有益效果：

本發明所述的多甲氧基黃酮在植物中廣泛存在，可以通過多種方法分離提取，也能夠從分離提取的試劑公司直接購買，原料來源廣泛。採用多甲氧基黃酮治療黑色素瘤，能夠抑制人黑色素瘤細胞的生長，本發明所述的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮對接種人黑色素瘤細胞系a375的c57bl/6小鼠體內腫瘤生長的抑制作用提高了2.75倍。本發明可指導新的黑色素瘤治療方法的開發，為未來對5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的開發和應用提供了新的方向和策略。

附圖說明

圖1為5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮抑制人黑色素瘤細胞系a2058和a375細胞生長的影響。

圖2為5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮抑制人黑色素瘤細胞系a375細胞凋亡的影響。

圖3為5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮抑制人黑色素瘤細胞系a375細胞誘導c57bl/6小鼠腫瘤生長的影響。

具體實施方式

實施例1：5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮對人黑色素瘤細胞系a2058和a375細胞的生長和細胞周期分布的影響

所培養的細胞為人黑色素瘤細胞系a2058和a375細胞，培養基為dmem培養基，含有100u/ml的青黴素和100μg/ml的鏈黴素、10％胎牛血清，培養溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。在每升dmem培養基中加入100μl質量濃度為2％的dmso溶液；在每升dmem培養基中加入100μl含3.125μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液；在每升dmem培養基中加入100μl含6.25μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液；在每升dmem培養基中加入100μl含12.5μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液；在每升dmem培養基中加入100μl含25.0μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液；在每升dmem培養基中加入100μl含50.0μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液，培養48h後，收集細胞，測定各處理人黑色素瘤細胞系a2058和a375細胞的吸光值，計算半致死率(圖1)。

為了進一步弄清楚5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮抑制人黑色素瘤細胞生長的作用機理，我們分別在一升體積的不同人黑色素瘤細胞系a375細胞培養基中加入100μl2％dmso溶液；加入100μl含25μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液；加入100μl含50μmol的5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的2％dmso溶液，培養細胞48h後，收集細胞至離心管中，用4℃預冷的pbs洗細胞後，加入-20℃預冷的70％乙醇並混勻，4℃放置過夜固定細胞後，1000rpm離心棄掉乙醇，加入適量的pbs溶液，調整細胞密度為(1-2)×106個細胞/ml，加入終濃度為50μg/ml的pi和終濃度為50g/ml無dna酶汙染的rna酶，室溫避光染色30min後，流式細胞儀檢測人黑色素瘤細胞系a375細胞的細胞周期分布情況，所有實驗結果均重複3次，取平均值。實驗結果表明，和只加入2％dmso相比，細胞培養基中加入25μmol/l或50μmol/l5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮後，能引起人黑色素瘤細胞系a375細胞在亞g1期的積累，處於亞g1期時相的細胞佔所有培養細胞的比例由對照組的1.4％提高到9.4％和25％(圖2)。結果表明5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮能誘導人黑色素瘤細胞發生細胞凋亡。

實施例2：5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮對人黑色素瘤細胞系a375細胞誘導c57bl/6小鼠腫瘤生長的影響

將c57bl/6小鼠分為2組，每組8隻。按2d灌餵一次的時間間隔，分別灌餵0.4ml質量濃度為2％的dmso溶液、0.4ml含0.5μmol5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的dmso溶液，接種人黑色素瘤細胞系a375細胞28天後，處死小鼠，檢測各組c57bl/6小鼠體內腫瘤組織的大小(圖3)。實驗結果表明，5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的腫瘤體積為890mm3，2％的dmso溶液處理組的腫瘤體積為2450mm3，5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮處理組的腫瘤體積明顯小於2％的dmso溶液處理組，表明具有較強的抗黑色素瘤的活性。