一種分泌表達重組人角質細胞生長因子-2的製備方法

2023-05-13 06:50:36 2

專利名稱：：一種分泌表達重組人角質細胞生長因子-2的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種優化分泌表達重組人角質細胞生長因子(rhKGF-2)的製備方法，以及用於該方法的表達載體和宿主細胞。
背景技術：
：角質細胞生長因子(keratinocytegrowthfactor，KGF)是在1989年由Rubin等從人胎肺成纖維細胞的培養上清中分離並純化的，並發現具有促進小鼠角質細胞有絲分裂的作用，故將其定名為角質細胞生長因子。1996年Yamasaki等從鼠的胚胎中擴增出一種新的生長因子，即與KGF密切相關的另一種新的細胞因子，稱為KGF-2，又叫作成纖維細胞生長因子-10(FGF-10)。之後Emoto等從人肺中克隆到人KGF-2的cDNA，該基因定位於人第5號染色體5pl2-5pl3，人FGF-10由624個核甘酸組成，編碼208個胺基酸，分子量為19.3KD，與KGF-1有57%的同源性。KGF-2主要由間充質細胞合成，通過與上皮細胞細胞膜上的受體作用，特異性促進上皮細胞的增殖、分化和遷移，是胚胎器官發育中重要的多功能信號分子。KGF-2與KGF-1的生物學功能到目前研究為止有許多相同之處，如都能增加表面外胚層來源的上皮細胞增生，對其它細胞則無作用；由間充質細胞產生，以旁分泌的方式作用於上皮細胞等。但KGF-2在促進創傷癒合、減少瘢痕形成等方面優於KGF-l，這些特點使KGF-2更適合於開發新的治療創傷的基肉工程藥物。KGF-2能夠通過刺激表皮細胞的增殖、遷移和分化直接促進傷口的癒合，在組織的重塑過程中起趨化作用。KGF-2通過與損傷位點黏膜的表皮細胞上的受體結合，引起細胞向受傷處遷移，保護角質細胞免受R0S誘導的細胞凋亡，由此來加快傷口的癒合。此外，KGF-2同時也能通過刺激其他在組織修復和再生過程中有著非常重要作用的細胞因子(如血小板衍生生長因子、轉化生長因子和成纖維細胞生長因子)的表達來間接作用於組織的重塑。KGF-2對皮膚的切口損傷修復過程有明顯的改善，可用於加速外科手術後的傷口癒合。此外，KGF-2對移植皮膚的癒合也具有極顯著的促進作用。這可能是因為它能夠增加傷口處的機械張力和傷口膠原蛋白含量，促進表皮細胞的生長，加快上皮和肉芽組織的形成，加速創口癒合。因此KGF-2可能是細胞內起動和加速傷口癒合的一個十分重要的媒介物。同時有研究表明，在這一過程中KGF-2能夠增加TGF-a和PDGF-AB的分泌，而這一效應說明KGF-2可能正是作用於角質細胞、纖維原細胞和內皮細胞，以及促進表皮再生的媒介分子。KGF-2對於異體骨髓移植後引起的移植物抗宿主病也有一定的抑制作用。異體骨髓移植是惡性血液疾病的首選治療方法，這個方法的效果與移植物抗白血病反應有很大的關係，而GVHD則是使骨髓移植受限的主要因素，是異體骨髓移植術後的主要併發症，急性GVHD主要引起皮膚、肝臟和腸道等多器官上皮細胞壞死。Clouthier等用鼠科動物BMT模型B63B6D2F1來研究KGF-2對於GVHD的影響。受試小鼠在給予KGF-2(每天5mg/kg)後，全身性的GVHD和靶器官的組織病理方面均有明顯的降低。與對照組相比，KGF-2同時還導致小鼠的血清中腫瘤壞死因子-a水平和脂多糖水平的下降。相反，KGF-2並不影響T細胞的增殖、細胞因子的產生或對抗宿主抗原的細胞毒反應。動物模型的研究表明，在預防輻射對正常機體造成的損傷方面，KGF-2有非常顯著的作用。它能提高骨髓對全身輻射的耐受性，保護小腸隱窩免受輻射損傷，降低輻射引起的胃腸道損傷，預防黏膜炎的發生，並能調節和維持幹細胞的分裂及存活。此外，KGF-2對漬瘍和腸炎也有很好的療效，靜脈注射KGF-2幾乎能完全恢復小鼠腸道表面的正常細胞構造，顯著降低急性和慢性腸損傷。持續的KGF-2給藥，能維持小鼠正常體重，改善宏觀和微觀腸炎症和潰瘍，並且沒有明顯的毒副作用。目前，美國人類基因組科學公司正在進行三項KGF-2的II期臨床實驗一是靜脈潰瘍；二是骨髓移植前高劑量化療引起的黏膜炎；三是潰瘍性大腸炎。其中靜脈潰瘍的實驗已基本完成，實驗結果顯示了KGF-2良好的療效和安全性。KGF-2作為一種新型多肽類藥物有著廣闊的開發和應用前景。目前國際上的rhKGF-2大腸桿菌表達系統生產工藝，其表達產物無論是否以可溶性蛋白形式存在，都表達於胞漿內，且必須經過超聲波破碎菌體後才能使蛋白釋放出來，不但對蛋白本身有破壞作用，而且也增加了純化的難度與成本。因此，本領域迫切需要開發一種新型簡易的製備方法，在不用通過超聲波完全破碎菌體的情況下就能夠獲得人角質細胞生長因子-2，從而減少粗提時對蛋白的破壞，簡化純化步驟，提高成品的產量。
發明內容本發明的目的是提供一種簡便並且高效的製備rhKGF-2的方法。本發明的另一目的是提供一種用於該方法的表達載體和宿主細胞。在本發明的第一方面，提供了一種優化的表達人角質細胞生長因子-2的表達載體，它含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細胞周質中表達，即為pET22b(+)。在本發明的第二方面我們將KGF-2正確編碼序列應用^Vco/禾n歷V^/7/酶切後插入到分泌信號肽pe/5的後面，這樣設計的好處在於我們可以得到與天然KGF-2胺基酸序列相同的蛋白質序列而不用擔心有其他雜質胺基酸摻入。在本發明的第三方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發明上述的表達載體編碼人角質細胞生長因子-2的DNA序列。所述的宿主細胞是大腸桿菌BL21(DE3)。該菌體的細胞壁較脆弱，在反覆凍融的條件下就可破裂，釋放出周質間隙中的蛋白。在本發明的第四方面，提供了一種生產人角質細胞生長因子-2的方法，它包括步驟(a)通過LB培養基和改良種子培養基進行工程菌的活化和擴增，在適當的罐內培養基及補料方式，培養參數控制條件下表達外源蛋白角質細胞生長因子-2;(b)通過低溫高速離心或超濾方式獲得含外源蛋白角質細胞生長因子-2的菌體。在另一優選例中，所述的表達載體是含IPTG誘導的啟動子的表達載體pET22b(+)-rhKGF-2，或者所述的宿主細胞是大腸桿菌。在另一優選例中，在步驟(a)中進行高密度發酵。在另一優選例中，所述的步驟(b)包括步驟(i)採用凍融破碎發酵菌體，低溫高速離心棄沉澱收上清；(ii)通過鹽析和或超濾對破菌液上清液進行初步純化；(iii)柱層析採用陽離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析及其組合。在另一優選例中，所述的培養條件是培養溫度為3237'C，更佳地3537°C;pH在68之間，更佳地在6.87.3之間；葡萄糖或甘油濃度為110%，更佳地在36%;誘導劑IPTGO.1lmM，更佳地在0.50.8raM;誘導前0D,在0.820之間，更佳地在1518之間；誘導時間28小時，更佳地46小時。圖1:表達載體pET22b(+)-rhKGF-2的構建線路圖。具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，用優選的載體pET22b(+)進行表達，該載體有助於rhKGF-2真核基因在原核中的正確摺疊，並以可溶性形式分泌到細胞周質間隙中，只通過反覆凍融菌體就可釋放出目的蛋白，從而簡化了分離純化工藝。在另一優選例中，用本發明優化的hKGF-2編碼序列轉化的大腸桿菌BL21(DE3)，經高密度發酵培養，IPTG誘導，rhKGF-2以可溶、活性形式存在於細胞周質，同時簡便純化工藝，通過反覆凍融的方法即可以破碎菌體，獲得高表達、高得率、極具產業化價值的一種製備rhKGF-2的方法。本發明的載體包括表達質粒，例如含IPTG誘導的啟動子的質粒表達載體，且在所述表達載體中插入了人角質細胞生長因子-2(rhKGF-2)的編碼序列。一種特別優選的表達載體是載體pET20b(+)、pET22b(+)、pET26b(+)和pET27b(+)。適用於本發明的宿主菌是原核宿主細胞，尤其是大腸桿菌BL21(DE3)。通常，在KGF-2優選序列的5'端與3'端分別加起始密碼子和終止密碼子，並引入特異性酶切位點，然後克隆入含IPTG誘導的啟動子的表達質粒中，轉化與表達載體相容的大腸桿菌宿主菌，經篩選鑑定後獲得工程菌。本發明的工程菌屬於IPTG誘導型。在本發明中，工程菌表達rhKGF-2的發酵條件沒有特別限制。可以採用本領域常規的發酵條件。通常，工程菌在以蛋白腖、酵母粉、NHX1等為氮源，甘油、葡萄糖、糖蜜等為碳源，磷酸鹽等為無機鹽，添加維生素及微量元素作為基礎培養基；並通過控制參數(pH、溫度、罐壓、攪拌速度等)的調節及流加方式(酸鹼及營養元素)，調節溶氧(D0)，比生長速率等因素，減少乙酸的積累，提高了菌體產量及表達水平。對於培養基的選擇，通常包括氮源、碳源、無機鹽、維生素、微量元素等的選擇。(a)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源為蛋白腖、酵母粉的混合物，總濃度1.5-4%;無機氮源如氨水或NHX1等銨鹽，濃度0.41%。(b)無機鹽包括磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽等。較佳的磷酸鹽緩衝體系濃度2050mM，pH6.57.5;鎂鹽、l丐鹽濃度為0.11慮。(c)在培養基中添加維生素B作為生長因素，濃度150ug/L。(d)微量元素包括Fe3+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、硼酸等，濃度為10—810—6mM。(e)碳源包括甘油、葡萄糖、糖蜜等。可以是單一碳源，也可以是混合碳源。較佳的甘油濃度為36%;葡萄糖濃度為35%。(f)誘導劑使用IPTG，較佳的濃度在0.50.8mM;(g)培養階段溶氧(D0)30X以上，誘導階段在50%以上；pH培養階段控制在6.87.0，誘導階段控制在7.27.4;溫度培養階段控制在3537°C，誘導階段控制在3032°C;在發酵表達rhKGF-2後，以離心方式去除發酵液上清，獲得菌體。應用反覆凍融的方式進行破菌，用緩衝溶液懸浮菌體後，對粗提液進行離心，去沉澱，收穫上清液。粗提液可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化後再進行層析純化，也可直接進行層析純化。適用於本發明的層析技術包括陽離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析。(a)離子層析。選擇CMS印haroseFastF凝膠介質，鹽梯度洗脫。(b)親和層析選擇肝素親和H印arinS印haroseCL-6B凝膠介質，鹽梯度洗脫。經過二步純化，可得到純度95X以上的rhKGF-2蛋白。純化後rhKGF-2可用常規技術製成各種劑型。在本發明的一個實例中，選擇了有助於真核基因在原核細胞中正確翻譯的分泌型質粒載體含IPTG誘導的啟動子的表達載體，且在所述表達載體中插入了rhKGF-2的編碼序列，構建高效、穩定分泌表達的rhKGF-2工程菌(大腸桿菌)。經高密度發酵培養，IPTG誘導，rhKGF-2以可溶形式存在於細胞周質；表達水平高，佔菌體總蛋白20%左右。由於表達水平較高，rhKGF-2又可以分泌到細胞周質中，且具有天然活性，不但避免了粗提過程對蛋白質的破壞，而且提高了純化收率，降低了成本。通過簡便、快速的純化方法，即獲得高質量的rhKGF-2純品。本發明的優點在於(1)表達工藝簡單。(2)表達量高。通過補料方式，使表達水平達到20%以上，菌體產量達60g/L以上。(3)純化工藝簡便，回收率高。由於蛋白可以分泌到細胞周質中表達，因此簡化了純化工序，提高了成品率，使大規模生產rhKGF-2成為可能。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法。實施例1rhKGF-2表達工程菌的構建1.目的基因的合成根據已知的rhKGF-2的天然胺基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性並考慮消除髮夾結構等不利於表達的二級結構，在不改變胺基酸序列的條件下，設計rhKGF-2的編碼序列引物。通過搭橋PCR方法獲得rhKGF-2的全長序列。人工合成重組人角質細胞生長因子-2(rhKGF-2)基因的全序列時，在該基因的5，端引入.NcoI酶切位點及在3，端引入HindIII酶切位點。2.表達質粒-pET22b(+)-rhKGF-2的構建與轉化宿主菌表達質粒為購自InVitrogen公司的pET22b(+)表達載體(該表達載體含有IPTG誘導的啟動子和peIB分泌信號態)，宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。用Ncol和HindIII雙酶切分別處理基因rhKGF-2和表達載體pET22b(+)，37'C酶切2小時回收相應的片段用T4DNA連接酶在16"C連接過夜。連接產物轉化進入大腸桿菌，在含有氨苄青黴素(100ug/mU的LB平板上挑選陽性克隆並進行質粒酶切鑑定抽提的質粒DNA用限制性內切酶及Ncol+Hindlll在37'C反應3小時，得到在pET22b(+)中插入了rhKGF-2基因的重組質粒pET22b(+)-rhKGF-2。利用菌落PCR進行陽性鑑定。應用NcoI+HindlII雙酶切時，能切出大小約500bp的片段，表明序列已正確插入載體pET22b(+)中。酶切鑑定結果顯示經過NcoI+HindlII雙酶切後，能從電泳上看到大小約500bp左右的片段，以上情況說明KGF-2基因己正確插入載體pET22b(+)中。此外，用常規方法進行正、逆向序列分析，委託大連寶生物公司進行序列的測定，證實克隆序列與設計序列完全一致。搖瓶試驗，該工程菌培養後，經IPTG誘導2小時後，目的蛋白表達量佔總蛋白20%左右。實施例2合適表達載體的選擇按照實施例1類似的方法，將KGF-2序列分別插入幾個不同的表達載體，如pET28a(+)(購自invitorgen公司)、pET29a(+)(購自invitrogen公司)、pET-30Ek/LIC購自invitorgen公司)的相同酶切位點(NcoI/Hindin)，獲得質粒pET28a(+)—rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF—2，pET—30Ek/LIC-rhKGF-2。將質粒pET28a(+)-rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF-2，pET-30Ek/LIC-rhKGF-2分別轉化相應的宿主菌，挑選出抗性菌株。與含質粒pET22b(+)/rhKGF-2的工程菌一起進行搖瓶試驗，經IPTG(或阿拉伯糖)誘導2小時後，含質粒pET22b(+)-rhKGF-2的工程菌表達的目的蛋白表達量佔總蛋白20%左右，而含質粒pET28a(+)-rhKGF-2、pET29a(+)-rhKGF-2，pET-30Ek/LIC-rhKGF-2的工程菌表達的目的蛋白表達量分別佔總蛋白10%,12%和15%。這表明，pET22b(+)-rhKGF-2表達載體優於其他表達載體。實施例3選擇最佳培養基挑實施例1中製備的轉入pET22b(+)-rhKGF-2的大腸桿菌BL21(DE3)單克隆，接種到含50mlLB種子液的250ml三角燒瓶中，培養34hr，待OD,達到0,81.0，按1:10的比例接種於含250ml改良種子液的誦ml三角燒瓶中，培養810h左右，待0D,達到68，按1:10上罐發酵，流加碳源(甘油)、鎂鹽、氨水調節pH6.87.0、溫度37°C、D0〉30%，待OD,達到1518，加入0.50.8raMIPTG開始誘導，適當補加碳源(甘油)、氮源、磷酸鹽緩衝液調節pH7.27.4、D0>50%、溫度3032。C、誘導45hr結束。樣品進行SDS-PAGE檢測(並掃描)、測定蛋白含量。tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13實施例4工程菌高密度發酵的研究接種到含50mlLB種子液的250ml三角燒瓶中，培養34hr，待OD,達到0.81.0，按1:10的比例接種於含250ml改良種子液的1000ml三角燒瓶中，培養810h左右，待0De。。達到68，按1:10上罐發酵，流加碳源(甘油)、鎂鹽、氨水調節pH6.87.0、溫度37°C、D0〉30%，待OD,達到1518，加入0.50.8raMIPTG開始誘導，適當補加碳源(甘油)、氮源、磷酸鹽緩衝液調節pH7.27.4、D0〉50%、溫度3032°C、誘導5hr結束。樣品進行SDS-PAGE檢測(並掃描)、測定蛋白含量。實施例5rhKGF-2的純化發酵液在4。C下5000rpm離心10min，得菌體，菌體-8(TC速凍24h後室溫緩慢融化，再-2(TC冷凍7天後室溫緩慢融化。顯微鏡觀察，菌體細胞壁破裂，成為原生質球。20000rpm離心30min，得上清。超濾濃縮及更換緩衝液使用狙llipore超濾器，超濾膜截流分子量為IOKD，超濾時留取濃縮液(作用是去除小分子雜質和鹽類)。1.層析2(陽離子層析)層析介質CMS印haroseFastF緩衝液溶液A:PBS(PH7.4，20raM)溶液B:PBS(PH7.4，20mM)+1MNaCl上樣將超濾濃縮的rhKGF—2溶液上樣。清洗上樣後用6CV的溶液A清洗層析柱。梯度清洗後用10CV將溶液B從0%升至100%。收集收集rhKGF-2樣品峰。2.層析2(親和層析)層析介質-HeparinSepharose(X-6B緩衝液溶液A:PBS(PH7.4，20mM)溶液B:PBS(pH7.4，20mM)+lMNaCl上樣將離子交柱層析蛋白溶液上樣。清洗上樣後用6CV的溶液A清洗層析柱。梯度清洗後用10CV將溶液B從0X升至100X。收集收集rhKGF—2樣品峰。樣品經過此二步純化，即離子層析、親和層析以後，純度提高至95%以上。權利要求1.一種分泌表達重組人角質細胞生長因子-2的製備方法，其特徵在於，提供了一種優化的表達人角質細胞生長因子-2的表達載體，它含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細胞周質中表達，即為pET22b(+)。2.權力要求1所述的製備方法，提供了一種大腸桿菌細胞，它含有本發明所述的表達載體和編碼人角質細胞生長因子-2的DNA序列。該宿主細胞壁較脆弱，在反覆凍融的條件下就可破裂，釋放出周質間隙中的蛋白，即為BL21(DE3)。3.權力要求1所述的製備方法，提供了一種裂解重組蛋白的製備方法，即將宿主細胞低溫反覆凍融，在不破壞細菌內膜的情況下即可使重組蛋白釋放到緩衝液中。全文摘要本發明提供了一種分泌表達重組人角質細胞生長因子-2的製備方法，該方法提供了一種重組人角質細胞生長因子-2的表達載體，它含有分泌信號肽編碼序列，能將KGF-2蛋白分泌到細胞周質中進行表達，含有此重組質粒的宿主細胞經低溫反覆凍融，在不破壞細菌內膜的情況下即可使重組蛋白釋放到緩衝液中，不破壞蛋白的活性。文檔編號C12N15/12GK101538571SQ20081003015公開日2009年9月23日申請日期2009年2月17日優先權日2009年2月17日發明者劉孝菊,娜姚,張雲龍,李校堃,萍楊,王會巖,王曉傑,王豔芳,田海山,健肖,肖業臣,黃亞東,黃志鋒申請人:溫州醫學院;廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司;吉林農大生物反應器工程有限公司