甲胎蛋白含量的檢測方法
2023-05-12 11:05:41
甲胎蛋白含量的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種甲胎蛋白含量的檢測方法，包括如下步驟：將待測樣品、半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液混合，加入緩衝液後在37℃下溫育20min；溫育完成後的反應體系用洗滌液洗滌除雜，接著加入所述緩衝液，並用300nm的激發波長和605nm的發射波長的螢光分光光度計測定螢光值；以及根據測得的螢光值得到待測樣品的甲胎蛋白含量。通過半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體和羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體結合甲胎蛋白形成了通過螢光分光光度計檢測而監控的夾心免疫反應，這種甲胎蛋白含量的檢測方法具有較高的靈敏度和精確度。
【專利說明】甲胎蛋白含量的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫螢光領域，特別是涉及一種甲胎蛋白含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 1956年，Bergstrandh和Czar發現了甲胎蛋白（AFP)。AFP是一種單聚肽糖蛋白， 其平均分子量約為68000Da。作為在胎兒血清裡的一種特殊蛋白，正常成人的肝細胞失去了 合成AFP的能力。在健康成人體內，AFP的濃度比低於3. 4ng/mL的平均值。
[0003] 臨床研究表明，血清AFP的敏感性為41-65%，特異性80-94% (臨界值為ng/mL)。 AFP-般只可用於肝癌的監視，診斷和監測作為血清學標誌物。如果甲胎蛋白水平在手術不 降低，復發的可能性較大。伴有高水平AFP的患者在治療後比普通水平患者的存活率要低。
[0004] 酶聯免疫吸附測定（ELISA)和化學發光酶免疫測定（CLEIA)經常被用來檢測血 清中AFP的水平。然而，酶聯免疫吸附法具有如再現性差，低靈敏度和線性範圍窄的限制。 CLEIA被認為是準確和可靠的，但其缺點是短暫的照明時間。
[0005] 半導體量子點（QDs)擁有高亮度和螢光的持續時間長等獨特的光學性質，所以它 的出現引起相當大的關注。目前，QDs已經被開發成為一類新的高靈敏度和高發光強度的 探針並且沒有有機染料和螢光蛋白的固有局限性。與其他發光標記物相比，QDs具有獨特 的光學和電子特性，例如高亮度和狹窄發射帶以及其它優於傳統的有機螢光團。QDs已在活 的動物和細胞成像中用於作為對腫瘤顯像的螢光標記。
【發明內容】
[0006] 基於此，有必要提供一種基於半導體量子點的甲胎蛋白含量的檢測方法。
[0007] -種甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟：
[0008] 將待測樣品、半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和羧基化標準磁珠標記的 抗甲胎蛋白抗體溶液混合，加入緩衝液後在37°c下溫育20min，其中，半導體量子點標記的 抗甲胎蛋白抗體溶液和羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液中各自的抗甲胎蛋白 抗體不同；
[0009] 溫育完成後的反應體系用洗滌液洗滌除雜，接著加入所述緩衝液，並用300nm的 激發波長和605nm的發射波長的螢光分光光度計測定螢光值；以及
[0010] 根據測得的螢光值得到待測樣品的甲胎蛋白含量。
[0011] 在一個實施例中，進行溫育的反應體系中，所述待測樣品、所述半導體量子點 標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和所述羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液的加 入量的體積比為2 :3 :3,半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液的濃度為16. 5i!g/ mL?18. 3yg/mL，羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液的濃度為20. 4yg/mL? 23. 8ug/mL。
[0012] 在一個實施例中，所述半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下步驟制 備：
[0013] 將半導體量子點溶液與1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶液混 合，接著加入抗甲胎蛋白抗體和所述緩衝液，37°C搖動下溫育3小時進行耦合反應，接著加 入pH為7. 4的TIRS-HCl使耦合反應停止，最後將反應體系以3000rpm/min的速度離心20 分鐘，棄去上清並加入所述緩衝液，得到所述半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
[0014] 在一個實施例中，所述半導體量子點溶液為CdSe半導體量子點溶液。
[0015] 在一個實施例中，所述羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下操作 製備得到：
[0016] 將羧基化標準磁珠用活化液洗滌至少三次，接著1-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基） 碳二亞胺鹽酸鹽溶液混合，37°C搖動溫育lOmin，接著加入抗甲胎蛋白抗體同時37°C搖動 下溫育2h，最後加入所述緩衝液，得到所述羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。 [0017]在一個實施例中，所述活化液為含有4mg/mL的1-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基） 碳二亞胺鹽酸鹽的PBS緩衝液。
[0018] 在一個實施例中，所述緩衝液為PBS緩衝液，所述洗滌液為含有質量百分數為 0? 05%的吐溫20的濃度為0? 05mol/L的（羥甲基）氨基乙烷（Tris)溶液。
[0019] 在一個實施例中，根據測得的螢光值得到待測樣品中甲胎蛋白含量的操作為：對 若干組不同濃度的已知含量的甲胎蛋白溶液進行與所述待測樣品相同的處理，根據測得的 甲胎蛋白溶液的螢光值，得到線性擬合曲線，將得到的所述待測樣品的螢光值帶入所述線 性擬合曲線，得到所述待測樣品的甲胎蛋白含量。
[0020] 在一個實施例中，所述若干組不同濃度的甲胎蛋白溶液中的甲胎蛋白的濃度分別 為：0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、100ng/mL和 400ng/mL〇
[0021] 在一個實施例中，反應體系溫育完成後到完成螢光值測定的時間間隔不超過3h。
[0022] 這種甲胎蛋白含量的檢測方法，通過半導體量子點和羧基化標準磁珠去標記兩種 不同抗甲胎蛋白的單克隆抗體。半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體和羧基化標準磁珠標 記的抗甲胎蛋白抗體結合甲胎蛋白形成了通過螢光分光光度計檢測而監控的夾心免疫反 應。這種甲胎蛋白含量的檢測方法用於甲胎蛋白含量具有較高的靈敏度和精確度，顯示出 其在臨床實驗室中應用的巨大潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為一實施方式的有機聚合物基導熱微球的製備方法的流程圖；
[0024]圖2為通過使用三個不同的激發波掃描的QDs抗體偶聯物的光譜達到最佳信號得 到的光譜圖；
[0025] 圖3為溫育時間和免疫測定的靈敏度的曲線關係。
【具體實施方式】
[0026] 為使本發明的上述目的、特徵和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明 的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發 明。但是本發明能夠以很多不同於在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不 違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
[0027] 本發明中使用的部分藥品和儀器如下：1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基）碳二 亞胺鹽酸鹽（EDC)購自Sigma-Aldrich公司（密蘇裡州，美國）。牛血清白蛋白（BSA) 從北京JingKeHongDa生物技術有限公司（北京，中國）購買。CdSeQDs605自Life Technologies(AB&Invitrogen公司）（卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國）購得。羧基化標 準磁珠（珠）從Ademtech有限公司（佩薩克，法國）購買。兩種不同鼠抗人甲胎蛋白單克 隆抗體（AFP-3，AFP-28)從Fapon生物科技股份有限公司公司（深圳，中國）獲得。繁殖和 搖晃的程序在恆溫容器（FYL-YS，中國）和振動篩（ZXWL-100,中國）中進行。使用Hitachi F-4600螢光分光光度計（日本東京）進行免疫程序。
[0028] 結合圖1，一實施方式的甲胎蛋白含量的檢測方法，包括如下步驟：
[0029]S10、將待測樣品、半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和羧基化標準磁珠標 記的抗甲胎蛋白抗體溶液混合，加入緩衝液後在37°C下溫育20min。
[0030] 待測樣品可以為血清。
[0031] 半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白 抗體溶液中，被半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體與被羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋 白抗體不同。本實施例中，兩種抗甲胎蛋白抗體分別為AFP-3,AFP-28(從Fapon生物科技 股份有限公司公司獲得，深圳）。
[0032] 進行溫育的反應體系中，待測樣品、半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和 羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液的加入量的體積比為2 :3 :3,半導體量子點標 記的抗甲胎蛋白抗體溶液的濃度為16. g/mL?18. g/mL，羧基化標準磁珠標記的抗 甲胎蛋白抗體溶液的濃度為20. 4iig/mL?23. 8iig/mL。
[0033] 緩衝液可以為濃度為0.lmol/L的pH為7.4的PBS緩衝液。
[0034] 本實施例中，待測樣品的體積為20yL、半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液 的體積為30iiL、羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液的體積為30iiL、緩衝液的體 積為ImL。
[0035] 半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下步驟製備：將半導體量子點溶 液與1-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶液混合，接著加入抗甲胎蛋白抗體 和所述緩衝液，37°C搖動下溫育3小時進行耦合反應，接著加入pH為7. 4的TIRS-HCl使耦 合反應停止,最後將反應體系以3000rpm/min的速度離心20分鐘，棄去上清並加入所述緩 衝液，得到所述半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
[0036] 具體而言，本實施例中，半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下步驟 製備：將10UL濃度為8iimol/L的半導體量子點溶液與7iiL濃度為L3iimol/L的1-乙 基-3 (3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶液混合，接著加入500iiL濃度為0. 2mg/mL 的抗AFP抗體和100iiL的pH為6. 0的PBS，37°C搖動下溫育3小時進行耦合反應，接著加 入100UL濃度為50mmol/L的pH為7. 4的TIRS-HCl使耦合反應停止，最後將反應體系以 3000rpm/min的速度離心20分鐘，棄去上清並加入ImL濃度為0?lmol/L的pH為7. 4的 PBS，得到所述半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
[0037] 本實施例中，半導體量子點溶液為CdSe半導體量子點溶液。在其他的實施例中， 還可以採用其他的半導體量子點。本實施例的CdSe半導體量子點（QDs)為CdSeQDs605。[0038] 羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下操作製備得到：將羧基化標 準磁珠用活化液洗滌至少三次，接著1-乙基-3 (3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶液 混合，37C搖動溫育lOmin，接著加入抗甲胎蛋白抗體冋時37C搖動下溫育2h，最後加入所 述緩衝液，得到所述羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
[0039] 具體而言，本實施例中，羧基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下操 作製備得到：首先，將810yL質量分數為3%羧基化標準磁珠放入所需的試管然後用活化 液洗滌珠粒三次。其次，加入80L的羧基化標準磁珠的每毫克EDC溶液（4毫克/毫升）， 37°C搖動溫育10分鐘。然後，將25iiL(2毫克/毫升）抗AFP抗體加入到活化了的羧基化 標準磁珠中，然後37°C搖動下溫育2小時。最後，加入2mL緩衝液，得到羧基化標準磁珠標 記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
[0040] 活化液為含有4mg/mL的EDC的PBS緩衝液。
[0041] S20、將SlO得到的溫育完成後的反應體系用洗滌液洗滌除雜，接著加入上述緩衝 液，並用300nm的激發波長和605nm的發射波長的螢光分光光度計測定螢光值。
[0042] 本實施例中，緩衝液的加入量為lmL。
[0043] 通過使用三個不同的激發波（300nm，370nm，400nm)掃描的QDs抗體偶聯物的光譜 達到最佳信號，得到偶聯量子點的單克隆抗體在300nm、370nm和400nm激發波長的發射光 譜如圖2所示。
[0044] 由圖2可以看出，透射波長（605nm)是獨立的激發波長。無論是在300nm，370nm 還是400nm下，透射的形狀保持不變，而300nm的強度最強。因此，設定最佳的激發和透射 波分別為300nm和605nm。
[0045] 洗滌液為含有質量百分數為0? 05%的吐溫20的濃度為0? 05mol/L的（羥甲基） 氨基乙烷（Tris)溶液。
[0046] 特別的，反應體系溫育完成後到完成螢光值測定的時間間隔不超過3h。
[0047] 為了測試QDs抗體偶聯物的持續時間，選擇同一樣品的螢光強度分別在1小時，2 小時，4小時，12小時，1天和2天。結果發現，免疫複合物的螢光強度3小時後變小，12小 時後失去了三分之一，1天後消失。
[0048] 因此，設定反應體系溫育完成後到完成螢光值測定的時間間隔不超過3h。
[0049] S30、根據S20測得的螢光值得到待測樣品的甲胎蛋白含量。
[0050] 根據測得的螢光值得到待測樣品中甲胎蛋白含量的操作為：對若干組不同濃度的 已知含量的甲胎蛋白溶液進行與所述待測樣品相同的處理，根據測得的甲胎蛋白溶液的熒 光值，得到線性擬合曲線，將得到的待測樣品的螢光值帶入線性擬合曲線，得到待測樣品的 甲胎蛋白含量。
[0051] 得到線性擬合曲線可以為：在雙重wells中測定校準器和樣品，平均螢光強度值； 通過繪製AU(Y)和分析物濃度（X)得到一個四參數線性擬合標準曲線。
[0052] 具體而言，本實施例中，若干組不同濃度的甲胎蛋白溶液中的甲胎蛋白的濃度分 別為：0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、100ng/mL和 400ng/mL，並且分別記為SQ、SpS2、S3、 S4和S5。甲胎蛋白溶液用BSA/PBS溶液（0?Olmol/L的磷酸氫二鈉，0? 003mol/L的KH2PO4, 0? 15mol/L的NaCl，10g/L的BSA，pH為 7. 4)配製。
[0053] 對溫育時間可能對免疫測定的靈敏度進行測定，AFP標準品濃度為2ng/ml，量子 點偶聯的AFP抗體稀釋比例為1:80,羧基化標準磁珠偶聯的AFP抗體稀釋比例為1:50,得 到免疫反應溫育時間優化效果圖如圖3所示。
[0054] 如圖3所示，因為免疫複合物的量增加，A.U.(螢光單位強度值）值隨反應時間的 增加而增加到20分鐘。20分鐘後，A.U.值緩慢下降，這表明反應是在抗原和抗體之間達到 平衡。
[0055] 因此，設定溫育時間為20分鐘。
[0056] 對免疫測定試劑進行優化。
[0057] 免疫反應試劑是影響免疫測定靈敏度的一個關鍵參數。在實驗中，對QDs標記的 抗AFP抗體和羧基化標準磁珠標記的抗AFP抗體原液的稀釋率進行了研究。QDs標記的抗AFP抗體原液稀釋的稀釋緩衝液的稀釋比率為1 :10至1 :100。用校正曲線來研究的免疫測 定試劑的優化。如表I顯示，1 :80的稀釋比被選擇為最佳比率，因為它對應了最寬的線性 範圍（最高AUS5/AUS0)和最高靈敏度（最高AUS1/AUS0)。
[0058]
【權利要求】
1. 一種甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟： 將待測樣品、半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和駿基化標準磁珠標記的抗甲 胎蛋白抗體溶液混合，加入緩衝液後在37C下溫育20min，其中，半導體量子點標記的抗甲 胎蛋白抗體溶液和駿基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液中各自的抗甲胎蛋白抗體 不同； 溫育完成後的反應體系用洗塗液洗塗除雜，接著加入所述緩衝液，並用300nm的激發 波長和605nm的發射波長的英光分光光度計測定英光值；W及 根據測得的英光值得到待測樣品的甲胎蛋白含量。
2. 根據權利要求1所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，進行溫育的反應體 系中，所述待測樣品、所述半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液和所述駿基化標準磁 珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液的加入量的體積比為2 ;3 ;3,半導體量子點標記的抗甲胎蛋 白抗體溶液的濃度為16. 5 y g/mL?18. 3 y g/mU駿基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體 溶液的濃度為20. 4 y g/mL?23. 8 y g/mL。
3. 根據權利要求1所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，所述半導體量子點 標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下步驟製備： 將半導體量子點溶液與1-己基-3 (3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶液混合，接 著加入抗甲胎蛋白抗體和所述緩衝液，37巧惡動下溫育3小時進行禪合反應，接著加入抑 為7. 4的TIRS-HC1使禪合反應停止，最後將反應體系W 3000rpm/min的速度離也20分鐘， 棄去上清並加入所述緩衝液，得到所述半導體量子點標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
4. 根據權利要求3所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，所述半導體量子點 溶液為CdSe半導體量子點溶液。
5. 根據權利要求1所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，所述駿基化標準磁 珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液通過如下操作製備得到： 將駿基化標準磁珠用活化液洗塗至少H次，接著1-己基-3 (3-二甲基氨基丙基）碳二 亞胺鹽酸鹽溶液混合，37C搖動溫育lOmin，接著加入抗甲胎蛋白抗體同時37C搖動下溫 育化，最後加入所述緩衝液，得到所述駿基化標準磁珠標記的抗甲胎蛋白抗體溶液。
6. 根據權利要求5所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，所述活化液為含有 4mg/mL的1-己基-3 (3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽的PBS緩衝液。
7. 根據權利要求1所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，所述緩衝液為PBS緩 衝液，所述洗塗液為含有質量百分數為0. 05%的吐溫20的濃度為0. 05mol/L的（輕甲基） 氨基己焼（Tris)溶液。
8. 根據權利要求1所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，根據測得的英光值 得到待測樣品中甲胎蛋白含量的操作為；對若干組不同濃度的已知含量的甲胎蛋白溶液 進行與所述待測樣品相同的處理，根據測得的甲胎蛋白溶液的英光值，得到線性擬合曲線， 將得到的所述待測樣品的英光值帶入所述線性擬合曲線，得到所述待測樣品的甲胎蛋白含 量。
9. 根據權利要求8所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，所述若干組不同濃 度的甲胎蛋白溶液中的甲胎蛋白的濃度分別為；Ong/mL、2ng/mL、Wng/mL、5ng/mL、lOOng/ 血和400ng/血。
10.根據權利要求8所述的甲胎蛋白含量的檢測方法，其特徵在於，反應體系溫育完成 後到完成英光值測定的時間間隔不超過化。
【文檔編號】G01N33/68GK104345155SQ201410597084
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】謝妮, 李仲航, 齊素文 申請人:深圳市第二人民醫院