一種定量指導孕前及孕期葉酸補充劑量的試劑盒的製作方法

2023-05-12 23:39:26 1

專利名稱：一種定量指導孕前及孕期葉酸補充劑量的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種定量指導孕前及 孕期葉酸補充劑量的試劑盒，通過同時檢測與葉酸代謝能力密切相關的5，10-亞甲基四氫 葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)上的單核苷酸多態性位點基 因型來確定適合不同人群的葉酸補充劑量。
背景技術：
葉酸是機體所需的重要營養素，為水溶性B族維生素，在綠葉蔬菜、水果及動物肝 髒中含量豐富。葉酸在人體內以四氫葉酸的形式起作用，四氫葉酸是一碳單位的運載體，可 運載甲基、甲烯基、甲醛基等一碳單位，參與體內胺基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而葉酸對細 胞分裂增殖、組織修復和機體發育等都是不可缺少的營養素。 對於孕婦，補充葉酸尤其重要。葉酸缺乏會導致兩種結果第一，使同型半胱氨酸 向甲硫氨酸轉化出現障礙，進而導致高同型半胱氨酸血症，後者可引起血管內皮損傷、促進 血管平滑肌細胞增生，引起凝血和纖溶系統功能失調，使血液處於高凝狀態，也是引起妊娠 高血壓症候群的重要因素；第二，引起S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸比值降低，抑 制DNA甲基轉移酶活性和DNA甲基化，造成染色體不分離現象，引起多種胎兒畸形。近年來 發現，血漿中同型半胱氨酸水平升高與習慣性流產、妊娠高血壓症候群(妊高徵)、胎盤早 剝、胎兒生長受限、胎兒畸形、死胎、早產、低體重兒等現象的發生密切相關。
妊娠頭4周是胎兒神經管分化和形成的重要時期，此期葉酸缺乏可增加胎兒神經 管畸形及早產的風險，而很多受孕者在早孕期並沒意識到自己已經懷孕；更有研究顯示，婦 女在服用葉酸4周後，體內葉酸缺乏的狀態才能得到明顯的改善。因此，育齡婦女至少應在 孕前3個月開始，適當多吃富含葉酸的食物和補充葉酸，以確保胚胎早期有一個較好的葉 酸營養狀態，預防胎兒神經管及其他器官畸形的發生。 育齡婦女服用葉酸增補劑時由於個人的遺傳體質不同，存在葉酸代謝能力的差 異，不同人群所需葉酸劑量不能一概而論。如服用劑量不足實際需求，達不到補充葉酸的效 果；而盲目過量服用高濃度葉酸，會干擾孕婦的營養元素代謝，同樣會影響胎兒發育，超量 服用葉酸也會引起藥品不良反應，反而會對孕婦和胎兒造成嚴重不良後果。所以不同身體 狀況與素質的育齡婦女必須根據自身情況，有的放矢地準備與補充所需要的葉酸。
因此，選取與育齡婦女孕前/孕期以及胎兒發育所需的葉酸代謝密切相關且研究 明確的一些重要基因位點，綜合利用現代科學研究成果，開發一項基於分子遺傳基礎的葉 酸增補劑服用定量指導產品，將能夠針對不同遺傳體質人群提出適合其自身需求的葉酸補 充劑量指導，具有很強的社會意義和廣闊的市場前景。 目前，經證實並且機理研究清楚的與葉酸代謝密切相關的基因有5，10-亞甲基 四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)。 MTHFR為5， lO—methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亞甲基四氫葉 酸還原酶)蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5_甲基四氫葉酸鹽。5-甲基四氫葉酸鹽可以進一步進入甲基傳遞通路， 通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接的為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基並且 使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個較低的水平。研究發現，MTHFR基因存在多種多態 型，影響MTHFR活性和熱穩定性。常見的變異包括(1) 677C-T :MTHFR基因第677位密碼子 胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，編碼後酶分子中丙氨酸被纈氨酸替代，引起MTHFR熱穩定 性和活性降低，相對於正常的C/C基因型，純合子T/T基因型MTHFR活性在37攝氏度降低 50 % 60 % ，在46攝氏度降低65 %; (2) 1298A-C :編碼後酶分子中穀氨酸被丙氨酸替代，弓I 起MTHFR活性降低。1298A-C與677C-T不同的是，純合子和雜合子血槳同型半胱氨酸升高 和葉酸降低均不明顯。然而，如果同時存在1298A-C和677C-T複合變異的雜合子，則MTHFR 活性低於野生型40%。 甲硫氨酸是蛋白質合成和一碳代謝的必需胺基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶 (MTR編碼)催化的，而甲硫氨酸合酶因為輔助因子維生素B12被氧化而最終失活。MTRR編 碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨 酸合酶。MTRR能夠保持甲基鈷銨III在一定水平，而甲基鈷銨III是激活蛋氨酸合成酶的 輔助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR變異是造成葉酸/甲基維生 素缺乏症E型的主要原因。MTRR 66A —G多態性，導致蛋氨酸被異亮氨酸替代，使該酶活性 降低。該基因型對同型半胱氨酸水平有顯著影響。有研究指出，MTRR基因A66G多態，血漿 同型半胱氨酸增高，基因型為MTRR 66GG， MTRR 66AG的孕婦或胎兒發生神經管畸形的危險 性較正常對照組增加。

發明內容
基於5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因 (MTRR)上的3個SNP位點多態性可用來評估葉酸代謝遺傳能力的基礎，本發明提供一種定 量指導孕前及孕期葉酸補充劑量的試劑盒。
該試劑盒包括 檢測5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號SNP多態性基因型的特異 性引物對及特異性螢光探針對； 檢測5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801131號SNP多態性基因型的特異 性引物對及特異性螢光探針對； 檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號SNP多態性基因型的特異性引物 對及特異性螢光探針對； 螢光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩衝液、去離 子水等)。 本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上 rsl801133號和rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位 點而設計，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。設計這類引物對是 本領域技術人員能夠輕易完成的。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。
本試劑盒中所述的特異性螢光探針對是指針對5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基 因上rsl801133號和rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出這三個SNP位點基因型的T叫man
探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。特異性螢光探針對可用常規的
探針合成技術進行合成。所有可用於螢光定量PCR法檢測本發明中所述的三個SNP位點的
探針均在本發明範圍內。 本發明試劑盒的組分和含量包括 3 ill IOX螢光定量PCR反應緩衝液， 0. 3 ii 1 25mM dNTP混合液， 1. 8 ii 1 25mM MgCl2溶液， 0. 075 ii 1 (5units/ ii 1) Taq DNA聚合酶， 20iiM特異性引物對每條引物各0. 225iU， 10 ii M特異性螢光探針對每條探針各0. 25 ill ， 去離子水15. 975 ii 1 。 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例1.檢測試劑盒的使用
步驟l:DNA模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。
步驟2 :螢光定量PCR反應 使用檢測試劑盒，進行3次獨立的螢光定量PCR反應，每次反應的體系為總體 積lOiU，包含濃度為20ng/iil的DNA模板2iil、lii1 10X螢光定量PCR反應緩衝液、 0. 1 ii 1 25mM dNTP混合液、0. 6 ii 1 25mM MgCl2溶液、0. 025 ii 1 (5units/ ii 1) Taq DNA聚合 酶、20 ii M的有義引物和反義引物各0. 225 iil、10 ii M的帶VIC螢光探針和帶FAM螢光探針 各O. 25ii 1，去離子水5. 325 ii 1。 在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50C、2分鐘，95°C 、 10分鐘，進行60個循環 的95°C、30秒，6(TC、1分鐘。反應結束後在螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量。
步驟3 :SNP基因型分析 根據試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。
熟悉螢光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識螢光定量PCR儀上顯示的 最終樣品螢光量，根據不同序列探針VIC和FAM螢光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位 點的基因型。 實施例2.應用檢測試劑盒進行葉酸增補劑定量指導的服務
步驟1 :DNA提取 由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠 吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
步驟2 :基因分型檢測 使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號和rs1801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394 號SNP位點分別進行螢光定量PCR檢測，確定這3個SNP位點的基因型。
步驟3 :葉酸增補劑定量指導 通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具葉酸代謝遺傳能力的分析報告單。報告 中詳細說明了被檢測者葉酸代謝遺傳能力的高低，並由醫師向被檢者詳細說明和解讀葉酸 代謝遺傳能力評估分析報告單，給予葉酸增補劑服用定量指導。
權利要求
一種定量指導孕前及孕期葉酸補充劑量的試劑盒，其特徵在於包括同時檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號SNP位點和rs1801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括3iU 10X螢光定量PCR反應緩衝液、0. 3iU 25mM dNTP混合液、1. 8 yl 25mM MgCl2溶液、 0.075ii 1(5units/ii l)Taq DNA聚合酶、20 ii M特異性引物對每條引物各0. 225 ii 1、10iiM 特異性螢光探針對每條探針各0. 25iU、去離子水15. 975 iU。本試劑盒供一人份檢測應 用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
3. 權利要求1所述的試劑盒在定量指導孕前及孕期葉酸補充劑量上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種定量指導孕前及孕期葉酸補充劑量的試劑盒及其應用。該試劑盒包括同時檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)上的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及特異性螢光探針對、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒可用於定量指導孕前及孕期葉酸補充劑量。
文檔編號C12Q1/68GK101760526SQ200810207840
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月26日 優先權日2008年12月26日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:海南主健生物醫學科技有限公司