遞送貨物諸如藥物蛋白和/或遺傳物質的組合物的製作方法

2023-07-13 06:36:46 2

專利名稱：遞送貨物諸如藥物蛋白和/或遺傳物質的組合物的製作方法
遞送貨物諸如藥物蛋白和/或遺傳物質的組合物相關申請的交叉參考本申請要求於2008年2月7日提交的美國臨時專利申請序列號61/026，964的權 益，所述申請全部併入本文作為參考。
背景技術：
脂質體已被通常地嘗試用於遺傳物質的遞送(在Simoes，et al.，Expert Opin. Drug Deliv. 2 =237-254,2005中被評論)。然而，它們具有幾個缺點，包括被血清成分結合 (Pedroso de Lima, et al.，Curr. Med. Chem. 10 :1221_1231，2003)、在血管內皮細胞中優先 的吸收(Dass and Choong, J. Control Release 113 :155_163，2006)和差的全身性遞送。靴 向部分已允許向肺(Kawakami, et al.，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 19 171—190， 2002)和肝(Kawakami, et al.，Pharm. Res. 17 :306_313，2000)的特異性遞送。使用脂質體的生物活性蛋白遞送更多地停留在實驗室操作上(Sells，et al.， Biotechniques 19 :72_76，78，1995)，並且其它的方法諸如病毒體已顯示出一些優越性 (Bungener, et al. ,Biosci. Rep. 22 =323-338,2002) 因此，這表明了一個顯然需要新的方 法和組合物的領域。此外，認為許多組織難於通過全身性脂質體遞送系統進入，包括腦，所以直接注射 技術已不得不被替代採用(Huynh，et al. ,J. Control Release 110 :236_259，2006)。由於 局部注射限制能到達的組織的量，顯然需要向中樞神經系統的全身性遞送。發明概述本公開證明RLIP76脂蛋白體在體內遞送貨物分子、同時保持被遞送貨物的功能 性的顯著能力。RLIP76脂蛋白體能全身性地遞送其貨物，並遞送到特定組織，包括但並不限 於中樞神經系統、肺、肝臟、心臟和腎臟組織。可通過RLIP76脂蛋白體遞送的貨物分子包括 核酸分子、RNA分子、DNA分子、小幹擾RNA(siRNA)分子、反義分子、多核苷酸分子、寡核苷酸 分子；蛋白分子和其它的小分子。RLIP76脂蛋白體可含有一個或更多個貨物分子。在某些 實施方式中，具有一個或更多個貨物分子的RLIP脂蛋白體被口服(經口，orally)給予，用 於貨物分子的體內遞送。在其它的實施方式中，具有一個或更多個貨物分子的RLIP脂蛋白 體在藥學可接受的載體中被遞送。本公開的一個方面涉及RNA幹擾組合物(「RNAi組合物")。這些組合物包括含 有RNAi分子的RLIP76脂蛋白體，RNAi分子例如小幹擾RNA(〃 siRNA" )。RLIP76脂蛋白 體促進功能性RNAi分子在體外或體內運輸到細胞中。在某些實施方式中，為了抑制細胞中 選擇的靶基因、mRNA、或蛋白質的表達，本公開的RNAi組合物被給予。本公開提供向細胞遞送貨物分子的方法，包括將細胞與含有RLIP76蛋白和至少 第一貨物分子的脂蛋白體接觸。在某些實施方式中，細胞是腦、心臟、肝臟、腎臟、肺或眼細 胞。在特定的實施方式中，細胞是神經元，例如多巴胺能的、Y-氨基丁酸能的、血清素能的 或穀氨酸能的神經元，或神經膠質細胞，例如星形膠質細胞或少突膠質細胞。在其它的實施 方式中，細胞是腫瘤細胞。在進一步的實施方式中，細胞是人類細胞。在進一步的實施方式 中，細胞是內皮細胞，例如血管內皮細胞或腦中的血管內皮細胞。
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本公開還提供包含脂蛋白體的組合物，該脂蛋白體包含RLIP76蛋白和貨物分子， 其中該脂蛋白體處於藥學可接受的載體中。在某些實施方式中，藥學可接受的載體配製成 口服、腹膜內、靜脈內、肌肉內、吸入、經黏膜、經皮、呼吸、肺或鼻給藥。此外，本公開提供將貨物分子遞送給需要它的受試者的方法，包括給予受試者治 療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學可接受的載體中的脂蛋白體，其中脂蛋 白體包含RLIP76蛋白和貨物分子。在某些方面，貨物分子是核酸分子或多肽分子。在特定的方面，貨物分子是DNA分 子、RNA分子、反義RNA分子、RNA抑制分子、小或短抑制RNA分子、核酶分子、三鏈體分子、適 配子(aptomer)分子、短髮夾RNA分子、微小RNA分子、小的非編碼RNA分子或小調節RNA 分子。在其它的方面，貨物分子是與組織特異性啟動子或細胞特異性轉錄應答元件可操作 相連的核酸分子。在某些實施方式中，脂蛋白體包含RLIP76和多數貨物分子。在其它的實施方式 中，脂蛋白體進一步包含至少第一治療劑。在其它的實施方式中，脂蛋白體進一步包含靶向 部分，例如細胞特異性或組織特異性靶向部分。在特定的實施方式中，靶向部分是抗體、單 克隆抗體、抗體片段或單鏈抗體、蛋白或蛋白片段、激素或化學部分。在另外的方面，RLIP76蛋白是人類RLIP76蛋白。在其它的方面，RLIP76蛋白是 人類RLIP76蛋白的一個或更多個片段，其單獨或組合地保留RLIP76轉運活性。在特定方 面，RLIP76蛋白是人類N-RLIP761-367和人類C-RLIP76410-655多肽片段的組合。在其它 的方面，RLIP76蛋白是保留RLIP76轉運活性的突變的RLIP76蛋白。在某些實施方式中，貨物分子被遞送到受試者的腦、心臟、肝臟、腎臟、肌肉或肺。 在特定的實施方式中，貨物分子被遞送到腦內的神經元或血管內皮細胞，而在其它的實施 方式中，貨物分子被遞送到腦內的神經元和血管內皮細胞。在進一步的實施方式中，貨物分 子被遞送到受試者內的腫瘤，並且在進一步的實施方式中，貨物分子被遞送到受試者的中 樞神經系統內的腫瘤。本文公開的RLIP76脂蛋白體組合物的代表性實施方式包括作為貨物分子的 SET-I的反義寡聚體。這個貨物分子被RLIP76脂蛋白體全身性地遞送到檢測的幾個組織， 包括腦、肝臟、肺、心臟和腎臟，並且在遞送之後保留功能性，如通過在幾個檢測的組織中 SET-ImRNA的降低和降低的SET-I蛋白表達所顯示。令人驚訝地是，RLIP76脂蛋白體遞送 反義寡聚體較不含有RLIP76的脂質體明顯更有效。貫穿本公開，除非上下文另外指明，詞語「包含」或變體諸如「包括」或「含有」被理 解為意味著「包括，但並不限於」，這樣沒有被明確提到的其它要素也可被包括。此外，除非 上下文另外指明，術語「一 (a)，，的使用可指單個對象或要素，或者它可指多數、或一個或更 多個這樣的對象或要素。此外，除非另外地具體說明，「或」的使用指「和/或」。同樣，除非 另外地具體說明，術語諸如「要素」或「成分」包括包含一個單位的要素和成分以及包含多 於一個單位的要素或成分。將被理解的是，前面的大體描述和後面的詳細描述只是示例性的和說明性的，並 不限制要求保護的本發明。本文使用的節段標題只是為了組織的目的，並不被解釋為限制 描述的主題。在本申請中引用的所有的文件或文件的部分，包括但並不限於專利、專利申 請、文章、書和論文，以其全部明確併入本文作為參考，用於任何目的。在一個或更多個併入的文獻和相似材料限定術語的方式與本申請中該術語的限定相矛盾的情況下，以本申請為準。附圖簡述下面的附圖構成本說明書的一部分，並被包括以進一步證實本發明的某些方面。 通過參考這些附圖的一個或更多個並結合本文示出的特定實施方式的詳細描述，本發明可 被更好地理解。圖IA和

圖1B。圖IA 使用RIPl (RLIP76的小鼠形式)插入位點周圍的引物的PCR 結果。泳道M 分子量標準，泳道1 純合RLIP76小鼠的PCR，泳道2 雜合RLIP76小鼠的 PCR，泳道3:野生型小鼠的PCR。圖1B:使用抗RLIP76抗體的小鼠肝臟和心臟組織的蛋白 質印跡分析。泳道1 分子量標準，泳道2 陰性對照，泳道3和6 野生型RIPl小鼠，泳道4 和7 雜合RIPl小鼠，泳道5和8 純合RIPl小鼠。圖2A和圖2B 使用RLIP76脂質體的蛋白分布。圖2A 純合RIPl敲除小鼠，用含 有RLIP76蛋白的RLIP76脂質體腹膜內處理，48小時之後被處死。標記C的泳道 是來自用無RLIP76的對照脂質體處理的小鼠，而標記R的泳道是來自用RLIP76脂質體處 理的小鼠。圖2Β 用200 μ g RLIP76脂質體在0、72小時和120小時3個劑量處理的純合 RIPl敲除小鼠，接下來在168小時被處死。標記C的泳道是來自用無RLIP76的對照脂質體 處理的小鼠，而標記R的泳道是來自用RLIP76脂質體處理的小鼠。圖3A、圖3B和圖3C是來自對照實驗的數據，其中小鼠被餵養空脂質體(圖3A)、含 有R508核酸(與RLIP76反義)的脂質體(圖3B)以及R508核酸結合RLIP76脂質體(圖 3C)。肺組織(泳道1和6)、肝臟組織(泳道2和7)、心臟組織(泳道3和8)、腦組織(泳 道4和9)和腎臟組織(泳道5和10)的SET-ImRNA表達通過攝入後24小時(泳道1_5) 和72小時(泳道6-10)的RT-PCR分析被檢測。圖4A和圖4B是來自下列研究的數據，其中小鼠用對照脂質體(圖4A)和RLIP76 脂質體(圖4B)中的DN5核酸(與SET反義)處理。肺組織(泳道1和6)、肝臟組織(泳 道2和7)、心臟組織(泳道3和8)、腦組織(泳道4和9)和腎臟組織(泳道5和10)中的 SET-ImRNA表達通過攝入後24小時(泳道1_5)和72小時(泳道6_10)的RT-PCR分析被 檢測。圖5是來自下列研究的數據，其中小鼠用對照脂質體(泳道1-5)和RLIP76脂質 體(泳道6-10)中的DN5核酸(與SET反義)處理。肺組織(泳道1和6)、肝臟組織(泳 道2和7)、心臟組織(泳道3和8)、腦組織(泳道4和9)和腎臟組織(泳道5和10)中的 SET-ImRNA表達通過攝入後24小時的RT-PCR分析被檢測。圖6是用對照(空的)脂質體、含有R508核酸的脂質體、含有R508核酸的RLIP76 脂質體、含有DN5核酸的脂質體和含有DN5核酸的RLIP76脂質體處理後24和72小時，肺 髒中SET-ImRNA表達的數據總結圖。圖7是用對照(空的)脂質體、含有R508核酸的脂質體、含有R508核酸的RLIP76 脂質體、含有DN5核酸的脂質體和含有DN5核酸的RLIP76脂質體處理後24和72小時，肝 髒中SET-ImRNA表達的數據總結圖。圖8是用對照(空的)脂質體、含有R508核酸的脂質體、含有R508核酸的RLIP76 脂質體、含有DN5核酸的脂質體和含有DN5核酸的RLIP76脂質體處理後24和72小時，腦
6中SET-ImRNA表達的數據總結圖。圖9是顯示口服含有200 μ g DN5核酸的脂質體和含有200 μ g DN5核酸的RLIP76 脂質體後24小時，肺、肝臟、心臟、腦和腎臟中SET-ImRNA表達的數據總結圖。圖10A、圖10B、圖10C、圖10D、圖IOE和圖IOF是檢測用含有100 μ g合成的 (scrambled)反義核酸的對照脂質體(組1)、含有100 μ g合成的反義核酸的200 μ g RLIP76脂質體(組2)、含有100 μ g DN5反義核酸的對照脂質體(組3)或含有100 μ g DN5 反義核酸的200 μ g RLIP76脂質體(組4)處理之後小鼠腦組織(圖10A、圖IOB和圖10C) 和肺組織(圖10D、圖IOE和圖10F)中SET-I表達的蛋白質印跡。蛋白質印跡中的帶通過 掃描光密度測定法被定量。β「肌動蛋白被用作內對照。詳細描述本公開至少部分得自下列發現含有RLIP76蛋白的脂蛋白體在將「貨物分子」遞 送到身體的各種組織方面是令人驚訝地有效的。如本文使用的，「RLIP76脂蛋白體」不僅 指RLIP76與脂質體的組合，還指RLIP76與微乳劑、膠粒/膠束、單層或多層囊泡、血影或球 芽等的組合。也理解的是，除了核酸貨物分子的遞送，考慮RLIP76脂蛋白體也有效遞送多 肽和小分子貨物分子(例如，治療劑)。本文公開的RLIP76脂蛋白體可被用於遞送下列組 合兩個或更多個核酸貨物分子；兩個或更多個多肽貨物分子；兩個或更多個小分子分子； 核酸貨物分子與多肽貨物分子；核酸貨物分子與小分子貨物分子；小分子貨物分子與多肽 貨物分子；以及核酸貨物分子、多肽貨物分子與小分子貨物分子。初步動物研究證實了當口服或腹膜內給予時遞送媒介物(vehicle)的有效性，然 而理解的是，遞送也可通過本領域已知的其它方法來完成，包括但並不限於吸入、靜脈內、 肌肉內、跨黏膜或透皮遞送。本文的數據證實，公開的遞送媒介物對於遞送到腦、肺、肝臟、 心臟和腎臟組織是有效的，並且期望遞送對於本文顯示的研究中沒有測試的其它組織也是 有效的。特別有意義的是口服或腹膜內給予之後，遞送媒介物能遞送貨物跨過血/腦屏障 以便在腦組織中表達。RLIP76RLIP76 (也稱為RALBPl或RIP1)是存在於從果蠅(Drosophila)到人類的遍在蛋 白，它在細胞生理學中發揮多種作用。當該蛋白是膜相關的時，其充當多種化合物的多特 異性流出泵，包括兩性小分子諸如長春花生物鹼類和蒽環類，它們是通常的抗癌藥。然而， RLIP76轉運還包括由活性氧種類(ROS)形成的內源性穀胱甘肽親電子共軛物(GS-E)從細 胞的運動。ROS由許多損傷諸如輻射和有機化學品過多而產生，並且在許多水平上對細胞有 毒性。如其名稱暗示的，ROS是高度反應性的並與其路徑中的幾乎任何物質結合，包括蛋白 質、脂類和核酸，當所述物質被接觸時修飾它們中的每一個。對脂類的損害(脂質過氧化作 用)是特別有害的，因為產生的過氧化作用產物自身是有毒性的。所述產物包括凋亡前反 應性烯醛(alkenals)，諸如4_羥基壬烯醛(4-HNE)，其長期有活性並能在細胞中累積，最終 導致進一步的損害和死亡。像這樣，RLIP76是培養細胞中應激反應的重要成分，並提供保 護對抗應激因子，包括熱、氧化劑化學品、化學治療劑、紫外線照射和χ線照射。RLIP76的一級結構顯示幾個令人感興趣的特徵。該蛋白可被分成4個區域，其中 2個中心結構域攜帶Racl/CDC42GAP活性和Ral結合結構域。兩個側翼結構域的功能尚不 清楚。人RLIP76的核苷酸序列(GenBank登錄號NM_006788)和小鼠RLIP76的核苷酸序列(NM_009067)，以及人RLIP76的胺基酸序列(GenBank登錄號NP_006779)和小鼠RLIP76的 胺基酸序列(GenBank登錄號NP_033093)已被描述。人RLIP76核苷酸序列包括下列位點 N-糖基化(胺基酸341-344)、cAMP(胺基酸113-116)、cGMP-依賴性蛋白激酶磷酸化(氨 基酸650-653)、酪氨酸激酶磷酸化(胺基酸308-315)、N-豆蔻醯化(myristolation)(氨 基酸21-26、40-45和191-196)、亮氨酸拉鏈模式(胺基酸547-578)和幾個蛋白激酶C磷酸 化、酪蛋白激酶II磷酸化，胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位點。這樣的基序在RLIP76 —級結構 中的存在及其溫和的蛋白水解降解顯示，RLIP76參與幾個細胞內和細胞外過程(例如蛋白 加工、細胞內信號傳導、蛋白降解、識別、加標籤等)，並且RLIP76的蛋白水解加工是多個功 能所要求的。RLIP76的肽片段單獨地或與其它片段結合，可催化這些不同的功能。例如， RLIP76的N-末端和C-末端片段——不能單獨地介導ATP-依賴性轉運的片段——在脂蛋 白體中被重建在一起時能催化帶電藥物(例如，D0X、秋水仙鹼)的轉運。在培養細胞或大腸桿菌(E. coli)中表達的RLIP76在純化過程中遭受溫和的蛋 白水解。2個最顯著的肽——N-RLIP76H和C_RLIP7641(1_655，分別來自RLIP76的N-末端 和C-末端——在SDS凝膠中顯示為49kDa和38kDa條帶。這兩個肽都顯示組成型ATP酶 活性，所述活性在RLIP76轉運的陰離子或陽離子配體存在時可被刺激。如光親和標記顯示 的，這兩個肽都結合ATP，所述標記在釩酸鹽存在時增加，表明在ATP結合位點中夾帶反應 中間體。當在脂質體中單獨被重建時，2個片段都不催化轉運。然而，當被重建在一起時， 帶電化學品(例如，DNP-SG、D0X)的ATP-依賴性轉運被觀察到，其動力學參數與RLIP76的 動力學參數相似。N-RLIP76U7和C-RLIP7641(1_655中的ATP結合位點被分別鑑定為胺基酸 69-74和胺基酸418-425。N-末端和C-末端肽中的K74和K425突變分別廢除ATP酶活性、 ATP結合能力和轉運功能。這些ATP結合位點的序列與P環的共有序列(Walker基序)不 同。除了上面描述的人RLIP76核酸序列，人RLIP76基因內的許多單核苷酸多態性 (SNPs)已被描述，其中的3個(編碼序列的核苷酸660處的A到G的突變、編碼序列的核苷 酸838處的G到A的突變和編碼序列的核苷酸2065處的C到T的突變)落在RLIP76編碼 序列內，分別導致在胺基酸位置149處胺基酸序列從賴氨酸改變為穀氨酸、在胺基酸位置 208處胺基酸序列從精氨酸改變為穀氨醯胺和在胺基酸位置617處胺基酸序列從丙氨酸改 變為纈氨酸。出現在人RLIP76基因的內含子中的SNPs以及出現在人RLIP76基因的5'和 3'非翻譯區的SNPs在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)網址上的單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism(SNP))資料庫 中被描述。在本公開的某些方面，『『RLIP76"或〃 RLIP76蛋白〃可指如GenBank登錄 號NP_006779所示的全長人RLIP76胺基酸序列、單獨或組合保留RLIP76轉運活性的人 RLIP76胺基酸序列的一個或更多個片段、或保留RLIP76轉運活性的人RLIP76胺基酸序列 的突變。在某些實施方式中，RLIP76可指與如GenBank登錄號NP_006779所示的人RLIP76 胺基酸序列具有約99%同一性或同源性的胺基酸序列，與如GenBank登錄號NP_006779所 示的人RLIP76胺基酸序列具有約98%同一性或同源性、約95%同一性或同源性、約90%同 一性或同源性、約85%同一性或同源性或約80%同一性或同源性的胺基酸序列。脂質體
脂質體是由以一層或更多層同心雙層排列的兩親脂質組成的囊泡。當脂質被放 置在水性介質中時，脂質頭基與水的親水相互作用導致多層和單層體系或囊泡的形成， 它與生物膜相似，為球形殼形式。脂質體可以是小(0.025-0. 05 μ m)到大的多層囊泡 (0. 05-10 μ m)。用來製備脂質體的脂質包括但並不限於磷脂、鞘脂、糖苷神經鞘脂、飽和甘 油酯、類固醇(例如膽固醇)和合成磷脂。脂質體典型地通過在水性溶劑中與乳化劑如聚 氧乙烯(POE) —起熔化脂質而製備。藥物然後被加入，且脂質體通過混合或超聲產生。藥 物通常被陷在囊泡結構中。這些基本的脂質體有時被稱為「常規脂質體」。存在幾個其它 類型的脂質體製備物，包括但並不限於(1)立體穩定脂質體，其表面包被有惰性親水聚合 物，諸如聚乙二醇；(2)靶向脂質體，靶向配體被粘附於其上，諸如抗體或其片段、凝集素、 寡糖或肽(例如，霍亂毒素B (CTB)被用於將脂質體靶向於胃腸上皮)；和(3)反應性或「多 態」脂質體，它們響應於特定的相互作用改變其相位和結構(這一組包括對離子(PH、陽離 子)、熱和光及其它刺激敏感的脂質體)。在某些實施方式中，組合物包括脂蛋白體。如本文所用，「脂蛋白體」通常是蛋白 質和凝集素或糖脂或磷脂結合，它形成球型膠束樣或囊泡結構。該結構可自然地形成或通 過化學或機械操作或其組合形成。脂蛋白體利用脂質(或凝集素)的兩親性質，當在溶液 中時，該性質使其形成雙層，導致形成下列幾個形狀中的至少一個，包括(a)帶有向內的 尾的球型膠束；或(b)雙分子層，其為雙層，疏水尾被夾在親水頭基之間。一般而言，當被 撕裂或破碎時，脂蛋白體可重新密封自己。脂蛋白體可只含有一種凝集素或脂質、或多種和 各自的組合。磷脂的例子包括但並不限於磷脂醯膽鹼、鞘磷脂、磷脂醯絲氨酸、肌醇磷脂和 磷脂醯乙醇胺。當被使用時，脂蛋白體可以是帶電荷的或電中性的，並通常被用在生理PH 下。它們還可是與清潔劑混合的結構(例如，清潔劑/脂質/蛋白質、清潔劑/凝集素/蛋 白質)。製備限定的脂質_蛋白質或凝集素_蛋白質比和尺寸的脂蛋白體的方法是分子生 物學和蛋白質/脂質生物化學領域的普通技術人員熟知的。本公開的脂蛋白體可通過本領域已知的任何方法來製備，包括但並不限於美國專 利申請公開號US 2005/0123594 Al中公開和描述的方法，其公開全部併入本文作為參考， 用於所有目的。核酸組分在本公開的某些實施方式中，RLIP76脂質體或脂蛋白體被用於遞送核酸分子，包 括但並不限於RNA、DNA、反義核酸、多核苷酸、寡核苷酸、核酶和/或三鏈體分子。這樣的核 酸分子還可包括通過基於RNA幹擾(RNAi)的機制減少靶核酸表達的RNA分子。適合RNAi 的一些示例性的RNA分子包括但並不限於短幹擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(siRNA)、微小 RNA、小的非編碼RNA(tncRNA)和小調節RNA(smRNA)分子(參見，例如Novina and Sharp, Nature 430 161-164，2004)。術語"RNA"或"RNA分子"或"核糖核酸分子"指核糖核苷酸的聚合物。術 語"DNA"或"DNA分子"或"脫氧核糖核酸分子"指脫氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和 RNA可被天然地合成(例如，分別通過DNA複製或DNA轉錄)或使用本領域技術人員熟知 的方法被化學合成。RNA可被轉錄後修飾，DNA和RNA可以是單鏈的(即分別為ssRNA和 ssDNA)或多鏈的(例如，雙鏈的，即分別為dsRNA和dsDNA)。術語〃 mRNA"或〃信使RNA" 指指定一個或更多個多肽鏈的胺基酸序列的單鏈RNA，在蛋白質合成過程中，當核糖體結合
9於該mRNA時，所述多肽鏈被翻譯。術語「寡核苷酸」指核苷酸和/或核苷酸類似物的短的 聚合物。如本文所用，術語〃小幹擾RNA"或〃 siRNA"或〃短幹擾RNA"指包含約10_50 個核苷酸(或核苷酸類似物)的RNA (或RNA類似物)，所述核苷酸能指導或介導RNA幹擾。 在某些實施方式中，siRNA包含約15-30個核苷酸或核苷酸類似物、約16-25個核苷酸(或 核苷酸類似物)、約18-23個核苷酸(或核苷酸類似物)、及約19-22個核苷酸(或核苷酸 類似物)(例如，19,20,21或22個核苷酸或核苷酸類似物)。在一些情況下，siRNA可包括 少於19個核苷酸，例如，15、16、17或18個核苷酸，條件是該較短的siRNA保留介導RNAi的 能力。同樣，在一些情況下，siRNA可包括多於26個核苷酸，條件是該較長的siRNA保留介 導RNAi的能力、並缺乏進一步加工——例如酶促加工——為較短的siRNA。如本文所用，術語"RNA幹擾"或"RNAi"指選擇性細胞內降解，例如，用以調節 或使沉默靶基因的表達。RNAi不要求反義分子與mRNA靶序列相同，而是需要反義分子具有 與mRNA靶序列充分互補的序列，以便通過RNAi機制或過程(參見美國專利號7，459，547， 其全部併入本文)觸發靶mRNA的破壞。如本文所用，術語「減少表達」和「沉默表達」指表 達的任何減少或沉默，直到並包括全部的(100% )表達減少或沉默。在某些方面，與缺少減 少、幹擾或沉默分子情況下的表達相比，表達可被較少或沉默5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或 更多。在本公開的某些方面，核酸分子包含至少一個選自下列的修飾的鹼基部分，包 括但並不限於5_氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、 5_(羧基羥甲基)尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷、5-甲基氨基甲基尿嘧 啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、N6-腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、5-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-羧甲基氨 甲基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、假尿嘧啶、尿嘧 啶-5-氧基乙酸(ν)、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3_氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、肌苷、
1-甲基肌苷、5-甲氧基尿嘧啶、N6-異戊基烯腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、Q核苷(queosine)、
2-甲基鳥嘌呤、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基鳥嘌呤、 β -D-甘露糖基Q核苷、7-甲基鳥嘌呤、2，2_二甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 4-乙醯基胞嘧啶、2-硫胞嘧啶、wybutoxosine、(acp3)w和2，6_ 二氨基嘌呤。在本公開的某些實施方式中，核酸分子包含至少一個選自下列的修飾的糖部分， 包括但並不限於阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在其它的實施方式中，核酸分 子包含至少一個選自下列的修飾的磷酸酯骨架，包括但並不限於硫代磷酸、二硫代磷酸 酯、硫代磷醯胺、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯、及formacetal或 其類似物。在其它的實施方式中，核酸分子是α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸與互補 的RNA形成特異的雙鏈雜交體，其中與通常的β-單位相反，鏈互相平行(Gautier，et al.， Nucl. Acids Res. 15 :6625_6641，1987)。寡核苷酸也可以是 2' -0-甲基核糖核苷(Inoue, et al.，Nucl. Acids Res. 15 :6131_6148，1987)或嵌合的 RNA-DNA 類似物(Inoue，et al.， FEBS Lett. 215 :327_330，1987)。反義核酸分子諸如反義DNA或siRNA分子的活性通常受靶mRNA的二級結構影響 (參見，例如，Vickers, et al.，J.Biol. Chem. 278 :7108_7118，2003)。因此，反義核酸可被
10選擇，它與可用於鹼基配對的靶mRNA的區域互補。靶mRNA的合適區域可通過進行「基因 步進(gene walk) 」來鑑定，例如，通過經驗性地測試許多反義寡核苷酸沿著靶mRNA雜交於 各個區域和/或減少靶mRNA表達的能力(參見，例如，Vickers，et al. , supra, and Hill, et al. , Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 21 :728_737，1999)。可選地，靴 mRNA 的合適區域可 使用mRNA 二級結構預測程序或相關的算法來鑑定，以鑑定不與靶mRNA的任何其它區域雜 交的靶mRNA的區域(參見，例如，Hill, et al.，supra)。上面方法的組合也可用於鑑定靶 mRNA的合適區域。本公開涉及表徵RNAi組合物、製備所述RNAi組合物的方法和使用RNAi組合物的 方法(例如，研究和/或治療方法)的某些實施方式。RNAi組合物可以是包含siRNA分子、 被加工為siRNA分子的前體分子(例如，工程化的前體分子)、或編碼例如前體分子(例如， 工程化的前體分子)的分子(例如DNA分子)的RLIP76脂蛋白體。靶標和疾病/障礙目前公開的組合物和方法可用於靶向特定細胞、組織或患者中的許多特定核酸 靶，以及用於治療許多不同的疾病、障礙和病症。在本公開的某些實施方式中，RNAi組合物包含被設計為靶向一個核苷酸序列(或 在某些情況下多於一個核苷酸序列)以治療或預防神經疾病或異常的反義RNA或siRNA， 其中活性劑跨過血腦屏障是特別期望的。「神經疾病」或「神經障礙」指以神經系統功能障 礙為特徵的遺傳性和散發性狀況，其可與受影響的中樞或外周神經系統結構的萎縮或無萎 縮的功能喪失相關。導致萎縮的神經疾病或障礙通常被稱作「神經變性疾病」或「神經變 性障礙」。神經疾病序列靶標包括但並不限於阿爾茨海默病靶標，諸如澱粉樣前體蛋 白基因(APP)的突變等位基因、tau蛋白的突變等位基因、載脂蛋白Εε4等位基因、以及分 泌酶和早老素基因諸如β-分泌酶的突變等位基因；多發性硬化靶標，諸如T-bet轉錄因 子、白細胞介素23和骨橋蛋白；帕金森氏病靶標，諸如α-突觸核蛋白；和中樞神經系統腫 瘤靶標，諸如Notch-Ι、組織蛋白酶B、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體和基質金屬蛋白酶。使 用目前公開的組合物和方法可治療或預防的另外的神經疾病或障礙包括但並不限於遺傳 性痙攣性偏癱、原發性側索硬化、脊髓性肌萎縮、甘迺迪病、重複擴大神經變性疾病(r印eat expansion neurodegenerative diseases)，例如與三核 Ρ酸重複擴大相關的疾病，i者如聚 穀氨醯胺(PolyQ)重複疾病，例如亨廷頓病(HD)、脊髓小腦性共濟失調(SCA1、SCA2、SCA3、 SCA6、SCA7和SCA17)、脊髓延髓肌肉萎縮症(SBMA)和齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮 (DRPLA)、家族性和散發性肌萎縮側索硬化(分別為FALS和ALS)、家族性和散發性帕金森 病、亨廷頓病、家族性和散發性阿爾茨海默病、多發性硬化、橄欖體腦橋小腦萎縮、多系統萎 縮、進行性核上麻痺、瀰漫性Lewy體疾病、⑶rticodentatonigral變性、進行性家族性肌陣 攣性癲癇、紋狀體黑質變性(strionigral degeneration)、扭轉性張力障礙、家族性震顫、 唐氏症候群、抽動穢語症候群、哈-斯二氏病、糖尿病性周圍神經病變、拳擊員痴呆、AIDS痴 呆、年齡相關性痴呆、年齡相關性記憶缺陷和澱粉樣變性相關性神經變性疾病，諸如由與傳 染性海綿狀腦病(克雅氏病、Gerstmarm-Straussler-Scheinker症候群、瘙癢病和庫魯病) 相關的朊蛋白(PrP)引起的那些疾病和由過多的胱蛋白酶抑制劑C堆積引起的那些疾病 (遺傳性胱蛋白酶抑制劑C血管病)、外傷性腦損傷(例如手術相關的腦損傷)、腦水腫、周 圍神經損傷、脊髓損傷、利氏病、格_巴二氏症候群、溶酶體儲存障礙諸如脂褐質沉積症、阿耳珀病、CNS變性導致的眩暈；慢性酒精或藥物濫用引起的病狀包括，例如藍斑和小腦的神 經元變性；衰老引起的病狀，包括小腦神經元和皮質神經元的變性——導致認知和運動損 傷；和慢性安非他命的濫用引起的病狀，包括基底核神經元變性——導致運動損傷；局部創 傷引起的病理改變諸如中風、局部缺血、血管功能不全、缺氧缺血性腦病、高血糖症、低血糖 症或直接創傷；作為治療性藥物和治療的副反應產生的病狀(例如，響應於NMDA類穀氨酸 受體拮抗物的抗驚厥藥劑量的扣帶和內嗅皮層神經元變性)和Wernicke-Korsakoff' s相 關性痴呆，影響感覺神經元的神經變性疾病，包括但並不限於弗裡德賴希共濟失調症、糖尿 病、周圍神經病和視網膜神經元變性，邊緣和皮質系統的神經變性疾病，包括但並不限於腦 澱粉樣變性、Pick' s萎縮和Retts綜合證。在某些實施方式中，將被治療的CNS狀況或障 礙是腦腫瘤或其它的瘤形成(例如，CNS腫瘤諸如膠質母細胞瘤)。這樣的腫瘤或瘤形成可 以是原發性腫瘤或可以是轉移灶。在本公開的其它實施方式中，RNAi組合物包含被設計以治療或預防某些病毒感 染的反義RNA或siRNA，所述病毒感染包括但並不限於得自下列的病毒感染流感病毒、呼 吸道合胞病毒(RSV)、百日咳病毒、嚴重急性呼吸器官症候群(SARS)病毒、SARS-CoV病毒、 拉沙熱病毒、蜱傳腦炎病毒、登革熱病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、狂犬病病毒、西門 利克森林病毒、羅斯河病毒、奧拉病毒、Borna病病毒、漢坦病毒和本領域技術人員熟知的 其它病毒。RNAi是最近被發現和發展的抗病毒策略，其中基因沉默由siRNA引起，使用公 開的組合物和方法，siRNA可被遞送到需要它的細胞或受試者。例如，使用siRNA的抗病 毒策略已被開發，其對流感病毒有抑制性(參見，例如美國專利號7，304，042和美國專利 申請公開號20040242518和20070213293)；對RSV有抑制性(參見，例如美國專利申請公 開號20070238676)；對人免疫缺陷病毒(HIV)或慢病毒有抑制性(參見，例如美國專利號 7，195,916)；對肝炎病毒有抑制性(參見，例如美國專利申請公開號20080269148)；和對 SARS病毒有抑制性(參見，例如美國專利申請公開號20050095618)，它們中的每一個都被 併入本文作為參考。這一列舉僅僅是示例性的，並沒有窮盡已被發展的和為本領域技術人 員熟知的使用siRNA的抗病毒策略。在本公開的其它的實施方式中，RNAi組合物包含被設計為靶向一個核酸序列(或 在某些方面多於一個核酸序列)以治療或預防血管發生的反義RNA或siRNA，例如通過靶 向涉及調節血管發生的調節蛋白和核酸分子的表達。如本文所用，術語「血管發生」指新 血管的不適當形成。血管發生常常發生在腫瘤中，此時內皮細胞分泌一組對內皮是促有絲 分裂的生長因子而引起內皮細胞的延伸和增殖，導致新血管的產生。血管發生的抑制可引 起動物模型中的腫瘤消退，表明作為治療性抗癌劑的用途。抑制血管發生的有效量是足以 減少生長進腫瘤的血管數目的量。這個量可在腫瘤和血管發生的動物模型中被評價，這其 中的許多是本領域已知的。例如，可應用對下列具有特異性的siRNAs 血管內皮生長因子 (VEGF)基因和VEGF受體基因Flt-I和Flk-1/KDR、腫瘤壞死因子α (TNF α )——通過沉 默TNF α細胞表面受體TNF受體-I(TNFRl)(參見，例如，併入本文作為參考的美國專利號 7，345，027和美國專利申請公開號20090036396)。涉及被VEGF過表達刺激的血管發生的疾 病諸如糖尿病視網膜病變、老年性黃斑退化和許多類型的癌症可通過使用本公開的組合物 和方法給予siRNAs來治療。另外的致瘤序列靶標包括但並不限於ΡΤΕΝ、ρ53、ρ65、ΡΙ-3激 酶、蛋白激酶 C- α、蛋白激酶 Ν3、ICAM-I、H-ras、V-ras、N-ras、K-ras、raf、C_erbB2、Bc 1-2、VEGF, Flt-3和c-myc。公開的組合物和方法還可抑制癌細胞生長、減小腫瘤大小、預防侵 襲、抑制癌症進展和抑制轉移。因此，公開的組合物和方法對於治療受試者中的腫瘤細胞增 殖或轉移是有用的。癌症可以是惡性的或非惡性的癌症。這樣的癌症或腫瘤包括但並不限 於膽道癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、子宮內膜癌、食管癌、纖維肉瘤、胃癌、 肝細胞瘤、上皮內腫瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小細胞和非小細胞)、黑色素瘤、神經母細 胞瘤、口癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌和腎癌、膠 質母細胞瘤以及其它的癌和肉瘤。參與血管發生調節的其它代表性靶標的例子在併入本文 作為參考的美國專利號7，419，779中公開。這一列舉僅僅是示例性的，並沒有窮盡已被發 展的和為本領域技術人員熟知的使用siRNA調節血管發生的策略。在本公開的某些方面，RNAi組合物包含被設計為靶向一個核苷酸序列(或在某些 情況下多於一個核苷酸序列)以治療或預防肺狀況——即影響肺功能的疾病或障礙——的 反義RNA或siRNA。肺狀況序列靶標包括但並不限於治療肺動脈高壓的內皮源性FGF2和治 療囊性纖維化的VCP/pr97。可被治療或預防的肺狀況的其它例子包括但並不限於囊性纖 維化、喘息性支氣管炎、肺結核、支氣管炎、支氣管擴張、喉氣管支氣管炎、毛細支氣管炎、肺 氣腫、支氣管肺炎、過敏性支氣管肺炎、病毒性肺炎、百日咳、白喉、痙攣性喘咳、肺結核、帶 有保留分泌物的腦炎、肺水腫、巨細胞病毒性肺炎或粟粒性結核、藥物性肺病(例如服用青 黴素、呋喃妥因之後)、具有淋巴道播散模式的瘤形成肺病或支氣管肺泡細胞癌、傳染性或 非傳染性肉芽腫病、過敏性肺炎、組織胞漿菌病、肺結核、隱原性纖維化肺泡炎、遺傳性肺異 常諸如肺泡微石病和支氣管擴張、嗜酸性肉芽腫、淋巴管平滑肌瘤和肺泡蛋白沉積症。在本公開的其它方面，RNAi組合物包含被設計為靶向一個核苷酸序列(或在某些 情況下多於一個核苷酸序列)以治療或預防炎性疾病或障礙的反義RNA或siRNA。可被治療 或預防的這樣的炎性疾病、障礙或狀況的例子包括但並不限於急性和慢性炎症諸如骨關 節炎、敗血症、ARDS、免疫和自身免疫病、風溼性關節炎、IBD (炎性腸病)、狼瘡、MS、移植物 排斥、硬化、結節病、肉芽腫損害、牙周炎/牙齦炎、移植物抗宿主病、接觸性皮炎、肝炎、炎 性腦病、炎性脫髓鞘病、炎性脈管炎、炎性肌病、骨髓炎、克羅恩氏病、頑固性潰瘍性結腸炎、 非特異性潰瘍性結腸炎、間質性膀胱炎、心肌疾病、感染性疾病、肺部疾病和移植物排斥。使 用目前的組合物可被治療的自身免疫疾病包括但並不限於慢性活動型肝炎、格雷夫斯病、 胰島素依賴性糖尿病(I型)和喬本氏甲狀腺炎。在本公開的另外的方面，RNAi組合物包含被設計為靶向一個核苷酸序列(或在某 些情況下多於一個核苷酸序列)以治療或預防呼吸性疾病的反義RNA或siRNA，所述疾病包 括但並不限於哮喘，變態反應性疾病，肺氣腫，成人呼吸窘迫症候群(ARDS)，肺再灌注損 傷，肺、腎臟、心臟和腸的缺血再灌注損傷，以及肺腫瘤生長和轉移。提供的組合物和方法對 於治療和預防下列肺疾病也是有用的，包括但並不限於病毒引起的疾病，所述病毒包括但 並不限於流感病毒、呼吸道合胞病毒和SARS病毒；慢性阻塞性肺疾病/障礙(COPD)；肺纖 維化，特別是博來黴素誘導的纖維化；間質性肺病；纖維化；限制性肺疾病；間皮瘤；肺炎； 結節病和囊性纖維化。在本公開的其它的實施方式中，RNAi組合物包含被設計為靶向一個核苷酸序列 (或在某些情況下多於一個核苷酸序列)以治療或預防皮膚病的反義RNA或siRNA。這樣 的皮膚病包括但並不限於白癲風、黑色素瘤、發育異常痣、脂溢性角化病、黑棘皮症、附件
13腫瘤、其它的表皮腫瘤(光化性角化病、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、Merkel細胞癌、組織細胞 增多症X、蕈樣黴菌病/皮膚T細胞淋巴瘤)、肥大細胞增多症、溼疹/急性溼疹性皮炎、蕁 麻疹、多形性紅斑、銀屑病、扁平苔癬、狼瘡/系統性狼瘡、bussous病、尋常痤瘡和脂膜炎。在本公開的另外的實施方式中，RNAi組合物包含被設計為靶向和沉默與人類疾病 聯繫的特定剪切同種型(splice isoform)的反義RNA或siRNA。細胞特異件靶向作用或表汰在本公開的某些方面，期望將RLIP76脂蛋白體組合物靶向於特定細胞類型。在這 些「細胞特異性」實施方式的某些中，RLIP76脂蛋白體進一步包含細胞特異性靶向部分。細 胞特異性靶向部分賦予對RLIP76脂蛋白體的細胞類型特異性結合，並基於被靶向的特定 細胞群進行選擇。多種組分適合於用作細胞特異性靶向部分，包括但並不限於受體諸如生 長因子的配體、激素和細胞因子以及抗體或其抗原結合片段。由於大量的細胞表面受體已在各種譜系的造血細胞中被鑑定，對這些受體有特異 性的配體或抗體可被用作細胞特異性靶向部分。IL2可被用作細胞特異性靶向部分以靶向 於IL2R+細胞。可選地，其它分子諸如Β7-1、Β7-2和⑶40可被用於特異性地靶向於活化的 T細胞。此外，B細胞表達⑶19、⑶40和IL4受體並可被結合這些受體的部分諸如⑶40配 體、IL4、IL5、IL6和⑶28靶向。免疫細胞諸如T細胞和B細胞的消除在自身免疫、超敏、 移植排斥反應的治療中和淋巴腫瘤的治療中是特別有用的。自身免疫病的例子是多發性硬 化、風溼性關節炎、胰島素依賴性糖尿病、系統性紅斑狼瘡、硬皮病和葡萄膜炎(uviatis)。 更具體地，由於髓磷脂鹼蛋白已知為多發性硬化中免疫細胞攻擊的主要靶標，這種蛋白 可被用作多發性硬化治療中的細胞特異性靶向部分(參見，例如國際專利申請公開號WO 97/19179)。可用於靶向特定細胞亞群的其它細胞因子包括白細胞介素(ILl到IL15)、粒細 胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白血病抑制 因子、腫瘤壞死因子、轉化生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子和/或成纖維細 胞生長因子。其它細胞因子包括紅細胞生成素類(四螺旋束)(諸如Epo (紅細胞生成 素)、IL-2(T 細胞生長因子)、IL-3(多集落 CSF)、IL_4(BCGF_1、BSF-1)、IL_5 (BCGF-2)、 IL-6IL-4 (IFN^2, BSF-2、BCDF)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IU IL-13 (P600)、G-CSF、IL_15(T 細胞生長因子)、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、0SM(0M、制癌蛋白Μ)和 LIF(白血病抑制因子))；幹擾素(諸如IFN-Y、IFN-a和IFN-β)；免疫球蛋白超家族 (諸如 B7. 1 (CD80)和 B7. 2 (B70, CD86)) ；TNF 家族(諸如 TNF- α (惡病質素)、TNF- β (淋 巴毒素，LT、LT- α )、LT- β、CD40 配體(CD40L)、Fas 配體(FasL)、CD27 配體(CD27L)、 CD30配體(CD30L)和4-1BBL))；和未被指定為特定家族的那些(諸如TGF-β、IL-I α、 IL-I β、IL-1RA、IL-IO (細胞因子合成抑制劑F)、IL-12 (NK細胞刺激因子)、MIF、IL-16、 IL-17(mCTLA-8)和 / 或 IL-18 (IGIF，幹擾素-γ 誘導因子))。此外，某些細胞表面分子在腫瘤細胞中被高表達，包括但並不限於激素受體，諸 如人絨毛膜促性腺素受體和促性腺素釋放激素受體。因此，相應的激素在癌症治療中可被 用作細胞特異性靶向部分。在本公開的一些實施方式中，抗體是非常通用的和有用的細胞特異性靶向部分， 因為它們可針對任何感興趣的細胞表面抗原產生。單克隆抗體已針對細胞表面受體、腫瘤相關抗原和白細胞譜系特異性標記諸如⑶抗原產生。抗體可變區基因可通過本領域熟知 的方法容易地從雜交瘤細胞中分離。在過去的幾年裡，幾種單克隆抗體已被批准用於治療用途並已取得顯著的臨床和 商業成功。單克隆抗體的許多臨床效用來自它們與其靶標結合的親和力和特異性，以及歸 因於它們相對大的尺寸的長循環壽命。但單克隆抗體不是很適於在下列適應症中使用，其 中短的半衰期是有利的或其中它們的大尺寸在物理上抑制其到達潛在的治療活性區域。單鏈抗體(SCAs)是遺傳改造的蛋白質，其被設計為擴展可能應用單克隆抗體進 行的治療和診斷用途。SCAs具有單克隆抗體的結合特異性和親和力，並且其天然形式是單 克隆抗體尺寸的約五分之一至六分之一，這典型地賦予它們非常短的半衰期。與大多數單 克隆抗體相比，人類SCAs提供許多益處，包括更特異地定位到體內的靶位點、更快地從身 體清除、和口服、鼻內、透皮或通過吸入被使用的更好機會。除了這些益處，全部人SCAs可 直接從人SCA文庫中分離，不需要昂貴的和費時的「人化」操作。來自重鏈和輕鏈(VH和VL)的可變區都是長約100個胺基酸。它們可通過15個氨 基酸的接頭被連接，該接頭具有足夠的柔性以使兩個結構域裝配成功能性抗原結合口袋。 在具體的實施方式中，各種信號序列的添加使得scFv被靶向到細胞內不同的細胞器或被 分泌。輕鏈恆定區(Ck)的添加允許通過二硫鍵二聚化，帶來增加的穩定性和親合力。因此， 對於單鏈Fv(SCFV) SCA，儘管Fv片段的兩個結構域通過分開的基因進行編碼，但是已證明， 有可能製備使它們通過重組方法被製成單個蛋白鏈scFv的合成接頭。此外，它們由於易 於從噬菌體展示文庫中分離和識別保守抗原的能力而被經常使用。例如，通過展示抗-CEA scFv的逆向載體(retrovectorhscFv被用於將自殺基因靶向於表達癌胚抗原(CEA)的腫 瘤細胞。最後，抗體重鏈的Fc部分可被用於靶向於表達Fc受體的細胞，諸如應用IgE抗體 的Fc部分靶向於肥大細胞和嗜鹼性粒細胞。抗體通過抗體定向的治療或免疫定向的治療 靶向於感興趣多肽或肽的應用目前得到批准，並在目前的治療市場中使用。在本公開的其它方面，核酸貨物分子被可操作地連接到組織特異性啟動子，這導 致核酸貨物分子的組織特異性表達(參見，例如美國專利申請公開號20080131940)，或被 可操作地連接到細胞特異性轉錄應答元件，這導致核酸貨物分子在特定細胞類型中的表達 (參見，例如美國專利號6，991，935)。藥物組合物和給藥途徑預防或治療性製劑作為局部給予患者或受試者的藥物製劑被提供。本文使用的 術語「患者」或「受試者」指人或動物受試者(動物尤其用作特定組合物的臨床有效性的模 型)。合適的藥物製劑的選擇依賴於選擇的給藥方法，並且可根據藥物化學人員熟知的規程 進行。如本文所用，「劑量單位」是在藥學可接受的載體中包含一個或更多個貨物分子 的RLIP76脂蛋白體。術語「藥學可接受的載體」包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、 抗細菌和抗真菌藥、等張劑和吸收延遲劑以及類似物。這樣的介質和試劑對藥物活性物質 的使用是本領域熟知的。除了在任何常規的介質或試劑與RLIP76脂蛋白體或貨物分子不 相容的範圍內，它在治療組合物中的使用被考慮。補充的活性成分或治療劑也可被摻入到 RLIP76脂蛋白體組合物中。
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如本文所用，「藥學可接受的鹽」指公開化合物的衍生物，其中公開化合物的一個 或更多個組分通過製成其酸或鹼鹽而修飾。藥學可接受的鹽的例子包括但並不限於鹼性 殘基諸如胺的無機或有機酸鹽；酸性殘基諸如羧酸的鹼鹽或有機鹽等等。因此，術語「酸加 成鹽」指已通過酸的添加被製備的組分的相應鹽衍生物。藥學可接受的鹽包括例如從無機 酸或有機酸形成的組分的常規鹽或季銨鹽。例如，這樣的常規鹽包括但並不限於來自無機 酸的鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、氨基磺酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽及類似物；和從有機酸 製備的鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽、硬脂酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸 鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、棕櫚酸鹽(palmoic)、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、苯乙酸鹽、穀氨 酸鹽、安息香酸鹽、水楊酸鹽、對氨基苯磺酸鹽、2-乙醯氧基苯甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、甲苯 磺酸鹽、甲磺酸鹽、乙二磺酸鹽、草酸鹽、羥乙磺酸鹽和類似物。某些酸性的或鹼性的化合物 可作為兼性離子存在。活性製劑的所有形式——包括游離酸、游離鹼和兼性離子——都被 考慮在本公開的範圍內。蛋白可以以中性形式或鹽形式被配製到組合物中。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽 (與蛋白質的游離氨基形成)，並且它們是與無機酸形成的，諸如，例如，鹽酸或磷酸，或與 這樣的有機酸形成，諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸和類似物。與游離的羧基形成的鹽也可 衍生自無機鹼，諸如，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及這樣 的有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因和類似物。此外，公開的組合物或其組分可與聚乙二醇(PEG)、金屬離子複合或被摻入到聚合 化合物諸如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝膠、葡聚糖及類似物中。這樣的組合物將影響物理狀態、 溶解性、穩定性、體內釋放速度和體內清除速度，並因此根據意圖的應用被選擇。公開的化合物可口服給藥，例如，應用惰性稀釋劑或應用可同化的可食用載體，或 者它們可被包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，或它們可被直接地與飲食的食物混合。對於口 服治療給藥，公開的化合物可與賦形劑混合，並以可吸收的含片、錠劑、膠囊、酏劑、懸液、糖 漿、圓片和類似形式使用。這樣的組合物和製劑應含有至少0. 的公開化合物。組合物和 製劑的百分比當然可被改變，並且可便利地為單位重量的約2%至約60%之間。這種治療 上有用的組合物中的公開化合物的量是這樣的合適的劑量會被獲得。當劑量單位的形式是片劑、錠劑、丸劑、膠囊及類似物時，它也可含有下面的一種 或更多種粘合劑，諸如黃蓍樹膠、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩 解劑，諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸及類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；甜味劑，諸如蔗 糖、乳糖或糖精；或調味劑，諸如薄荷、冬青油或櫻桃調味料。當劑量單位形式是膠囊時，除 了上面的類型的材料之外，其可含有液體載體。各種其它材料可作為包衣存在或另外地修 飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可包被有紫膠、糖或二者。當劑量單位的 形式是糖漿或酏劑時，它可含有蔗糖作為甜味劑、對羥苯甲酸甲酯和對羥苯甲酸丙酯作為 防腐劑、染料和調味料，諸如櫻桃或桔子香味。當然，在製備任何劑量單位形式中使用的任 何材料應是藥學純的並在使用的量上是基本上無毒的。此外，劑量單位的形式可以是持續 釋放、延長釋放或延遲釋放製備物或製劑。公開的化合物還可胃腸外或腹膜內給藥。劑量單位的溶液可在與表面活性劑諸如 羥丙纖維素適當混合的水中製備。分散劑也可在甘油、液體聚乙烯二醇和其混合物中以及 在油中進行製備。在普通的儲存和使用條件下，這些製備物含有防腐劑以阻止微生物的生長。對於例如水溶液形式的胃腸外給藥，溶液應按需要被適當地緩衝，並且首先用足 夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水溶液特別適於靜脈內、肌肉內、皮下 和腹膜內給藥。就此而言，根據本公開，可被使用的無菌的水介質對本領域技術人員將是 已知的。例如，一個劑量可被溶解在ImL的等滲NaCl溶液中，並且或者被加入到IOOOmL 的皮下輸液中或在建議的輸注位點處被注射(參見，例如「Remington' sPharmaceutical Sciences」 第 15 版，1035-1038 頁和 1570-1580 頁(Osol and Hoover, eds.，Mack Publishing Company, Easton, PA, 1975))。劑量的一些變化將依賴於被治療受試者的狀態 而必然發生。在任何情況下，負責給藥的人將確定個體受試者的適當劑量。適於注射使用的劑量單位形式包括無菌水溶液或分散劑和用於無菌注射溶液或 分散劑的臨時製備物的無菌粉劑。在所有情況下，所述形式必須是無菌的並且必須是適當 流體化的。它在製造和儲存條件下必須是穩定的，並且必須抗微生物諸如細菌和真菌的汙 染作用而被保存。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙 二醇及類似物)、其合適的混合物和植物油的溶劑或分散介質。適當的流動性可被維持，例 如，通過包衣諸如卵磷脂的使用、在分散劑情況下通過所要求粒度的保持、和通過表面活性 劑的使用。各種抗細菌和抗真菌藥劑，例如，對羥苯甲酸類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳 汞及類似物可帶來微生物作用的防止。在許多情況下，將優選包括等張劑，例如糖或氯化 鈉。注射組合物中延遲吸收的製劑諸如單硬脂酸鋁和明膠的使用可帶來所述組合物的延長 吸收。無菌注射溶液通過在適當的溶劑中摻入要求量的公開化合物與按需要的上面列 舉的各種其它成分而製備，然後過濾滅菌。一般而言，分散劑通過將各種無菌成分摻入到含 有基礎分散介質和來自上文列舉的所要求的其它成分的無菌媒介物中而製備。在用於無菌 注射溶液的製備的無菌粉劑的情況下，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，所述 技術從其先前無菌過濾的溶液產生劑量單位加上任何另外期望成分的粉末。在某些實施方式中，公開的組合物可被配製為通過使用皮膚貼劑或透皮遞送系 統而給藥。透皮給藥能通過本領域已知的許多系統的任何一個被完成。可適於連同本文 描述的組合物使用的系統的例子包括但並不限於在美國專利號4，816，252,5, 122，382、 5，198，223,5, 023，084,4, 906，169,5, 145，682,4, 624，665,4, 687，481,4, 834，978 和 4，810，499中描述的那些透皮給藥系統。這些方法典型地包括粘合基質或藥物儲庫系統，並 可包括皮膚滲透增強劑諸如乙醇、聚乙二醇200雙月桂酸、豆蔻酸異丙酯、甘油三油酸酯、 亞麻酸飽和的乙醇、甘油單油酸酯、甘油單月桂酸酯、正癸醇、癸酸和某些飽和及不飽和脂 肪酸，以及它們的酯、醇、甘油一酯、乙酸酯、二乙醇醯胺和N，N-二甲基醯胺(參見，例如，美 國專利號4，906，169)。在其它的方面，公開的組合物可被配製用於呼吸給藥、肺給藥或鼻給藥。有效劑量在某些方面，本公開包括治療、處理和/或預防疾病或障礙的方法，其包含給予需 要這樣的治療、處理或預防的患者治療或預防有效量的公開組合物或其劑量單位。在某些 實施方式中，這樣的化合物或劑量單位被稱為活性劑。公開組合物在製造用於治療或預防 疾病或障礙的藥物中的應用也被考慮。本公開還包括包含生物學或治療有效量的一個或更多個貨物分子的組合物，該貨物分子用於製備用於預防和/或治療疾病或障礙的藥物。如本文所用，除非另外指明，術語「治療(treat)」、「治療(treating) 」和「治療 (treatment)」考慮當患者遭受疾病或障礙時發生的作用，其減少該疾病或障礙或相關的 疾病或障礙的一個或更多個症狀或影響的嚴重性。如本文所用，除非另外指明，術語「預防 (prevent) 」、「預防(preventing) 」和「預防(preventment) 」考慮在患者開始遭受疾病或障 礙之前時發生的作用，其延長該疾病或障礙的發生和/或抑制該疾病或障礙或減少該疾病 或障礙的嚴重性。如本文所用，除非另外指明，術語「處理(manage)」、「處理(managing)」 和「處理(management) 」包括在已遭受疾病或障礙的患者中預防該疾病或障礙復發、延遲該 疾病或障礙復發或減少該疾病或障礙復發的嚴重性。該術語包括調節疾病或障礙的閾值、 發展和/或持續時間，或改變患者對疾病或障礙反應的方式。如本文所用，除非另外指明，化合物的「治療有效量」是在疾病或障礙的治療或處 理中足以提供任何治療益處、或足以延遲或最小化與疾病或障礙相關的一個或更多個症狀 的量。化合物的治療有效量指化合物的量——單獨或與一個或更多個其它的治療和/或治 療劑組合，它在疾病或障礙、或相關的疾病或障礙的治療或處理中提供任何治療益處。術語 「治療有效量」可包括治癒疾病或障礙、改善或減輕疾病或障礙、減輕或避免疾病或障礙的 症狀或原因、改進總體治療、或增強另一治療劑的治療效果的量。如本文所用，除非另外指明，化合物的「預防有效量」是足以預防或延遲疾病或障 礙、或與疾病或障礙相關的一個或更多個症狀的發生，或預防或延遲其復發的量。化合物的 預防有效量指化合物的量——單獨或與一個或更多個其它的治療和/或預防劑組合，它在 疾病或障礙的預防中提供預防益處。術語「預防有效量」可包括預防疾病或障礙、改進總體 預防、或增強另一預防劑的預防效果的量。描述的化合物和組合物的毒性和治療效果可在細胞培養或實驗動物中通過標準 的藥物操作被測定，例如測定LD50 (使群體的50%致死的劑量)和ED50 (在群體的50%中 治療有效的劑量)。毒性效果和治療效果之間的劑量比是治療指數，用比LD50/ED50表示。 顯示大治療指數的化合物是優選的。顯示毒副作用的化合物可被用在某些實施方式中，然 而，為了使對未受感染的細胞的潛在損害最小化並由此減少副作用，通常應小心設計將這 樣的化合物優選靶向於受累組織位點的遞送系統。從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可被用於配製在人類中使用的劑量範圍。 在本公開的某些方面，這樣的化合物的劑量位於包括ED50而幾乎沒有或沒有毒性的循環 濃度的範圍內。該劑量可依賴於應用的劑量形式和利用的給藥途徑在這個範圍內變動。對 於在本公開方法中應用的任何化合物，治療有效劑量可最初從細胞培養測定中被評價。劑 量可在動物模型中被配製以獲得包括IC50(即，獲得症狀的一半最大抑制的測試化合物的 濃度)的循環血漿濃度，IC50如在細胞培養物中測定。這樣的信息可被用於更準確地測定 人類中的有用劑量。血漿水平可被測量，例如，通過高效液相色譜法。當治療處理被考慮時，合適的劑量還可使用動物研究被測定，以測定試驗受試者 每千克重量的生物活性劑的最大耐受劑量或MTD。一般而言，試驗的至少一種動物種類是哺 乳動物。本領域的技術人員有規律地外推有效性劑量並避免對包括人的其它物種的毒性。 在進行有效性的人類研究之前，臨床I期研究有助於確立安全劑量。此外，生物活性劑可與 多種充分確立的化合物或結構混合，所述化合物或結構例如增強生物活性劑的穩定性或另外增強其藥學性質(例如，增加體內半衰期、減小毒性等)。在本公開的某些實施方式中，組合物或劑量單位的有效劑量可為約10mg/kg至 約 0. 01mg/kg、約 10mg/kg 至約 0. 025mg/kg、約 10mg/kg 至約 0. 05mg/kg、約 10mg/kg 至約 0. lmg/kg、約 10mg/kg 至約 0. 25mg/kg、約 10mg/kg 至約 0. 5mg/kg、約 10mg/kg 至約 lmg/kg、 約 10mg/kg 至約 2. 5mg/kg、約 10mg/kg 至約 5mg/kg、約 5mg/kg 至約 0. 01mg/kg、約 2. 5mg/ kg 至約 0. Olmg/kg、約 lmg/kg 至約 0. Olmg/kg、約 0. 5mg/kg 至約 0. Olmg/kg、約 0. 25mg/kg 至約 0. 01mg/kg、約 0. lmg/kg 至約 0. 01mg/kg、約 0. 05mg/kg 至約 0. 01mg/kg、約 0. 025mg/ kg 至約 0. Olmg/kg、約 5mg/kg 至約 0. 025mg/kg、約 2. 5mg/kg 至約 0. 05mg/kg、約 lmg/kg 至 約0. lmg/kg、約0. 5mg/kg至約0. 25mg/kg或約3mg/kg至約0. lmg/kg左右的範圍。因此， 在特定的實施方式中，組合物或劑量單位的有效劑量是約0. 01mg/kg、約0. 025mg/kg、約 0. 05mg/kg、約 0. 075mg/kg、約 0. lmg/kg、約 0. 25mg/kg、約 0. 5mg/kg、約 0. 75mg/kg、約 Img/ kg、約 2. 5mg/kg、約 3mg/kg、約 5mg/kg、約 7. 5mg/kg 或約 10mg/kg 左右。試劑盒在某些情況下，公開的活性成分優選不同時或以相同的給藥途徑給予患者。本公 開因此包括試劑盒，其在被醫師使用時可簡化對患者的合適量活性成分的給藥。典型的試劑盒包括公開的化合物或其藥學可接受的鹽、前藥、溶劑合物、水合物或 其立體異構體中的一個或更多個的單一劑量單位形式。在某些實施方式中，另一藥劑的單 一劑量單位形式可與公開的化合物組合使用。目前公開的試劑盒可進一步包括用於給予活 性成分的裝置。這樣的裝置的例子包括但並不限於注射器、滴注包、貼片和吸入器。公開的試劑盒可進一步包括藥學可接受的媒介物，其可用於給予一種或更多種公 開的組合物。例如，如果公開的組合物以將為胃腸外給藥而重建的固體形式被提供，則試劑 盒可包括合適媒介物的密封容器，公開的組合物可被溶解在所述媒介物中以形成適於胃腸 外給藥的無微粒無菌溶液。藥學可接受的媒介物的例子包括但並不限於注射用水USP ；含 水媒介物，諸如但並不限於氯化鈉注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注 射液以及乳酸林格注射液；水混溶性媒介物，諸如但並不限於乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇； 和非水性媒介物，諸如但並不限於玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸異丙 酯和苯甲酸苄酯。然而，在具體的實施方式中，公開的製劑不含有任何醇或其它的共溶劑、 油或蛋白質。下面的實施例被包括以證明本發明的優選實施方式。應被本領域技術人員理解 的是，在接下來的實施例中公開的技術代表發明人發現的在發明的實施中有良好功能的技 術，並且因此可考慮構成其實施的優選模式。然而，根據本公開，本領域的技術人員應理解， 在公開的具體實施方式
中可進行許多改變，它們仍然獲得同樣的或相似的結果而不背離本 發明的精神和範圍。實施例1使用可選擇性地抑制基因的Cre-Lox 技術(Lexicon Genetics, Incorporated, The Woodlands，TX)，建立攜帶兩個拷貝的RIPl (RLIP76的小鼠形式)基因(野生型；+/+)、一個 拷貝的RIPl基因(雜合的；+/_)或無RIPl基因拷貝(純合的；-/_)的C57B小鼠。使用 PCR策略對來自通過雜合RIPl小鼠的交配雜合RIPl的大約十周齡的小鼠進行基因分型， 其中小鼠尾DNA被分離並用作PCR反應的模板，其中引物在用來創建敲除RIPl小鼠的插入
19位點的上遊和下遊。來自野生型RIP小鼠的PCR產物應是200bp的條帶，並且來自敲除純 合RIPl小鼠的PCR產物應是150bp的條帶。來自雜合RIPl小鼠的PCR產物應產生這兩條 帶。在圖IA中，泳道M是DNA梯，泳道1顯示來自敲除純合RIPl小鼠的PCR結果，泳道2 顯示來自雜合RIPl小鼠的PCR結果，泳道3顯示來自野生型RIPl小鼠的PCR結果。從雜 合(+/-)RIP1小鼠，基於通過尾組織上的聚合酶鏈反應(PCR)的基因分型，通過動物的隔離 和交配，野生型(+/+)、雜合(+/")和純合(-/-)_小鼠的群體被建立(圖1A)。來自幾個組織的粗製膜碎片被製備並進行SDS-PAGE，每個泳道應用100 μ g蛋白 質。凝膠被轉印到硝酸纖維素膜上，接下來使用抗RLIP76IgG作為一抗進行蛋白質印跡。 印跡用4-氯-1-萘酚作為發色底物被顯影。泳道1含有來自表達RLIP76的重組大腸桿菌 (pET-30a[+]-RLQLIP-BL21 (DE3)的細菌膜的除垢劑提取物。泳道2是空白。泳道3_5含有 來自肝臟的膜提取物，泳道6-8含有來自心臟的膜提取物。泳道3和6含有來自野生型RIPl 小鼠的蛋白，泳道4和7含有來自雜合RIPl小鼠的蛋白，泳道5和8含有來自純合RIPl敲 除小鼠的蛋白。β-肌動蛋白表達被用作內對照。使用抗RLIP76抗體的小鼠組織的蛋白質 印跡分析證實在RIPl雜合(+/-)小鼠中降低的RIPl水平和在來自RIPl純合(_/_)小鼠 的組織中RLIP76的缺失(圖1Β)。腹膜內注射RLIP76脂質體之後進行來自純合RIPl敲除小鼠的組織的蛋白質印跡 分析。在圖2Α中，純合RIPl敲除小鼠用含有200 μ g RLIP76蛋白的RLIP76脂質體腹膜內處 理，並在48小時之後被處死。在圖2B中，純合RIPl敲除小鼠用3個劑量的200 μ g RLIP76 脂質體在0、72小時和120小時處理，接下來在168小時被處死。標記C的泳道來自用無 RLIP76的對照脂質體處理的小鼠，標記R的泳道來自用RLIP76脂質體處理的小鼠。指明的 組織被勻漿，並且含有200 μ g蛋白的除垢劑溶解的粗製膜碎片的等分部分進行SDS-PAGE、 轉印到硝酸纖維素膜並使用抗RLIP76作為一抗及過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG作為二 抗來檢測。印跡用4-氯-1-萘酚顯影，並且β-肌動蛋白表達用作上樣對照。腹膜內給 予含有200 μ g純化RLIP76的單一劑量的RLIP76脂質體、48小時後處死動物並免疫學地 分析組織中RLIP76的存在情況，這有說服力地顯示這些脂質體可用於遞送RLIP76到試驗 的純合RIPl-/-小鼠的所有組織，包括腦(圖2A)。在8天中以相同劑量給予3個劑量的 RLIP76脂質體、之後在第10天處死，顯示RLIP76在純合RLIP76小鼠組織中的進一步積累 (圖 2B)。這些蛋白質印跡分析證實，在來自純合RIPl小鼠的被檢測的任何組織中，缺乏任 何可檢測的RIP1，和在來自用RLIP76脂質體處理的小鼠的被檢測的所有組織中，在預期的 95kDa Mr處存在完整RLIP76的條帶。38kDa條帶代表起始於胺基酸424的RLIP76的C-末 端蛋白水解片段。顯著地，甚至腦組織也具有顯著量的RLIP76，這是對於藥物遞送到腦和其 它器官而言具有顯著藥學意義的發現。實施例2在小鼠模型中進行RLIP脂質體在口服給藥時遞送核酸貨物分子到各個組織的能 力的研究。核酸是DN5，其為SET-I基因的反義寡聚體。用RT-PCR和蛋白質印跡在給藥後 24和72小時的樣品中檢測被測試各種組織中的表達。在每個研究中，小鼠被口服給予100 μ g的指定藥劑。動物在給藥後24或72小時 被處死，並且組織被取樣，用RT-PCR技術檢測感興趣基因的mRNA表達。在圖中，每一條帶
20的密度已用圖像分析軟體進行定量，並校正背景和加樣中的差異(針對每條泳道中的肌動 蛋白帶進行標準化)。Y軸上的單位是凝膠上每條帶的像素計數。DN5是SET-I基因的反義 寡聚體，R508是RLIP76的反義寡聚體(用作對照)。圖3A顯示來自用對照脂質體處理的野生型小鼠的肺(泳道1和6)、肝臟(泳道 2和7)、心臟(泳道3和8)、腦(泳道4和9)和腎臟(泳道5和10)組織中SET-ImRNA表 達的結果，其通過在處理後24小時(泳道1-5)和72小時(泳道6-10)被處死的動物的 RT-PCR分析進行檢測。SET-I正向引物基於SET-I編碼序列的核苷酸1422-1440，而SET-I 反向引物基於SET-I編碼序列的核苷酸1621-1640。β -肌動蛋白的表達被用作內對照。 β-肌動蛋白正向引物基於β-肌動蛋白編碼序列的核苷酸748-767，而β-肌動蛋白反向 引物基於β-肌動蛋白編碼序列的核苷酸1174-1193。圖3Β顯示來自用對照脂質體中的 100 μ g R508處理的野生型小鼠的肺(泳道1和6)、肝臟(泳道2和7)、心臟(泳道3和
8)、腦(泳道4和9)和腎臟(泳道5和10)組織中SET-ImRNA表達的結果，其通過在處理 後24小時(泳道1-5)和72小時(泳道6-10)被處死的動物的RT-PCR分析進行檢測。圖 3C顯示來自用100 μ g R508和100 μ g RLIP76脂質體一同處理的野生型小鼠的肺(泳道1 和6)、肝臟(泳道2和7)、心臟(泳道3和8)、腦(泳道4和9)和腎臟(泳道5和10)組 織中SET-ImRNA表達的結果，其通過在處理後24小時(泳道1_5)和72小時(泳道6_10) 被處死的動物的RT-PCR分析進行檢測。結果顯示，RLIP76反義寡聚體對SET-ImRNA表達 沒有影響。圖4A顯示來自用對照脂質體中的100 μ g R508處理的野生型小鼠的肺(泳道1和 6)、肝臟(泳道2和7)、心臟(泳道3和8)、腦(泳道4和9)和腎臟(泳道5和10)組織 中SET-ImRNA表達的結果，其通過在處理後24小時(泳道1_5)和72小時(泳道6_10)被 處死的動物的RT-PCR分析進行檢測。圖4B顯示來自用100 μ g R508和100 μ g RLIP76脂 質體一同處理的野生型小鼠的肺(泳道1和6)、肝臟(泳道2和7)、心臟(泳道3和8)、腦 (泳道4和9)和腎臟(泳道5和10)組織中SET-ImRNA表達的結果，其通過在處理後24小 時(泳道1-5)和72小時(泳道6-10)被處死的動物的RT-PCR分析進行檢測。結果顯示， 儘管對照脂質體中SET-I反義寡聚體的遞送對SET-ImRNA表達不具有劇烈影響，但RLIP76 脂質體中SET-I反義寡聚體的遞送導致SET-ImRNA表達顯著減少。這在圖5中甚至可更清楚地被看到。圖5顯示來自用對照脂質體中的200μ g DN5 處理的野生型小鼠(泳道1-5)和用Img RLIP76脂質體中的200 μ g DN5處理的野生型小 鼠(泳道6-10)的肺(泳道1和6)、肝臟(泳道2和7)、心臟(泳道3和8)、腦(泳道4和
9)和腎臟(泳道5和10)組織中SET-ImRNA表達的結果，其通過在處理後24小時被處死的 動物的RT-PCR分析來檢測。儘管SET-I反義寡聚體在對照脂質體中被遞送時，在肺、肝臟 和腦中清楚地看到SET-ImRNA表達，但當SET-I反義寡聚體在RLIP76脂質體中被遞送時， 肺和肝臟中的SET-ImRNA表達幾乎不能被檢測到，而且腦中的SET-ImRNA表達大大減少。圖6-8的圖中顯示的結果清楚地顯示，口服遞送時，就反義寡聚體向小鼠的肺(圖 6)、肝臟(圖7)和腦(圖8)的功能性遞送而言，RLIP76脂質體具有實質性的優勢，因為 與在對照脂質體中遞送相比，反義寡聚體在RLIP脂質體中遞送之後，所有那些組織都顯示 SET-I基因表達的顯著降低。圖9顯示對照脂質體中的200 μ g DN5或RLIP76脂質體中的 200 μ g DN5的口服劑量之後24小時野生型小鼠中的SET-ImRNA表達水平。儘管在心臟和腎臟中SET-ImRNA的表達非常少，但是與DN5反義寡聚體在常規脂質體中的遞送相比，DN5 反義寡聚體在RLIP76脂質體中遞送之後，肺、肝臟和腦組織中的SET-ImRNA表達大大減少。 這些結果清楚地顯示，應用口服遞送，就反義寡聚體的功能性遞送而言，RLIP76脂質體具有 實質性的優勢。實施例3進行了相似的研究，但是這次用SET-I的單克隆抗體進行免疫印跡且脂質體通 過腹膜內給藥被遞送。用這種技術，帶有和不帶有RLIP76的脂質體之間的差異小，但是 RLIP76脂蛋白體繼續證明較好的遞送。應用小鼠腦(圖10A、圖IOB和圖10C)和小鼠肺 (圖10D、圖IOE和圖10F)的200 μ g粗製部分進行SDS-PAGE並進行蛋白質印跡分析，兔抗 人SETlIgG為一抗。使用辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔IgG作為二抗對蛋白質印跡顯 影。12隻野生型小鼠被分成4組，每組3隻動物。第1組(#1)代表用IOOyg合成的反義 寡核苷酸加上對照脂質體處理的小鼠，第2組(#2)代表用IOOyg合成的反義寡核苷酸加 上200μ g RLIP76脂質體處理的小鼠，第3組(#3)代表用100 μ g DN5反義寡核苷酸加上對 照脂質體處理的小鼠，第4組(M)代表用IOOyg DN5反義寡核苷酸加上200 μ g RLIP76脂 質體處理的小鼠。條帶通過掃描光密度來定量，使用肌動蛋白作為內對照。儘管SET-I 表達的減少在通過對照脂質體的DN5反義寡聚體的遞送中被看到，但是RLIP脂質體中的 DN5反義寡聚體給予之後SET-I表達的減少大於對照脂質體中遞送之後看到的減少。因此， 再一次地，就反義寡聚體的功能性遞送而言，RLIP76脂質體具有優勢。實施例4在小鼠模型中進行RLIP脂質體在通過腹膜內注射被給予時遞送核酸貨物分子到 各個組織的能力的研究。核酸分子是GAPDH基因的siRNA分子。用RT-PCR和蛋白質印跡 在給予後24和72小時的樣品中檢測組織中的表達。三組3隻野生型balb/c小鼠被給予(腹膜內)單一劑量。第1組小鼠每隻接受 具有靶向GAPDH基因的IOOyg siRNA的50yg RLIP76脂蛋白體。第2組小鼠每隻接受 具有IOOyg陰性對照siRNA(合成序列)的50 μ gRLIP76脂蛋白體。第3組小鼠每隻接 受只具有靶向GAPDH基因的100μ gsiRNA的單獨脂蛋白體。給予後七十二小時，小鼠被處 死，腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從每隻動物中被分離。組織被分裂成兩半一半被儲存在 RNAlater(Ambion Incorporated, Austin, TX)中並在 N2 液體中冷凍；另一半在分裂緩 衝液中被勻漿。儲存在RNAlater⑧中的組織被用於總RNA分離(PARIS 試劑盒；Ambion Incorporated)，而在分裂緩衝液中勻漿的組織被用於蛋白分離。腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從小鼠中被分離，而蛋白和總RNA從組織中被分離。 對來自每組的1隻小鼠的腦和肝臟組織進行免疫組織化學(RLIP76)。基於實時qRT-PCR的 分析被進行，以測定組織中的GAPDH siRNA積累(5個組織X9隻動物=45個樣品；二份 總共90個樣品)和組織中GAPDH mRNA表達的減少(5個組織X 9隻動物=45個樣品；二 份總共90個樣品)。實施例5在小鼠模型中進行RLIP脂質體在口服給予時遞送核酸貨物分子到各個組織的能 力的研究。核酸分子是GAPDH基因的siRNA分子。用RT-PCR和蛋白質印跡在給予後24和 72小時的樣品中檢測組織中的表達。
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三組3隻野生型balb/c小鼠被口服給予單一劑量。第1組小鼠每隻接受具有靶向 GAPDH基因的100 μ g siRNA的50 μ g RLIP76脂蛋白體。第2組小鼠每隻接受具有100 μ g 陰性對照siRNA(合成序列)的50μ gRLIP76脂蛋白體。第3組小鼠每隻接受具有靶向GAPDH 基因的IOOygsiRNA的單獨脂蛋白體。給予後七十二小時，小鼠被處死，腦、肌肉、肺、腎臟 和肝臟組織從每隻動物中被分離。組織被分裂成兩半一半被儲存在RNAlater (Ambion Incorporated, Austin, TX)中並在N2液體中被冷凍；另一半在分裂緩衝液中被勻漿。儲存 在RNAlater⑧中的組織被用於總RNA分離(PARIS 試劑盒；Ambion Incorporated)，而在 分裂緩衝液中被勻漿的組織被用於蛋白分離。腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從小鼠中被分離，而蛋白和總RNA從組織中被分離。 對來自每組的1隻小鼠的腦和肝臟組織進行免疫組織化學(RLIP76)。基於實時qRT-PCR的 分析被進行，以測定組織中的GAPDH siRNA積累(5個組織X9隻動物=45個樣品；二份 總共90個樣品)和組織中GAPDH mRNA表達的減少(5個組織X 9隻動物=45個樣品；二 份總共90個樣品)。實施例6在小鼠模型中進行RLIP脂質體在通過腹膜內注射被給予時遞送核酸貨物分子到 腫瘤組織的能力的研究。核酸分子是polo樣激酶1基因(Plkl基因)的siRNA分子，所述 基因對腫瘤細胞有絲分裂和基因組穩定性的維持是必需的。用RT-PCR和蛋白質印跡在給 予後24和72小時的樣品中檢測組織中的表達。遞送的功能效果也通過監測處理之後被靶 向腫瘤的大小和生長而測量。LNCaP細胞來自人前列腺癌且被經常用於異種移植物研究。對於本研究，1至 2X IO6 個 LNCaP 細胞與 100ml Matrigel (BD Biosciences,Palo Alto，CA)被共同接種到無 免疫應答的N0D/SCID小鼠(小鼠是從NCI獲得的)的右側腹中。動物每周被檢測兩次，檢測 注射位點處可觸及腫瘤的發生。當腫瘤體積達到大約150-200mm3時，負荷腫瘤的小鼠被隨 機指定為三組中的一組(3隻小鼠/組)。第1組小鼠每隻接受具有靶向Plkl基因的100 μ g siRNA的50 μ g RLIP76脂蛋白體。第2組小鼠每隻接受具有100 μ g陰性對照siRNA (合成序 列)的50 μ g RLIP76脂蛋白體。第3組小鼠每隻接受具有靶向Plkl基因的100 μ g siRNA 的單獨脂蛋白體。給予後七十二小時，小鼠被處死，腫瘤、腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從每 只動物中被分離。組織被分裂成兩半一半被儲存在RNAlater · (Ambionlncorporated, Austin, TX)中並在N2液體中被冷凍；另一半在分裂緩衝液中被勻漿。儲存在RNAlater 『 中的組織被用於總RNA分離(PARIS 試劑盒；Ambion Incorporated)，而在分裂緩衝液中被 勻漿的組織被用於蛋白分離。腫瘤、腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從小鼠中被分離，而蛋白和總RNA從組織中 被分離。對來自每組的1隻小鼠的腦和肝臟組織進行免疫組織化學(RLIP76)。基於實時 qRT-PCR的分析被進行，以測定組織中的Plkl siRNA積累。這些研究的結果將證明，與正常組織相比，Plkl siRNA向腫瘤組織的遞送。對於下一研究，1至 2X IO6 個 LNCaP 細胞與 100ml Matrigel (BD Biosciences, Palo Alto, CA)被共同接種到無免疫應答的N0D/SCID小鼠(小鼠是從NCI獲得的)的右 側腹。動物每周被檢測兩次，檢測注射位點處可觸及腫瘤的發生。當腫瘤體積達到大約 150-200mm3時，負荷腫瘤的小鼠被隨機指定為三組中的一組(3隻小鼠/組)。第4組小鼠每隻接受具有靶向polo樣激酶1基因(Plkl基因)的100 μ g siRNA的50 μ g RLIP76脂 蛋白體，所述基因對腫瘤細胞有絲分裂和基因組穩定性的維持是必需的。第5組小鼠每隻 接受具有100 μ g陰性對照siRNA(合成序列)的50 μ gRLIP76脂蛋白體。第6組小鼠每隻 接受具有靶向Plkl基因的IOOyg siRNA的單獨脂蛋白體。腫瘤體積被每周測量並通過下 式計算體積=0. 523X長直徑(mm)2X短直徑(mm)。數據點被記錄為平均值士SD。這些研究的結果將證明，與使用RLIP76脂蛋白體的對照siRNA到腫瘤組織的遞 送和使用對照脂質體的Plkl siRNA到腫瘤組織的遞送相比，使用RLIP76脂蛋白體的Plkl siRNA到腫瘤組織的遞送的效果。使用口服給藥重複上面的研究，以測定當口服給予時，RLIP脂質體遞送核酸貨物 分子到腫瘤組織的能力。使用A549細胞——它是經常用於檢測的非小細胞肺癌細胞系——重複上面的腹 膜內和口服給藥研究，以證明與正常組織相比，Plkl siRNA向腫瘤組織的遞送，並證明與使 用RLIP76脂蛋白體的對照siRNA到腫瘤組織的遞送和使用對照脂質體的Plkl siRNA到腫 瘤組織的遞送相比，使用RLIP76脂蛋白體的Plkl siRNA到腫瘤組織的遞送的效果。實施例7在小鼠模型中進行RLIP脂質體在通過腹腔注射被給予時遞送核酸貨物分子到位 於腦中的腫瘤組織的能力的研究。核酸是STAT3基因的siRNA分子，已知STAT3基因在被 充分表徵的人膠質母細胞瘤細胞系D54-MG細胞中異常地活躍，並對其增殖是必需的。用 RT-PCR和蛋白質印跡在給予後24和72小時的樣品中檢測組織中的表達。遞送的功能性效 果也通過監測處理之後被靶向腫瘤的大小和生長而測量。在本研究中，在裸鼠中被傳遞的皮下異種移植物被切除、切碎並用0. 5%膠原酶在 胰蛋白酶化的燒瓶中室溫分裂2小時。在Ficoll密度梯度上分離活細胞，用DPBS衝洗兩 次，在2. 5%甲基纖維素中以13X IO7個細胞/ml的濃度重懸，並使用500-微升Hamilton 氣密注射器和注射儀(Hamilton Co.，Reno, NV)以10 μ 1的體積通過33-號灌注管注射到 在BALBc小鼠前腦中植入的導管中。在組織學檢查中，腫瘤在腫瘤激發後三天在顯微鏡下 一致地明顯，並且在激發後九天的整個屍檢中在肉眼下是明顯的。通過體積外推，這些肉眼 可見的腫瘤的大小相當於直徑4cm的人神經膠質瘤。根據下面的方案，小鼠在5組中被研 允。第1組小鼠每隻接受具有靶向STAT3基因的100 μ g siRNA的50 μ gRLIP76脂蛋 白體。第2組小鼠每隻接受具有IOOyg陰性對照siRNA(合成序列)的50 μ g RLIP76脂 蛋白體。第3組小鼠每隻接受具有靶向STAT3基因的IOOyg siRNA的單獨脂蛋白體。給 予後七十二小時，小鼠被處死，腫瘤、腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從每隻動物中被分離。組 織被分裂成兩半一半被儲存在RNAlater <g) (Ambion Incorporated, Austin, TX)中並在 液氮中被冷凍；另一半在分裂緩衝液中被勻漿。儲存在RNAlater · 中的組織被用於總RNA 分離(PARIS 試劑盒；Ambion Incorporated)，而在分裂緩衝液中被勻漿的組織被用於蛋 白分離。腫瘤、腦、肌肉、肺、腎臟和肝臟組織從小鼠中被分離，而蛋白和總RNA從組織中 被分離。對來自每組的1隻小鼠的腦和肝臟組織進行免疫組織化學(RLIP76)。基於實時 qRT-PCR的分析被進行，以測定組織中的STAT3siRNA積累。
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這些研究的結果將證明相對於正常組織，STAT3siRNA對腫瘤組織的遞送。在下一研究中，在裸鼠中被傳遞的皮下異種移植物被切除、切碎並用0. 5%膠原酶 在胰蛋白酶化的燒瓶中室溫分裂2小時。在Ficoll密度梯度上分離活細胞，用DPBS衝洗 兩次，在2. 5%甲基纖維素中以13 X IO7個細胞/ml的濃度重懸，並使用500-微升Hamilton 氣密注射器和注射儀(Hamilton Co.，Reno, NV)以10 μ 1的體積通過33-號灌注管注射到 在BALBc小鼠前腦中植入的導管中。在組織學檢查中，腫瘤在腫瘤激發後三天在顯微鏡下 一致地明顯，並且在激發後九天的整個屍檢中在肉眼下是明顯的。通過體積外推，這些肉眼 可見的腫瘤的大小相當於直徑4cm的人神經膠質瘤。根據下面的方案，小鼠在5組中被研 允。第4組小鼠每隻接受具有靶向STAT3基因的100 μ g siRNA的50 μ gRLIP76脂蛋 白體。第5組小鼠每隻接受具有IOOyg陰性對照siRNA(合成序列)的50 μ g RLIP76脂 蛋白體。第6組小鼠每隻接受具有靶向STAT3基因的IOOyg siRNA的單獨脂蛋白體。10 天之後，小鼠被處死並在整個屍檢中進行腫瘤檢測，且腫瘤組織被獲得，進行用Ki-67和膜 聯蛋白V抗體的免疫組織化學分析以分別測量細胞增殖和凋亡。使用口服給藥重複上面的研究，以測定當口服給予時，RLIP脂質體遞送核酸貨物 分子到位於腦中的腫瘤組織的能力。本文公開的和請求保護的所有組合物和方法可根據本公開被製造和執行，而無需 過度的實驗。雖然本發明的組合物和方法已針對優選的實施方式被描述，但是對本領域的 技術人員來說顯而易見的是，在不背離本發明的概念、精神和範圍的情況下，對本文描述的 組合物和/或方法以及在方法的步驟或步驟順序中可應用變化。更具體地，顯而易見的是， 化學和生理學相關的某些藥劑可代替本文描述的藥劑，同時會實現相同的或相似的結果。 對本領域的技術人員來說顯而易見的所有這種相似的替代和修改被認為是在如所附權利 要求所限定的本發明的精神、範圍和概念內。
權利要求
將貨物分子遞送到細胞的方法，其包括用包含RLIP76蛋白和貨物分子的脂蛋白體接觸所述細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是腦細胞、心臟細胞、肝臟細胞、腎臟細 胞、肺臟細胞或眼細胞。
3.根據權利要求3所述的方法，其中所述細胞是腦細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述細胞是腦腫瘤細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述貨物分子是核酸分子或多肽分子。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述貨物分子是核酸分子。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述貨物分子是RNA分子。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述貨物分子是反義RNA分子。
10.根據權利要求8所述的方法，其中所述貨物分子是小抑制RNA分子。
11.組合物，其包括包含RLIP76蛋白和貨物分子的脂蛋白體，其中所述脂蛋白體在藥 學可接受的載體中。
12.根據權利要求11所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸分子或多肽分子。
13.根據權利要求12所述的組合物，其中所述貨物分子是核酸分子。
14.根據權利要求13所述的組合物，其中所述貨物分子是反義核酸分子。
15.根據權利要求13所述的組合物，其中所述貨物分子是小抑制核糖核酸分子。
16.根據權利要求11所述的組合物，其中所述藥學可接受的載體被配製用於口服、腹 膜內、靜脈內、肌肉內、吸入、經黏膜或透皮給藥。
17.根據權利要求16所述的組合物，其中所述藥學可接受的載體被配製用於口服給藥。
18.將貨物分子遞送到需要其的受試者的方法，包括給予所述受試者治療有效量的藥 物組合物，所述藥物組合物包含藥學可接受的載體中的脂蛋白體，其中所述脂蛋白體包含 RLIP76蛋白和貨物分子。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述貨物分子是核酸分子或多肽分子。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述貨物分子是核酸分子。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述貨物分子是反義核酸分子。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述貨物分子是小抑制核糖核酸分子。
23.根據權利要求18所述的方法，其中所述藥物組合物被口服、腹膜內、靜脈內、肌肉 內、通過吸入、經黏膜或透皮遞送。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述藥物組合物被口服遞送。
25.根據權利要求18所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到所述受試者的腦、心臟、 肝臟、腎臟或肺臟。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到腦。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到所述腦內的神經元或血 管內皮細胞。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到所述腦內的神經元和血 管內皮細胞。
29.根據權利要求18所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到所述受試者中的腫瘤。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到所述受試者的中樞神經 系統內的腫瘤。
31.根據權利要求18所述的方法，其中所述貨物分子被遞送到所述受試者的肌肉。
全文摘要
將貨物分子遞送給需要其的患者或受試者的組合物和方法包括併入RLIP76蛋白並含有貨物分子的脂蛋白體載體媒介物。該媒介物有效地將貨物分子全身性地遞送到身體的整個組織，包括進入到中樞神經系統中。
文檔編號A61K9/127GK101980724SQ200980111647
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月9日 優先權日2008年2月7日
發明者C·C·坎寧安 申請人:泰拉皮奧公司