一種細胞培養微流控晶片及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-14 06:59:56
專利名稱：一種細胞培養微流控晶片及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微流控晶片，具體地說是涉及一種用於細胞微環境研究的細胞培養微流控晶片，以及其製備方法和在細胞微環境研究中的應用。
背景技術：
細胞微環境是一個多因素組成的複雜集合，其對細胞增殖、分化、遷移和代謝等行為和功能都起著重要作用。而細胞的這些行為與胚胎發育、血管新生、組織修復、免疫防禦、 以及腫瘤發生等重要生理病理過程都密切相關。近年來對細胞微環境的研究已成為研究熱點和難點。細胞所處的微環境十分複雜，其複雜性可概括為:細胞所處的三維微尺度空間對細胞行為的影響；不同細胞類型間細胞相互作用；胞外基質與細胞間相互作用；可溶性生化因子濃度及其濃度梯度分布的作用；各種力學因素，包括細胞外基質材料的硬度、機械力刺激(如間隙流引起的剪切力和液壓差引起的壓力分布)等的作用。而傳統的細胞體外培養只能提供一種二維的、靜態的細胞生長環境，很難為細胞提供一個近似在體的生長環境， 從而導致許多體外研究結果與在體情況相差甚遠。為了克服傳統方法中的不足，使細胞體外研究結果更好地反映細胞的在體行為，亟需構建一種新的研究系統，能夠為細胞的生長提供一個近似於在體的生存環境，並能對其生存環境的關鍵參數進行精確控制，同時還能實時考察細胞對其變化的響應。
近年發展起來的微流控技術為體外細胞微環境對細胞行為影響的研究提供了可能。20世紀90年代初基於微機電系統(MEMS)加工技術發展起來的微流控晶片，由於其分析速度快、試劑消耗少、便於集成和高通量分析等諸多優點，在生化分析等領域逐步得到應用，已經成為目前研究熱點和前沿。近年來，有報導將微流控晶片技術應用於細胞研究，給細胞研究提供了新的方法和平臺。目前國內外關於這方面的報導已有五千多篇，並呈現出快速增長的趨勢。
微流體晶片可通過集成在細胞培養腔體內的微結構陣列或者是利用微流體層流性質形成的細胞凝膠結構等方法可實現細胞的立體培養，建立細胞研究的基礎平臺，結合晶片內微流體形成的化學物質的濃度梯度，精細控制細胞外基質，建立濃度依賴的分析法， 實現細胞響應的高通量檢測；微流體產生的剪切力施加於細胞，可模擬其在體內環境的受力情況，可使細胞的活性較常規培養有很大提高，為利用微晶片進行組織研究奠定良好基礎。微流體器件集成性能優良，在細胞培養晶片內可以集成微閥等器件，實現培養基以及刺激液的自動進樣，可以建立細胞分析的自動化平臺。
聚二甲基娃氧燒(Polydimethylsiloxane, PDMS)是一種廣泛應用於微流控等領域的聚合物材料。其是一種高分子有機矽化合物，具有無毒性、高透氣性、透光性良好、生物相容性佳、易與多種材質室溫接合等特點。此外，其成本低，使用簡單，且有極佳的可塑性、 熱穩定性和化學惰性。由於以上顯著優點，使其成為目前微流控晶片製作使用最多的聚合物材料，也常用於晶片封裝、微流道、微混合器、微泵浦、微閥門等元件製作等領域。
現在有微流控芯 片大多是利用軟光刻法加工製作微流控晶片，其製作過程較為繁複且需要藉助一些昂貴、高精度的儀器來完成。例如:其掩膜的製作需藉助高精度膠片印表機來完成；利用SU-8負性光刻膠光刻製作陽模的過程相當複雜、繁瑣；大多數的晶片必須藉助等離子表面處理器鍵合來完成封裝；晶片灌膠必須藉助精密儀器來完成等。而且此類晶片清洗困難，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了實驗成本。這些都使微流控晶片在普通實驗的應用受到了很大範圍的限制。此外，由於需藉助等離子表面處理器鍵合來完成封裝，必須使用較厚的載玻片來作為底面基底，不利於雷射共聚焦等的觀察。因此，設計、 製作一種可實現多細胞的三維共培養，生化因子濃度梯度生成以及力學刺激加載同時製作簡便，又易於觀察的微流控晶片，對於細胞微環境的研究，無疑有著重要的意義。發明內容
針對上述現狀，本發明提供了一種用於細胞微環境研究的細胞培養微流控晶片及其製備方法。該微流控晶片結構簡單、微型化，製備方法易於操作，製備成本低，僅需PDMS 及常規標準玻片即可。該微流控晶片可以實現多種細胞的三維共培養，實現胞外基質硬度可調、生化因子濃度及濃度梯度生成、壓力及壓力梯度的加載，用來研究細胞微環境對細胞行為和功能的影響。
本發明通過以下技術方案解決上述問題:
本發明提供了一種用於細胞培養的微流控晶片，包括細胞培養層、基底層和夾持層，所述細胞培養層和夾持層之間三邊密封成夾套結構，所述基底層以可取出的方式插接在夾套結構中，基底層與細胞培養層之間的接觸面密封，所述細胞培養層上分布設置有至少兩個孔，孔與基底層共同形成細胞培養小室。
進一步，所述夾持層設有觀測孔。
進一步，所述細胞培養小室填充有凝膠，每個細胞培養小室通過凝膠貫通。
更進一步,所述微流控晶片為透明材質製成,長3_5cm,寬l_3cm,高0.4_lcm,設有 3-6個細胞培養小室。
現在有微流控晶片大多是利用軟光刻法加工製作微流控晶片，其製作過程較為繁複且需要藉助一些昂貴、高精度的儀器來完成。而且此類晶片清洗困難，往往只能一次性使用，在一定程度上增加了實驗成本。這些都使微流控晶片在普通實驗的應用受到了很大範圍的限制。
因此，本發明提供了一種細胞培養微流控晶片的簡易製作方法，製作原料僅需實驗室各種常規標準的玻片及PDMS，製作成本低，簡單易行。該方法製作的細胞培養微流控晶片可以重複利用。細胞培養微流控晶片的簡易製作方法包括如下進行的步驟:
a排布玻片
在玻璃容器中放置5片直徑為18mm的圓形玻片，將I片長60mmX寬24mm的長方形蓋玻片覆蓋在圓形蓋玻片上面，然後將7片IOmmX IOmm的方形蓋玻片放置在長方形蓋玻片的上面相對於圓形蓋玻片的中間，在IOmmX IOmm的方形蓋玻片的一個邊或多個邊旁邊相對中間的位置分別緊靠放置5片8_X8_的方形蓋玻片。在這一步驟中，玻片的排布方式可以根據需要自行調整，也可以選擇其他規格的玻片來排布；另一方面，微流控晶片細胞培養小室的尺寸，長寬高都可以根據不同需求做相應的調整，如可以通過選擇不同規格的玻片及玻片數量來 控制，比如可以選擇5mmX 5mm的方形蓋玻片來排布，也可以將上述5片8_X8_的方形蓋玻片換成4片8_X8_的方形蓋玻片等，可根據具體需要便捷的更改晶片尺寸，這更加體現了本發明的細胞培養微流控晶片的製作方法簡便易行。一般在製作過程中，要使中間的細胞培養小室的高度要高於其他的細胞培養小室，這樣可以利用表面張力的作用使得基質、膠原或細胞與三維培養基質的混合物注入細胞培養小室時不會洩漏到其他的細胞培養小室中；
b PDMS預聚液的配製
PDMS主劑與固化劑按10: I的質量比混合併充分攪拌混勻，製成PDMS預聚液，用真空泵進行脫泡處理以去除攪拌過程中產生的氣泡；
c 倒模
將PDMS預聚液小心注入步驟a中已排布好玻片的玻璃容器中，厚度在0.4至1cm， 再次用真空泵進行脫泡處理，然後放於80°C烘箱中固化24h ；
d微流控晶片成形
待步驟c中PDMS充分固化後,將其從玻璃容器中剝尚下來,切割邊緣部分成型 (修剪成合適的大小)，然後用酒精浸泡晶片IOmin (利於剝離底部玻片)，小心將底部的所有玻片取出，注意保持PDMS完整性，用打孔器在晶片上側和下側分別打孔；上側打孔是在每個細胞培養小室上端的位置，方便向細胞培養小室中加入膠原或基質膠或細胞懸液或培養基。孔的大小也可以根據不同需求使用不同的打孔器來做相應調整。
e 封裝
將步驟d中成形的微流控晶片用清水反覆衝洗，待晶片衝洗乾淨，將經酒精、無菌水清洗的大小合適的玻片插入步驟d中長方形玻片的位置即形成基底層，完成對晶片的封裝。基底層是可以從晶片夾套中取出，使得本發明的微流控晶片易於清洗、滅菌，可反覆 使用。本發明的微流控晶片實驗室可選擇75%酒精滅菌或者高溫高壓滅菌。
在上述製作方法中作為基底層的玻片的材料也可以是聚二甲基矽氧烷PDMS或聚甲基丙烯酸甲酯PMMA或聚碳酸酯PC或聚丙乙烯PS ；PDMS材料也可以用聚甲基丙烯酸甲酯 PMMA或聚碳酸酯PC或聚丙乙烯PS來代替。
細胞所處的微環境十分複雜，在細胞微環境研究領域，傳統的細胞體外培養只能提供一種二維的、靜態的細胞生長環境，很難為細胞提供一個近似在體的生長環境，從而導致許多體外研究結果與在體情況相差甚遠。細胞的三維培養能夠為細胞的生長提供一個近似於在體的生存環境，並能對其生存環境的關鍵參數進行精確控制，同時還能實時考察細胞對其變化的響應。
因此，本發明還提供了一種基於上述用於細胞培養的微流控晶片的細胞培養方法。
細胞二維培養的方法為:將膠原或基質膠灌入細胞培養小室中，待成膠後，直接將細胞懸液再加入細胞培養小室中，進行二維培養；
細胞三維培養的方法為:細胞與膠原或基質膠混合後灌入細胞培養小室中，待成膠後，再向細胞培養小室中加入培養基進行培養；細胞的三維培養能夠為細胞提供一個近似在體的生長環境，並能對其生存環境的關鍵參數進行精確控制，實時考察細胞對其變化的響應，使細胞體外研究結果更好地反映細胞的在體行為。
細胞貼壁三維培養的方法為:膠原或者基質膠混合後灌入一個細胞培養小室中，待成膠後，直接將細胞懸液加入到另外的任一個細胞培養小室中，豎直放置30min，在上述加入細胞懸液的細胞培養小室中加入培養基後進行培養；
多種細胞的三維共培養的方法為:將細胞A與膠原或者基質膠混合後灌入一個細胞培養小室中，待成膠後，加入培養基後孵育30min，細胞B與膠原或基質膠混合後灌入另外的任一個或多個細胞培養小室，成膠後，在上述加入細胞B的細胞培養小室中加入培養基進行培養。多種細胞的三維共培養有助於考察不同細胞類型間細胞之間的相互作用。
本發明的有益效果:綜上所述，本發明的有益效果在於提供了一種新型、簡便的微流控晶片，其製作簡單，製作成本低，僅需實驗室常規玻片及PDMS即可，本發明無需藉助昂貴的儀器即可實現微流控晶片的製作，可根據具體需要便捷的更改晶片尺寸，晶片易於清洗、滅菌，可反覆使用，可根據具體需要實現多種方式的細胞培養，可用於研究細胞微環境對細胞行為的影響，該微流控晶片通過巧妙的構型設計和微流體控制技術，能夠精確地調控細胞所處的微環境中的幾大重要參數，包括:胞外基質理化特性、生化因子濃 度梯度、壓力梯度等，有助於考察不同細胞類型間細胞之間的相互作用，有助於考察胞外基質理化特性對細胞生物行為的影響，有助於發現影響細胞生物行為的調控因素，以獲得特定的細胞反應，得到較為可靠的結果，並為生物晶片領域的微流控晶片簡易製作提供了新思路。
以下將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述。
圖1為微流控晶片細胞培養層示意圖2為微流控晶片玻片插入一側側視圖3為微流控晶片夾套層示意圖4為基於常規玻片及PDMS的細胞培養微流控晶片的製備步驟a中玻片排布示意圖5為微流控晶片灌膠後實物圖6為基於微流控晶片，內皮細胞二維培養條件下成管腔樣結構；
圖7為基於微流控晶片，內皮細胞三維培養條件下的血管出芽圖8為基於微流控晶片，內皮細胞三維培養條件下，用共聚焦顯微鏡考察內皮細胞的血管出芽三維重構圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，以下通過實施例結合附圖對本發明做進一步的說明。
若無特殊說明，所用實驗方法為常規實驗方法；所使用的試劑和材料等均可通過商業途徑獲得。
實施例1 一種細胞培養微流控晶片的結構
用於細胞培養的微流控晶片，包括細胞培養層1、基底層2和夾持層3 (圖2所示)， 所述細胞培養層I和夾持層3之間三邊密封成夾套結構，所述基底層2以可取出的方式套於夾套結構內，基底層與細胞培養層之間密封，所述細胞培養層上分布設置有5個孔，中間 I個孔，在其四周分布4個孔，每個孔與基底層共同形成細胞培養小室4 (圖1所示)。另外在所述夾持層設有觀測孔5，便於顯微鏡下的可視觀察(圖3所示)。
所述微流控晶片為PDMS材料製成，長3cm，寬2cm，高0.5cm,設有5個細胞培養小室，每個細胞培養小室通過填充凝膠貫通，如圖5所示的實物圖。
另外中間細胞培養小室的高度比4個周邊細胞培養小室的高度高出0.3mm，這樣可以利用表面張力作用使得細胞和三維培養基質的混合物注入中間細胞培養小室時不會洩漏到細胞培養小室中。
所述觀測孔5是顯微鏡觀察的可視窗口，利用基底材料具有高透明度的性質，使得該微流控裝晶片可以有較好的可視窗口以便於觀察細胞培養腔中所培養細胞的形態及行為變化。
所述微流控晶片的基底層2材料為玻璃，細胞培養層I和夾套層3的材料為聚二甲基矽氧烷PDMS。
實施例2實施例1中細胞培養微流控晶片的玻片的排布方式
先放置5片直徑為18mm的圓形玻片7,將I片長60mmX寬24mm的長方形蓋玻片 8覆蓋在圓形蓋玻片上面，然後將7片IOmmX IOmm的方形蓋玻片9 (總厚度為1.05mm)放置在長方形蓋玻片8的上面相對於圓形蓋玻片7的中間，在方形蓋玻片9的一個邊或多個邊旁邊相對中間的位置分別緊靠放置5片8mmX8mm的方形蓋玻片10 (總厚度為0.75mm),這樣中間的細胞培養小室就比其他的細胞培養小室高0.3mm。圖4為玻片的排布示意圖。
實施例3實施例1的細胞培養微流控晶片的簡易製備方法
一種細胞培養微流控晶片的簡易製備方法是利用實驗室常規標準玻片及聚二甲基矽氧烷PDMS兩種材料來製備的，具體方法如下:
a排布玻片
將玻片按圖2所示的設計排布，在玻璃容器6中放置5片直徑為18mm的圓形玻片7，將I片長60mmX寬24mm的長方形蓋玻片8覆蓋在圓形蓋玻片上面，然後將7片 IOmmX IOmm的方形蓋玻片9(總厚度為1.05mm)放置在長方形蓋玻片8的上面相對於圓形蓋玻片7的中間，在方形蓋玻片9的一個邊或多個邊旁邊相對中間的位置分別緊靠放置5 片8mmX8mm的方形蓋玻片10 (總厚度為0.75mm)，這樣中間的細胞培養小室就比其他的細胞培養小室高0.3mm。
b PDMS預聚液的配製
PDMS主劑與固化劑按質量比10: I的比例混合併充分攪拌混勻，製成PDMS預聚液，用真空泵分多次進行脫泡處理以去除攪拌過程中產生的氣泡。
c 倒模
將PDMS預聚液小心注入步驟a中已排布好玻片的培養皿中，厚度為0.5cm，再次用真空泵進行脫泡處理，最後將培養皿於80°C烘箱中固化24h ；
d微流控晶片成形
待步驟c中PDMS充 分固化後，將其從一次性培養皿中剝離下來，切割邊緣部分成型，然後用酒精浸泡晶片IOmin以利於剝離底部玻片，小心將底部的所有玻片取出，注意保持PDMS完整性，用打孔器在晶片的上側和下側打孔。成形晶片中間的細胞培養小室的尺寸為:10mmX10mmXl.05mm，4個周邊的細胞培養小室的尺寸為:8mmX8mmX0.75mm。上側打孔是在每個細胞培養小室上端的位置，方便向細胞培養小室中加入膠原或基質膠或細胞懸液或培養基。在本實施例中，中間細胞培養小室上端的孔開的比較小，直徑為3mm，主要是為了使基質、膠原或細胞與三維培養基質的混合物注入中間的細胞培養小室時不會洩漏到其他的細胞培養小室中。
e清洗、封裝
將步驟d中成形的微流控晶片用清水反覆衝洗，待晶片衝洗乾淨，將經酒精、無菌水清洗的一張60_X 24_玻片插入步驟d中長方形玻片的位置即形成基底層，完成對晶片的封裝。
實施例4人臍靜脈內皮細胞的二維培養
將膠原或基質膠灌入細胞培養小室4中，待成膠後，直接將人臍靜脈內皮細胞株懸液再加入細胞培養小室4中，使用DMEM完全培養基進行培養，進行二維培養，觀察細胞形態，如圖6所示。
實施例5人臍靜脈內皮細胞的三維培養
將人臍靜脈內皮細胞與膠原或基質膠混合後灌入中間的細胞培養小室4中，待成膠後，再向中間的細胞培養小室4中加入使用DMEM完全培養基進行培養進行培養，觀察細胞形態及行為，如圖7所示。
實施例6人臍靜脈內皮細胞的貼壁三維培養
將膠原或者基質膠混合後灌入中間的細胞培養小室4中，待成膠後，直接將人臍靜脈內皮細胞株懸液加入到其周圍的一個細胞培養小室中，豎直放置30min，在上述加入人臍靜脈內皮細胞株懸液的細胞培養小室中加入內皮細胞培養基後(DMEM完全培養基)進行培養，觀察內皮細胞形態和行為，如圖8所示。
最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本 發明的權利要求範圍當中。
權利要求
1.用於細胞培養的微流控晶片，其特徵在於，包括細胞培養層(I)、基底層(2)和夾持層(3)，所述細胞培養層⑴和夾持層(3)之間三邊密封成夾套結構，所述基底層(2)以可取出的方式插接在夾套結構中，基底層(2)與細胞培養層(I)之間的接觸面密封，所述細胞培養層(I)上分布設置有至少2個孔，孔與基底層(2)共同形成細胞培養小室(4)。
2.根據權利要求I所述的用於細胞培養的微流控晶片，其特徵在於所述夾持層(3) 設有觀測孔(5)。
3.根據權利要求I所述的用於細胞培養的微流控晶片，其特徵在於細胞培養小室(4) 填充有凝膠，每個細胞培養小室(4)通過凝膠貫通。
4.根據權利要求I所述的用於細胞培養的微流控晶片所述微流控晶片為透明材質製成，長3-5cm,寬l-3cm,高O. 4-lcm,設有3-6個細胞培養小室(4)。
5.權利要求4所述的細胞培養微流控晶片的製備方法，其特徵在於，所述微流控晶片的製備材料僅用玻片和PDMS，包括如下進行的步驟a排布玻片在玻璃容器(6)中放置5片直徑為18mm的圓形玻片(7)，將I片長60mmX寬24mm的長方形蓋玻片(8)覆蓋在圓形蓋玻片上面，然後將7片IOmmX IOmm的方形蓋玻片(9)放置在長方形蓋玻片(8)的上面相對於圓形蓋玻片(7)的中間，在方形蓋玻片(9)的一個邊或多個邊旁邊相對中間的位置分別緊靠放置5片8_X8mm的方形蓋玻片(10)； b PDMS預聚液的配製PDMS主劑與固化劑按10 I的質量比混合併充分攪拌混勻，製成PDMS預聚液； c倒模將PDMS預聚液小心注入步驟a中已排布好玻片的玻璃容器中，厚度在O. 4-lcm,然後放於80°C烘箱中固化24h ； d微流控晶片成形待步驟c中PDMS充分固化後,將其從玻璃容器中剝尚下來,切割邊緣部分成型，將底部的所有玻片取出，用打孔器在晶片上側和下側分別打孔； e封裝將一張玻片插入步驟d中長方形玻片的位置即形成基底層，完成對晶片的封裝。
6.基於權利要求1-5任一項所述的微流控晶片的細胞培養方法。
7.根據權利要求6所述的細胞培養方法，其特徵在於，細胞二維培養的方法為將膠原或基質膠灌入細胞培養小室(4)中，待成膠後，直接將細胞懸液再加入細胞培養小室(4) 中，進行二維培養。
8.根據權利要求6所述的細胞培養方法，其特徵在於，細胞三維培養的方法為細胞與膠原或基質膠混合後灌入細胞培養小室(4)中，待成膠後，再向細胞培養小室(4)中加入培養基進行培養。
9.根據權利要求6所述的細胞培養方法，其特徵在於，細胞貼壁三維培養的方法為膠原或者基質膠混合後灌入一個細胞培養小室(4)中，待成膠後，直接將細胞懸液加入到另外的任一個細胞培養小室中，豎直放置30min，在上述加入細胞懸液的細胞培養小室中加入培養基後進行培養。
10.根據權利要求6所述的細胞培養方法，其特徵在於，多種細胞的三維共培養的方法為將細胞A與膠原或者基質膠混合後灌入一個細胞培養小室(4)中，待成膠後，加入培養基後孵育30min，細胞B與膠原或基質膠混合後灌入另外的任一個或多個細胞培養小室，成膠後，在上述加入細胞B的細胞培養小室中加入培養基進行培養。
全文摘要
本發明涉及生物晶片領域，特別涉及一種細胞培養微流控晶片及其製作方法和應用，所述微流控晶片包括細胞培養層(1)、基底層(2)和夾持層(3)；所述微流控晶片的製備所需材料是實驗室常規玻片和PDMS，通過排布玻片、PDMS預聚液的配製、倒模、成形及封裝五個步驟製得的；本發明的微流控晶片製作簡單、製作成本低，無需藉助昂貴的儀器即可實現微流控晶片的製作，本發明提供的微流控晶片可實現多種方式的細胞培養，並通過巧妙的構型設計和微流體控制技術，能夠精確地調控細胞所處的微環境中的參數，考察細胞微環境對細胞行為的影響。
文檔編號C12N5/00GK103255057SQ20131016667
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月8日 優先權日2013年5月8日
發明者陳斯佳, 蔡紹皙, 張利光, 鄒米莎, 趙毅, 何騰龍, 陳龍聰, 李博, 柯明 申請人:重慶大學