一種從環境樣品中提取純化和檢測副豬嗜血桿菌的方法與流程

2023-05-14 23:49:16

本發明涉及一種從環境樣品中提取純化和檢測副豬嗜血桿菌的方法，屬於生物技術領域。

背景技術：

隨著科技的進步，pcr技術逐漸被應用到環境微生物中特定細菌的檢測中，如土壤、未經處理的生活廢棄物、醫院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環境中的微生物檢測。

隨著規模化、集約化養殖場數量的增加，畜禽的糞便和汙水排放量劇增，環境汙染問題越來越突出，一些致病性微生物如豬副豬嗜血桿菌混跡其間，對人畜健康造成極大的危害，也給養殖業的健康發展帶來無法估量的經濟損失。因此，需要對養殖場環境病原微生物進行實時監測，以防止動物疫病的爆發與蔓延。

迄今，對病原菌的檢測和鑑定大多採用傳統的方法，即對病料進行病原培養分離，配合血清型鑑定來診斷畜禽疾病。該方法雖然比較準確，但耗時費力，鑑定時間長(一般需要2～4天)，易受細菌生理條件和抗生素使用限制，常導致培養假陰性，很難滿足臨床要求。

pcr技術以其敏感性強，特異性好，檢測時間短等特點被廣泛應用於許多病原菌的快速鑑定。但對於環境中的病原菌而言，環境中存在大量幹擾物質影響pcr檢測，如腐殖質等。所以傳統的解決辦法就是採用去除腐殖質試劑對樣品進行洗滌，去除腐殖質，然後用裂解試劑裂解環境中的細菌，析出dna複合物，用蛋白酶去除dnp中的蛋白質，析出dna，再經純化，洗滌作為dna檢測的樣品試劑。此類方法存在繁瑣的dna的提取純化過程，且常常會導致提取失敗。目前市場上有針對具體病原菌dna提取的試劑盒，但步驟繁多，且價格昂貴，難以推廣進行日常使用。

菌落pcr因為不用提取細菌dna而直接進行檢測而廣受追捧，但如何提取純化能直接用於pcr檢測的環境樣品中的病原菌，仍然是一個很難解決的問題。

因此，在生產實踐中，亟需快速檢測鑑定技術來幫助廣大基層獸醫工作者來快速診斷檢測，為儘早防治病原菌的侵襲提供寶貴的時間。

技術實現要素：

本發明提供了一種檢測環境樣品中副豬嗜血桿菌的方法，它包括如下步驟：

(1)從環境樣品中提取純化總細菌，重懸菌液備用；

(2)將重懸菌液直接上機進行菌落pcr擴增副豬嗜血桿菌的任一段特定的dna序列，用於擴增的上遊引物序列如seqno.1所示，下遊引物序列如seqno.2所示；

(3)檢測擴增產物，與陽性對照比較，判斷提取純化的總細菌中是否含有副豬嗜血桿菌。

本方法可用於多種環境中的副豬嗜血桿菌的檢測，如土壤、未經處理的生活廢棄物、醫院廢棄物、工廠廢棄物、垃圾和人畜糞便以及大氣中的漂浮物和氣溶膠等環境中微生物的提取純化。本發明一個具體實施方式中，用於檢測的環境樣品為養殖環境中的糞樣、墊草、墊土(即土壤)。

seqno.1和seqno.2所示的鹼基序列為：

seqno.1：5』-gtgatgaggaagggtggtgt-3』，

seqno.2：5』-ggcttcgtcaccctctgt-3』。

進一步地，總細菌的提取方法包括如下步驟：

(1)取環境樣品，加入水或緩衝液，混勻；

(2)加入苯酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，待溶劑分層，移取上層備用；

(3)將移取的上層進行離心，棄上清，保留沉澱；

(4)將沉澱洗滌至基本無色，用水或緩衝液重懸菌液即可。

所述「溶劑分層」，是指步驟(2)引入的有機溶劑與步驟(1)中引入的水或緩衝液，由於兩者不能完全互溶而分為兩層(也可以稱為兩相)，本發明中取上層(主要是水相)。但有機溶劑與水或緩衝液可能會有一定互溶比例，因此，不排除各相溶劑中均含有一定量的有機溶劑和水。本發明中溶劑分層，可以採取多種方式，如靜置、離心等。

優選地，加入環境樣品中或重懸沉澱的為pbs緩衝液。

優選地，步驟(2)中，苯酚-氯仿-異戊醇混合液中，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1～100:24:1。

優選地，苯酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

優選地，步驟(4)中，洗滌液為tenpp緩衝液，tenpp緩衝液組成為：50mmol/ltris，20mmol/ledta，100mmol/lnacl，1％pvpp，ph10.0。

本發明還提供了一種檢測檢測副豬嗜血桿菌的試劑盒，包括序列如seqno.1和seqno.2所示的引物對，擴增來自副豬嗜血桿菌的基因。

本發明進一步提供了seqno.1和seqno.2所示的核苷酸序列的用途，可用於擴增或擴增後檢測來自副豬嗜血桿菌的基因。

優選地，加入環境樣品中和重懸沉澱(總細菌)的水為無菌水(如ddh2o)或無菌生理鹽水，緩衝液為pbs緩衝液或tris-hcl緩衝液。

進一步優選地，加入環境樣品中和重懸沉澱(總細菌)的為pbs緩衝液，其效果略優於水和其他緩衝液。

優選地，環境樣品和pbs緩衝液的質量體積比為1g：3ml。

優選地，步驟(2)中，加入的苯酚-氯仿-異戊醇混合液與pbs緩衝液的體積比為5:3。

通常洗滌3～5次沉澱即可洗至基本無色，重懸菌液可用無菌水或各種常用的緩衝液，如pbs緩衝液，tris緩衝液等。

優選地，上述需離心的各步驟中，離心轉速為12000rpm，離心時間為2～5min。

若環境中的總細菌較少，或為了提高本發明方法的檢測靈敏度，可在步驟(2)移取上層後向下層樣品(主要是有機相)中再加入pbs緩衝液，混勻，離心，移取上清備用；此步驟可再重複1～2次；合併前面移取的上層，然後進行步驟(3)及後面的操作。

本發明方法利用特定配比的有機溶劑、水或緩衝液將細菌從環境樣品中提取出來，再通過洗滌進一步純化，可用於快速高效地提取純化環境樣品中的總細菌，繼而用於pcr檢測。

環境中的總細菌既包括革蘭氏陰性菌，又包括革蘭氏陽性菌，二者的主要區別在於細胞壁。革蘭氏陽性菌不能通過熱裂解來直接進行菌落pcr檢測，還需要用蛋白酶對細胞壁進行破壁，析出細菌dna，再進行pcr檢測，類似於傳統pcr檢測方法。本發明提取純化的總細菌中，雖含有革蘭氏陽性菌，但在後續pcr實驗過程中，不引入其他的裂解步驟，革蘭氏陽性菌的存在對革蘭氏陰性菌的菌落pcr檢測方法並無影響。所以，本發明方法特別適合用於環境樣品中的革蘭氏陰性菌的pcr檢測。

本發明通過特定的引物設計，檢測重複性好，靈敏高，特異性好。

附圖說明

圖1苯酚-氯仿-異戊醇濃度篩選實驗結果圖

圖2墊草中副豬嗜血桿菌菌落pcr檢測圖

具體實施方式

下面以具體實施例的方式對本發明進一步進行說明，但不應理解為對本發明的限制。

材料與試劑

(1)所用菌株

致病性副豬嗜血桿菌，西南民族大學張斌副教授贈送。

(2)主要試劑

2×pcrmix、marker、苯酚、氯仿、異戊醇、pbs緩衝液，pvpp等，均購自tiangen公司；細菌總dna提取試劑盒(用於墊草中細菌dna提取)試劑盒購自omega公司，其他試劑均為分析純。

(3)引物：

表1引物序列表

由英駿生物技術有限公司合成。

實施例1苯酚-氯仿-異戊醇混合液配比的篩選

1材料：

待檢細菌：副豬嗜血桿菌；載體：墊草。

2實驗方法：

實驗組共有7組，苯酚-氯仿-異戊醇配比(體積比)分別為：第1組0:24:1；第2組25:96:4；第3組50:72:3；第4組25:24:1；第5組：75:48:2；第6組為100:24:1；第7組為100:0:0。各組菌採用相同的細菌起始濃度，3×106cfu/g。

將待檢細菌加入墊草中，然後用本發明方法從混有細菌的墊草中將細菌提取純化出來，進行菌落pcr檢測。以空白樣品為陰性對照(第9組)，同時採用相應dna提取試劑盒為陽性對照(第8組)。

具體過程為：稱取0.1g墊草於1mlep管中，加入300μlpbs緩衝液(ph7.2～7.4，nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l)，渦旋混勻，加入苯酚-氯仿-異戊醇500ml，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層於另一乾淨滅菌ep管中。再加入300μlpbs緩衝液，渦旋混勻，12000rpm離心2～5min，移取上層於上次的ep管中，重複一次上述操作，合併三次的上層。將合併的菌液(上層)12000rpm離心5min，棄上清。將沉澱用500μltenpp緩衝液(20mmol/ledta，50mmol/ltris,1％pvpp，100mmol/lnacl，ph10.0)洗滌3～5次至上清基本無色。用50μlddh2o重懸菌液。取此菌液1μl進行後續pcr檢測。

pcr反應體系及條件：

反應體系(25μl)：2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下遊引物各1μl，用ddh2o補足至25μl。反應條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30個循環；72℃10min。

凝膠電泳檢測：

pcr產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3實驗結果

如圖1所示(lane1-7分別為酚-氯仿-異戊醇提取第1～7組，lanem為marker,lane8為陽性對照，lane9為陰性對照)，第4、5、6、7組和陽性對照組都能檢出布氏桿菌的條帶，第7組為單純苯酚組，苯酚具有一定的親水性，不能很好地將水相與有機相分離，萃取操作時，分界不明顯，會造成二次操作，特別麻煩，所以苯酚-氯仿-異戊醇三者的配比為25:24:1～100:24:1較為合適。

實施例2pcr擴增及凝膠電泳法檢測養殖場環境樣品中提取純化的病原菌

1.材料：

1.1所用菌株：致病性豬副豬嗜血桿菌。

1.2環境載體：墊草。

1.2引物，見表1：

2、方法：

2.1pcr反應體系及條件

反應體系(25μl):2×pcrmix12.5μl，模板1μl，上、下遊引物各1μl，用ddh2o補足至25μl。反應條件:94℃5min；94℃30s，55℃30s(布氏桿菌採用60℃30s)，72℃1min，共30個循環；72℃10min。

2.2凝膠電泳檢測

pcr產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4本發明方法提取純化病原菌用於pcr檢測的有效性和敏感性試驗

將副豬嗜血桿菌新鮮菌液分別計數後進行10倍系列稀釋，取1×100，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7稀釋度各10μl加入0.1g墊草中，用本發明實施例1的方法提取純化總細菌，並檢測pcr敏感性。以空白樣品為陰性對照，同時採用相應dna提取試劑盒為陽性對照，對比本發明方法的有效性和敏感性。

2.結果

如圖2所示，本方法能從墊草樣品中提取出副豬嗜血桿菌，完成菌落pcr檢測。

lanem為marker，marker條帶從上到下為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。lane1-5為採用本發明方法進行pcr的檢測結果，lane6-10為採用標準dna提取試劑盒提取dna後進行pcr的檢測結果。其中，lane1和lane6的墊草中副豬嗜血桿菌濃度為1×106cfu/g，lane1-5為依次10倍濃度稀釋，lane5和lane10為100cfu/g。

圖2結果表明，本發明方法能從環境樣品中提取檢測到副豬嗜血桿菌的濃度下限為1×104cfu/g，和市售dna提取試劑盒檢測結果相當。

上述表明，本發明方法簡化了pcr檢測的前處理步驟，省去了繁瑣的dna提取步驟，直接用本方法處理得到的稀釋菌液或菌落為模板，以特定序列的引物對進行pcr擴增，重複性好，靈敏高，特異性好，檢測時間短，節省人力物力，大大降低了檢測成本。

sequencelisting

四川省畜牧科學研究院

一種從環境樣品中提取純化和檢測副豬嗜血桿菌的方法

2

patentinversion3.5

1

20

dna

上遊引物

1

gtgatgaggaagggtggtgt20

2

18

dna

下遊引物

2

ggcttcgtcaccctctgt18