一種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條、其製備方法及其應用的製作方法
2023-05-14 07:38:36
專利名稱：一種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條、其製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條、其製備方 法及其應用，屬於生物檢測領域。
背景技術：
流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)簡稱乙腦，是由嗜神 經的乙腦病毒(JEV)所致的中樞神經系統性傳染病[1] .JEV屬包 膜病毒科黃病毒屬，呈球型，直徑20 30nm,核心含單股RNA，有 衣殼，有三個結構蛋白，即E蛋白、核蛋白C和膜蛋白M.E蛋白為 糖蛋白，包裹在病毒的表面，它決定著病毒的毒力及其宿主範圍，不 僅在與宿主細胞受體結合及隨後的膜融合中發揮重要作用，而且可刺 激產生中和抗體在免疫保護方面起著主要作用。其典型特徵為高熱頭 痛，隨後出現一系列腦症狀及腦膜刺激症。病死率一般在10-30%之 間，有相當一部分留有後遺症。
研究結果顯示，E蛋白是乙腦病人血清IgG識別的主要蛋白。目 前認為E蛋白空間結構共分三個部分，其中結構域III獨立地在病毒表 面摺疊，存在著乙腦病毒的主要中和抗原表位。因此通過基因工程獲 得該區域的表達蛋白，並用其作為抗原檢測乙腦病毒的特異性抗體。
目前乙腦傳統的檢測方法是病毒分離，用C6/36細胞分離病毒； 小鼠腦內接種。鑑定乙腦病毒的血清學方法中，中和試驗、補體結合 試驗及凝酶抑制試驗是第一代方法，第二代有免疫螢光方法。
抗體檢測中主要有以下幾種(一)特異性lgM檢測乙腦病毒感 染髮病早期即產生特異性lgM ,病後2 3周達到高峰，故單份血清 可做出早期診斷。可使用①lgM捕捉ELISA法；②2ME-NI法，
血凝抑制抗體存在於lgM及lgG中，將早期單份血清分成二份， 一份 用2巰基乙醇(2ME)處理，以破壞lgM ，另一份不處理，然後同時做 HI試驗，若處理血清抗體滴度比未處理的下降>4倍，則為lgM陽 性；③微量間接免疫螢光法，用螢光素標記的抗u鏈血清，檢測已 與細胞抗原片結合的lgM，根據特異性螢光顆粒，判斷血清標本中的 lgM存在。
(二)常規血清學試驗l.血凝抑制試驗對乙腦診斷而言，本法特 異性較低，但敏感性高，簡便易行。2.補體結合試驗補體結合抗體 僅存在於lgG中，病後出現遲，消失快，適用於診斷近期感染。3.中 和試驗抗體存在於lgG、 lgM中，出現早，維持久。中和試驗特異性 和敏感性都高，但操作繁雜，需用大量動物或組織培養管，需時較久， 不適於臨床診斷常規使用，而在血清學流行病學調查和病毒鑑定上有 價值。
膠體金免疫層析法(Immunochromatography Assay )始於上世糹已 90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎上發展起來的。它是免疫親和技 術、印跡技術、免疫標記技術和層析技術的組合。將包被抗原、膠體 金標記抗體固相化，與樣本吸附材料等組合在一起，製備為免疫層析 診斷試條/板，使用時只需要把試紙條下插入樣本溶液，數分鐘就可 以判斷結果。與免疫滲濾法比較，穩定性好，操作更簡便、快速，且 由於為試條/試板形式，無需低溫保存，儲運方便。
針對乙腦的流行現狀和防治要求，對於乙腦的診斷，不但要求高 的特異性和敏感性的試劑，還需要快速、簡便、易於基層醫療和衛生 單位使用的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種使用方便、快捷，用於檢測乙腦病毒特 異性抗體的試紙條，檢測感染患者標本中乙腦病毒特異性IgM抗體， 用於人乙腦病毒感染的輔助診斷。
本發明的另 一 目的是提供一種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試 紙條的製備方法。
本發明的再 一 目的是提供 一 種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試 紙條在檢測檢測乙腦病毒IgM抗體中的應用。
本發明的一種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條，其包含 包被乙腦病毒E基因抗原域m和二抗IgG兩個條帶的硝酸纖維膜;及 含有膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體的玻璃纖維膜。
所述的二抗IgG為抗鼠IgG抗體。
所述抗鼠IgG抗體的濃度為2mg/ml。
所述硝酸纖維膜中乙腦病毒E基因抗原域m的濃度3.2 mg/ml。
所述玻璃纖維膜中膠體金標記抗人IgM的最適pH值為7.6-8.0，， 膠體金和抗體的配比為以20 24叱/ml膠體金。
本發明所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條，還包括反 應支持物、金標抗體保護膜和吸水墊，所述反應支持物上依次相互搭 接粘貼的金標抗體保護膜、玻璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
反應支持物優選PVC板；吸水墊優選濾油紙；金標抗體保護膜 同時具有吸水功能，優選用聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
本發明所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條的製備方法， 包括以下步驟
1) 製備乙腦病毒E基因抗原域III;
2) 硝酸纖維膜的製備將乙腦病毒E基因抗原域III稀釋成 3.2mg/ml,將抗鼠lgG抗體稀釋成2mg/ml，噴於硝酸纖維膜上，分別 形成檢測線和對照線，且於37。C中乾燥2小時，備用；
3) 玻璃纖維膜的製備膠體金標記的抗體的pH值為7.6 8.0，膠 體金和抗體的配比為20 24[ig/ml膠體金，經穩定劑(含0.05。/。BSA， pH8.0， O.OlMTris緩衝液)處理後，按每平方釐米65(il的量均勻吸附 於玻璃纖維膜上，冷凍乾燥，備用；
4)最後在反應支持物上依次相互搭接粘貼金標抗體保護膜、玻 璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
本發明所述乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條在檢測檢測乙 腦病毒IgM抗體中的應用。
本發明釆用純化的乙腦病毒E基因抗原域m和抗鼠IgG分別固相 於硝酸纖維膜上(NC膜)，結合膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體， 應用膜層析間接夾心法的原理檢測人標本中的乙腦病毒IgM抗體。
本發明的試紙條利用膠體金標記技術和膜層析技術，用於快速定 性半定量檢測樣本中可能存在的乙腦病毒特異性IgM抗體，達到快速
篩檢病人，及時診斷治療的目的。可節省大量人力物力，方便、快速、 簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單， 易於推廣，適合基層，適合於現場檢測和早期診斷，對乙腦病毒的感 染診斷起到輔助作用。
圖lA為本發明所述乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條的正面 示意圖1B為本發明所述乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條的側面 示意圖。
其中1吸水墊；2硝酸纖維膜(T:乙腦病毒E基因抗原域III; C:包被抗乙腦病毒多克隆抗體的質控條帶)；3含有膠體金標記的抗 人IgM單克隆抗體的玻璃纖維膜；4金標抗體保護膜；5反應支持物。
圖2為檢測試紙條檢測結果示意圖。
從左至右依次為T、 C兩條線陽性；C一條線陰性；T、 C兩條 線陰性，無效。
具體實施例方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟
知的常規手段。
實施例l乙腦病毒E基因抗原域III的製備
(1) 目的基因的獲得
根據目的基因片段序列及pGEX-4T-1表達載體的特點設計兩端含
有限制性內協酶BamHl 、 HindIII酶切位點的引物
5 ' TAAGGATCCCACCTGAAATGTAGGCTG 3' 5 ， CGGGAAGCTTGAAGACCCCTCCAATAGA 3， 用常規方法提出病毒總RNA,然後，立即進行RT-PCR,反轉錄
產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收。
(2) 目的基因的克隆和陽性重組子的篩選 將回收的PCR擴增產物與PMD-18T克隆載體16'C過夜連接後，轉
化到DH5a感受態細胞中，挑取單克隆菌株，37'C過夜培養，提取質 粒後，以質粒為模板進行PCR鑑定陽性克隆菌株，測定序列。
(3) 融合表達載體的構建
用限制性內切酶BamHl、 HindIII分別酶切T/EIII和pGEX-4T-l, 1 %瓊脂糖電泳切膠回收目的片段和pGEX-4T- l雙酶切後的大片段，用 T4連接酶將兩者16t:過夜連接，連接產物轉入BL21感受態細胞，LB 固體培養基培養10 12小時，挑取單菌落培養過夜後提取質粒，用PCR 及限制性內切酶雙酶切分別鑑定，PCR產物和酶切產物用1 %瓊脂糖 電泳進行分析，篩選陽性克隆，將重組的質粒測序。
(4) pGEX-EIII融合蛋白的誘導表達 篩選出的陽性克隆菌在LB培養基中搖菌培養過夜後，將過夜菌
按照l: 100的比例接種至1000mlLB液體培養基中，37。C搖床培養。 基因轉化菌在接種後2小時為最佳誘導時機(OD600nm 0.5), IPTG濃 度0.6mmol/L, 29。C誘導8小時，目的蛋白存在於細胞裂解液上清中。
(5) pGEX-EIII融合蛋白的純化、鑑定
將(4)中1000ml菌液12000r/m、 4。C離心，棄上清，將菌體用細
胞裂解液裂解，使用含有GST標籤的親和層析柱子純化融合蛋白用
GST-融合蛋白純化試劑盒(B-PER細菌GST標籤融合蛋白柱式純化 Kit貨號78200賽默飛世爾科技)，按試劑盒推薦步驟和體系進行 純化，純化產物進行SDS-PAGE電泳以判斷純化效果，通過紫外薄層 測得產率在95%以上。
融合蛋白的Western-Blot鑑定
切取一半膠用BioRad公司生產的半乾電轉儀轉於硝酸纖維素膜 上，進行印跡試驗， 一抗為乙腦病毒單抗(北京博奧森生物技術有限 公司)，TMB顯色後，結果有特異性蛋白條帶出現。 實施例2乙腦病毒IgM抗體膠體金快速檢測試紙條(參見圖1)
(1) 膠體金-抗體結合物的製備
經實驗確定，抗人IgM單克隆抗體膠體標記的其最佳結合pH值 為8.0，膠體金和抗體的配比為18嗎/ml膠體金。標記膠體金經穩定劑 (含0,5。/。BSA， pH8.0, O.OlMTris緩衝液)處理後，按每平方釐米65ji1 的量，取膠體金-抗體結合物溶液，均勻吸附於玻璃纖維上，冷凍幹 燥，並在乾燥環境中保存。
(2) 包被抗原於硝酸纖維膜 將乙腦病毒E基因抗原域III蛋白用0.01MPBS稀釋成3.2 ±
0.1mg/ml。將抗鼠IgG多克隆抗體用0.01MPBS稀釋成2 ± 0.1mg/ml。 用噴膜機將二者以lpl/cm的速度噴於硝酸纖維膜上，分別形成檢測線 和對照線。兩條線之間的間隔為0.5cm。
把固定有抗體的硝酸纖維置37'C烤箱中乾燥2小時。乾燥環境中 保存備用。
(3 )乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條
反應支持物5為6. 5cm x 0.4cmPCV板；吸水墊1為2cm x 0.4cm 的濾油紙；1.8cmx0.4cm的硝酸纖維膜2依次包被抗鼠IgG，乙腦病 毒E基因抗原域III;含有0.4cm x 0.4cm膠體金標記的抗人IgM的單
克隆抗體玻璃纖維膜3;金標抗體保護膜4為2.7cm x 0.4cm的玻璃 纖維；即形成了乙腦病毒IgM抗體膠體金快速檢測試紙條。 (4)乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條特異性及敏感度
特異性檢測用乙腦病毒IgM抗體檢測試紙條檢測5份IgM陽 性血清(包括流感、肺炎支原體、麻麥、風瘮、呼吸道合胞病毒)，5 份健康人血清，5份B肝、C肝及上呼吸道感染患者的血清樣品，檢 測結果均為陰性，表明本產品是特異的。
敏感度檢測用乙腦全病毒ELISA酶標板篩選IgM陽性的乙腦 患者血清，然後用中和實驗對血清的IgM滴度進行標定。用生理鹽 水對10份不同滴度的血清進行倍比稀釋，然後用乙腦病毒IgM抗體 檢測試紙條檢測，結果表明，不同患者的血清能夠檢測出的最低稀釋 度不同，其IgM抗體的最低滴度為1: 10 20。 實施例3檢測方法(參見圖2)
將患者全血、血漿或血清標本100-150^1直接滴加入實施例2試 紙條"4"處，樣品液沿膜上行，10 15分鐘判讀結果。
結果
如檢測樣本中含有乙腦病毒IgM抗體，則與試紙條上膠體金標 記的抗人IgM單克隆抗體形成相應的複合物，上行與包被在硝酸纖 維膜上的乙腦病毒特異性抗原結合，形成紅色線條，即在T處形成 紅色條帶。
無論標本中是否含有相應的抗體，膠體金標記的抗人IgM單克隆 抗體繼續向上爬行與包被在膜上的抗鼠IgG形成紅色沉澱線，即在 "C"處形成紅色條帶。此線是質控線，如膠體金失效，此線就不會 出現，說明試紙條失效。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳 盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本 領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎 上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
序列表
<110〉北京莊笛浩禾生物醫學科技有限公司
—種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條、其製備方法及其應用
2
Patentln version 3. 3
1
27
醒 <213〉人工序列
〈400〉 1
taaggatccc acctgaaatg taggctg 27
2
28
<212〉 醒 人工序列
2
cgggaagctt gaagacccct ccaataga 28
權利要求
1.一種乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條，其特徵在於，其包含包被乙腦病毒E基因抗原域III和二抗IgG兩個條帶的硝酸纖維膜(2)；及含有膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體的玻璃纖維膜(3)。
2、 根據權利要求1所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條， 其特徵在於，所述的二抗IgG為抗鼠IgG抗體。
3、 根據權利要求2所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條， 其特徵在於，所述抗鼠IgG抗體的濃度為2mg/ml。
4、 根據權利要求1-3任意一項所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金 檢測試紙條，其特徵在於，所述乙腦病毒E基因抗原域III的濃度為 3.2mg/ml。
5、 根據權利要求l-4任意一項所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金 檢測試紙條，其特徵在於，所述玻璃纖維膜中膠體金標記的抗人IgM 的pH值為7.6-8.0，膠體金和抗體的配比為20 24嗎/ml膠體金。
6、 根據權利要求1-5任意一項所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金 檢測試紙條，其特徵在於，還包括反應支持物(5)、金標抗體保護膜(4)和吸水墊(1)，所述反應支持物(5)上依次相互搭接粘貼的金 標抗體保護膜(4 )、玻璃纖維膜(3 )、硝酸纖維膜(2 )和吸水墊(1 )。
7、 一種製備權利要求6所述的乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試 紙條的方法，包括以下步驟1) 製備乙腦病毒E基因抗原域III;2) 硝酸纖維膜的製備將乙腦病毒E基因抗原域III稀釋成 3.2mg/ml，將抗鼠lgG抗體稀釋成2mg/ml，噴於硝酸纖維膜上，分別 形成檢測線和對照線，且於37。C中乾燥2小時，備用；3) 玻璃纖維膜的製備膠體金標記的抗體的pH值為7.6 8.0，膠 體金和抗體的配比為20 24嗎蛋白/ml膠體金，按每平方釐米65[il的量 均勻吸附於玻璃纖維膜上，冷凍乾燥，備用； 4)最後在反應支持物上依次相互搭接粘貼金標抗體保護膜、玻 璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊。
8 、權利要求1 -7任意 一 項所述乙腦病毒IgM抗體膠體金檢測試紙條在檢測乙腦病毒IgM抗體中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種用於檢測乙腦病毒IgM抗體的快速檢測試紙條。它是在硝酸纖維膜(NC膜)上包被乙腦病毒E基因抗原域III和二抗IgG，結合膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體，應用膜層析間接夾心法，檢測感染人標本中乙腦病毒特異性IgM抗體。應用本發明試紙條檢測，操作簡單、方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單，易於推廣，適合基層，適合於現場檢測和早期診斷，對乙腦病毒感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/577GK101363866SQ200810112729
公開日2009年2月11日 申請日期2008年5月26日 優先權日2008年5月26日
發明者明 劉 申請人:北京莊笛浩禾生物醫學科技有限公司