醯化蛋白凝聚物及其用來減少免疫測定中的幹擾的用途的製作方法

2023-05-14 10:42:26 2

專利名稱：醯化蛋白凝聚物及其用來減少免疫測定中的幹擾的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醯化蛋白凝聚物、其製備方法、及其用作免疫測定法減幹擾劑和結合劑，以及用來減少免疫測定中的幹擾的用途以及相應的免疫檢測方法。
免疫檢測方法近年來變得十分重要。它們用來以快速和準確的方式檢測生物樣品中藥物、激素、蛋白、尤其傳染性生物的存在。在所有免疫檢測方法中，都是在第一特定結合配偶體，即待檢測物質(被分析物或配體)，和專一地與該配體反應並與之結合的第二特定結合配偶體之間有一種特定結合反應。配體和與該配體結合的特定配偶體形成一個特定結合對，一般是抗原和抗體或抗體片斷之間的配合物。在每個反應中可能有不止一種配體或一種結合配偶體彼此反應。這些特定結合反應是用不同方式檢測的。一般來說，該特定結合反應的一種參與者是有標記的。普通標記方法使用放射性同位素、色原、螢光團或酶標記。在非均相免疫測定中，結合配偶體之一被固定在固相上。
免疫測定中的一個難題是，在免疫測定的特定結合配偶體和樣品、樣品中所含附加成分與(可能)固相之間可能有所不希望的相互作用和非特定結合反應。這些相互作用一般導致背景信號增強和這些信號的較高散射，進而降低該測試的靈敏度和專一性。與標記結合配偶體的非特定相互作用也可能導致假陽性結果，這意味著甚至當一種被分析物不存在時也錯誤地記錄這樣一種被分析物的存在。
為了減少免疫測定中的這些非特定相互作用，已經進行了各種嘗試。一些時間以來已經知道，各種碳水化合物成分和各種蛋白質、蛋白質混合物或蛋白質部分以及它們的水解產物能減少免疫測定中測試成分與被分析物之間的非特定相互作用(例如，Robertson等人，Journal of Immun.Meth.26，1985，EP-A-260903，US-A-4，931，385)。使用蛋白質原部分和原水解產物的缺點是，其中所含的汙染也可能導致該測試中的幹擾。此外，用酶法產生的水解產物也可能受到用於其製造的蛋白酶汙染。它們的質量也往往不均勻，因為裂解步驟是非常難以控制的。蛋白酶汙染物會攻擊測試成分，甚至少許數量也會對該測試的性能及其穩定性產生不利影響。
EP-A-0331068描述了使用聚合免疫球蛋白(IgG)來減少特定幹擾因子，如類風溼因子。然而，非特定相互作用，尤其是標記結合配偶體和被分析物或固相之間的非特定相互作用，無法以一種令人滿意的方式消除。此外，人體和動物IgG的產生是複雜和昂貴的。
為了減少免疫測定中的非特定相互作用，也已有人描述了化學改性蛋白、尤其琥珀醯化蛋白的使用(US-A-5,051,356,EP-A-525916)。然而，尤其在高分子被分析物如病毒抗原的測試中，先有技術儘管減幹擾物質的濃度非常高，也不能確保令人滿意地減少幹擾。
因此，本發明的一個目的是提供新型減幹擾物質和/或減幹擾劑，它們與從先有技術已知的那些相比，改善了免疫測定中幹擾的消除。本發明尤其旨在提供能產生低空白值、減少信號散射、尤其當分析高分子被分析物時避免假陽性結果的減幹擾物質。
這個目的是藉助於專門醯化的蛋白凝聚物實現的。
本發明的主題是作為免疫測定法減幹擾物質、用-CO-R基團醯化的蛋白凝聚物，式中R是一個支化或非支化C1-C4烷基，可以有羧基、羥基、SO3H或PO3H2基團取代。
本發明的另一個主題是一種相應的免疫測定用減幹擾劑，包括一種含蛋白的減幹擾物質和一種緩衝劑，其特徵是它含有按照本發明的一種或若干種醯化蛋白凝聚物。
本發明的又一個主題是一種免疫測定用特定結合試劑，包括一個特定結合對中的一種配偶體，其特徵是它還含有按照本發明的一種或若干種減幹擾物質或減幹擾劑。
本發明的又一個主題是一種通過讓本發明的減幹擾物質或減幹擾劑與用於免疫測定的一個特定結合對的特定結合配偶體接觸而減少免疫測定中非特定相互作用的方法。
本發明的一個具體主題是一種在減少非特定相互作用的同時測定樣品中免疫配體的方法，它藉助於1)讓該配體的待測樣品接觸a)一種或若干種減幹擾物質，或者一種或若干種含有減幹擾物質和適當緩衝劑的減幹擾劑，和b)特定結合對的一種或若干種特定結合配偶體，其中至少一種結合配偶體是有標記的，形成一種可檢測結合對；2)測定標記結合對的存在或數量或一種特定結合對的自由標記結合配偶體，作為樣品中配體存在或數量的量度，其特徵在於該減幹擾物質是一種用CO-R基團醯化的蛋白凝聚物，式中R是一個支化或非支化C1-C4烷基，可以有羧基、羥基、SO3H或PO3H2基團取代。
配體是一種能與一種或若干種對應特定結合配偶體發生特定反應生成配合物的化學物質或生物物質。實例包括蛋白、肽、碳水化合物、毒素、半抗原、藥物、病毒、真菌和細菌，它們的抗體或成分。本發明尤其適用於分析高分子配體，例如病毒、病毒標記，但也適用於分析激素，尤其多價蛋白，如HIV病毒、前列腺特有抗原(PSA)、促甲狀腺激素(TSH)、癌胚抗原(CEA)、B型肝炎病毒(B型肝炎表面抗原，HBs)、α-胚蛋白(AFP)、人體絨膜促性腺激素(HCG)、促黃體激素(LH)、促濾泡激素(FSH)、促乳素、鐵蛋白、胰島素。
樣品一般是體液，如血液、血清、或血漿，唾液，尿，或其它體液。
特定結合配偶體可以是能與另一種生物物質發生特定反應而形成特定結合對的任何一種生物結合配偶體或化學結合配偶體。它們包括抗體、抗體片段、抗原、半抗原、激素、抗生物素蛋白、生物素，或它們的衍生物。在本發明中，特定結合對的較好配偶體是能與抗原特定結合的抗體或抗體片斷。
免疫測定中特定結合配偶體的至少一種是有標記的。這種標記可以諸如通過放射性、化學發光、磷光、螢光、或電化學發光或一種可見顏色，直接或間接提供一種可測信號。特定結合配偶體也可以是間接可檢測的，例如成為一種酶標記、生物素或抗生物素蛋白標記，它們參與一個或若干個反應，以產生一種可檢測物質。酶標記較好，特別是過氧化酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶或鹼性磷酸酯酶。另一種較好的標記是有化學發光、尤其電化學發光分子的標記。
本發明的特徵在於減幹擾物質是用CO-R基團醯化的蛋白凝聚物。蛋白凝聚物要理解成這樣一種凝聚物，其中相同或不同界定的蛋白單體聚合形成一種高分子顆粒。所謂界定，具體地說，就是把一種蛋白凝聚物理解成一種由至少2個、較好3～40,000個、尤其好的是30～600個蛋白單體組成的人造顆粒。它們以一種使之在水溶液中不會分解成單個分子的緊密方式相互結合。一種較好的方式是，這種蛋白凝聚物可溶於水。
蛋白質的聚合和凝聚可以用加熱方法或化學方法進行。
在熱聚合方法中，通過施加較高溫度，使蛋白單體結合成凝聚物。蛋白質的熱聚合詳見EP-A-269092，用白蛋白作為實例。
蛋白單體的化學聚合是用不含蛋白的均質或非均質雙官能連接物分子進行的。這些蛋白的連接方法是專家們已知的，例如詳見，GB-A-1505400，EP-A-0122209或EP-A-269092。蛋白單體與非均質雙官能連接物連接的實例是與下列物質的反應二(順丁烯二醯亞胺基)甲酯，辛二亞胺酸二甲酯，辛二酸二琥珀醯亞胺酯，戊二醛，3-(2-吡啶基連硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯，N-(5-疊氨基-2-硝基苯甲醯)琥珀醯亞胺，4-(碘乙醯胺基)苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯，或者順丁烯二醯亞胺基-己醯-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MHS)或順丁烯二醯亞胺基-苯甲醯-NHS(MBS)和3-乙醯硫代丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SATP)的組合。均質雙官能連接物的實例包括二氨基己烷、碳化二亞胺及其它。
較好的蛋白質是分子量在2000以上、尤其在10,000以上的蛋白。尤其好的是白蛋白或卵白蛋白，特別是血清白蛋白，甚至更好的是牛血清白蛋白。
一種較好的方式是，本發明的方法使用以熱步驟結合成凝聚物的蛋白聚合物。尤其好的是發生了熱聚合、然後醯化、尤其是乙醯化或琥珀醯化的白蛋白，較好是血清白蛋白，特別是牛血清白蛋白(Thermo-RSA)。一種非醯化熱聚牛血清白蛋白詳見EP-A269092。
較好是，聚合要進行和控制得能產生具有某種大致均勻粒度的聚合蛋白凝聚物顆粒。較好是粒度為10～200nm，尤其好的是20～50nm。這對應於分子量為240,000Da～2.2×109Da，尤其好的2.2×106～35×106Da。粒度可以用人所共知的方法如PCS(光子修正光譜法)測定。如有必要，特別適合於本發明的粒度範圍可採用凝膠過濾法從一種粗聚合產物混合物分離，以期獲得一種特別均勻的粒度。
用於聚合的蛋白單體既可以相同也可以不同。較好是使均勻蛋白單體聚合。較好用白蛋白單體作為蛋白單體。可用的白蛋白單體是所有動物或人體白蛋白，特別是血清白蛋白。牛血清白蛋白(BAS)特別適用於本發明。
按照本發明，蛋白凝聚物是用CO-R基團醯化的，式中R是一個支化或非支化的C1-C4烷基基團，可以有羧基、羥基、PO3H2或SO3H取代。特別好的取代基是羧基基團。
醯基基團既可以引進到蛋白單體中，也可以在蛋白單體聚合之後引進到蛋白凝聚物中。蛋白質的醯化是按照已知方法、較好用醯基酐或醯基-O-琥珀醯亞胺進行。乙醯化或琥珀醯化的蛋白凝聚物已經證明是特別有利的，尤其是白蛋白凝聚物(R＝甲基和/或CH1-CH2-COOH)。較好用乙酸-O-琥珀醯亞胺進行乙醯化。較好用琥珀酸酐進行琥珀醯化。
在醯化過程中，使蛋白凝聚物上基本上自由的氨基基團(如細胞溶素殘部)醯化。醯化蛋白凝聚物這一術語係指所存在的自由氨基基團中至少一個被醯化。然而，較好是所有自由氨基基團幾乎完全醯化。
本發明的另一個主題是一種用於免疫試驗中減少幹擾的藥劑，其中包含一種免疫試驗用緩衝劑和按照本發明用於減少幹擾的物質。可能的緩衝劑是通常用於免疫測定的所有含水緩衝劑，包括磷酸鹽、甘氨酸-HCl、或甘氨酸-NaOH、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽或有機緩衝劑，如咪唑/HCl；三乙醇胺；MES＝(4-嗎啉代乙磺酸)，TRIS＝(三(羥甲基)-氨基甲烷)，HEPES＝(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，MOPS＝(3-N-嗎啉代-丙磺酸)及其它類似緩衝劑。這些緩衝劑鹽的pH和濃度取決於所涉及的免疫測定，例如，也取決於酶標記所用的酶。通常，pH值範圍在4和9之間。常用緩衝劑濃度是在1mM和1M之間。
減幹擾物質的濃度取決於免疫測試成分的數量及其中所含的、要與減少所述幹擾的藥劑接觸的幹擾成分。在普通免疫測定中，減幹擾劑中減幹擾物質的濃度應當如此之高，以致在與免疫測試成分接觸之後其濃度仍在1mg/ml和50mg/ml之間，較好在5mg/ml和20mg/ml之間。在個別情況下，高達200mg/ml的濃度也可能是必要的。
此外，本發明的減幹擾劑也可以含有防腐劑等附加物質。為了用於免疫測定，這些減幹擾劑較好存在於一種緩衝劑水溶液中。進而，也可以用它來浸漬諸如試條上的多孔載體材料(羊毛)，並將其以諸如作為一種凍乾物的固體形式貯存。
本發明的另一個主題是一種特定免疫結合試劑，其中有一個特定結合對的一種配偶體，和按照本發明的減幹擾物質或減幹擾劑。
按照本發明，結合試劑是使免疫測定的一種或若干種特定結合配偶體與按照本發明的至少一種減幹擾物質或減幹擾劑一起混合而得到的。任選地，可以添加防腐劑或穩定劑等添加劑。特定結合配偶體的數量取決於所使用的免疫測定、所要結合的配偶體數量、所使用的標記類型及其它因素。一般來說，濃度範圍為1～20μg/ml。
減幹擾物質的數量取決於免疫測定的測試成分數量和結合試劑中所含的要與該結合試劑接觸的幹擾成分數量。較好的是，結合試劑中減幹擾物質的濃度應當足夠高，使得在與免疫測試成分接觸之後其總濃度為1～50mg/ml、較好為5～20mg/ml。也有可能，在一些個別情況下，高達200mg/ml的濃度是有效減少幹擾所需要的。
特定結合試劑可用於任何一種均相或非均相的、可利用一種特定結合配偶體檢測一種特定結合配體的存在或不存在的免疫測定。實例包括夾層測定、競爭性免疫測定及專家已知的其它免疫測定。這些測試可以在溶液中或在固體載體上進行。一般來說，按照本發明的免疫測定是這樣進行的讓一種含有配體的樣品接觸按照本發明的溶液狀特定結合試劑。然後在配體和特定結合配偶體之間直接或間接生成一種特定結合配合物。然而，也有可能是，配體本身以按照本發明的一種結合試劑形式存在，然後使之接觸一種特定結合配偶體或接觸按照本發明的另一種結合試劑。配體和結合配偶體可以直接形成一種配合物。那麼，該結合配偶體對該配體是專一的。然而，也有可能該結合配偶體通過一個或若干個特定結合分子與該配體間接形成一種配合物，然後這些結合分子與該配體結合。
如果本方法是作為一種非均相免疫測定而在試管、微滴板或試驗載體等固體載體上進行的，則可以把該配體的一種特定結合配偶體直接固定在該載體上。然而，較好的是把該配體結合配偶體的一種特定結合配偶體固定在該載體上。較好的實例是作為生物素基化結合配偶體的一種特定結合試劑的固定抗生蛋白鏈菌素。這類非均相免疫測定的各種變種是專家已知的。
在競爭性免疫測定中，配體和標記的配體類似物爭奪非標記的配體結合配偶體，後者可以通過一個第二結合部位、較好是一個特定結合部位如生物素結合到固相上，如同非均相免疫測定中的情況那樣。自由態和結合態配體類似物的標記用來作為待測配體的存在或數量的一種量度。
在夾層免疫測定中，配體以第一特定結合部位結合到一個有標記的配體結合配偶體上，並以第二結合部位結合到一個無標記的配體結合配偶體上，後者對固相有另一個特定結合部位，如同非均相免疫測定中的情況那樣。然後，一種配合物在配體、標記和無標記結合配偶體之間形成。在非均相測試中，該配合物通過無標記結合配偶體結合到固相上，而且可以藉助於諸如洗滌與自由態標記結合配偶體分離。自由態或結合態標記配體結合配偶體是作為要按照已知方法測定的配體的存在或數量的量度而測定的。當使用酶標記時，把一種生色酶基質添加到標記種中，測定所產生的顏色。
一個特定免疫結合對的至少一種配偶體(配體，標記配體類似物，或配體結合配偶體)是以按照本發明的一種結合試劑形式存在的，並與按照本發明的減幹擾物質一起用於免疫測定。較好的是，這一般是一種配體結合配偶體，尤其是一種標記配體結合配偶體。
本發明的另一個主題是按照本發明的減幹擾物質在免疫測定中的應用。
本發明的一個具體主題是使用按照本發明的減幹擾物質減少免疫測定中的非特定相互作用。
經驗已經表明，按照本發明的減幹擾物質顯著減少了陰性樣品的假陽性信號，因而也減少了陽性樣品的空白值信號。此外，也減少了陽性樣品空白值的散射，從而也減少了測量值的標準偏差。這擴大了動態測定範圍，而且測定本身變得更靈敏也更精確。
此外，本發明的另一個主題是按照本發明的減幹擾物質的製備方法。其特徵在於，在第一步中，使一種蛋白、較好是白蛋白、尤其是牛血清白蛋白在與雙官能連接物的化學凝聚反應中凝聚；該化學凝聚反應較好是一種熱凝聚反應。較好的粒度範圍是10～200nm，尤其好的是20～50nm。熱凝聚較好是在50～100℃、尤其是在60～80℃的溫度進行。然後，在第二步中，藉助於一種適用醯化劑，進行-CO-R基團的醯化。醯化作用較好應當是徹底的，而且可以通過用諸如高效液相色譜法分析醯化劑的消耗情況進行監測。
然而，也可以把這個方法反過來進行，即先按照US-A-5，051，356使蛋白質醯化，然後進行醯化蛋白的熱與化學聚合。
實例1醯化熱聚BSA(牛血清白蛋白)減少空白值與幹擾的效果HBsAg(B型肝炎表面抗原)夾層免疫測定是用BoehringerMannheim公司製造的一種HBsAg Enzymuntest進行的。
a)不使用醯化熱聚BSA(牛血清白蛋白)的試驗有共軛物的溫育緩衝劑
40mol磷酸鹽緩衝劑pH7.0，抗HBsAg生物素(單克隆，小鼠)＞240ng/ml腖(乳白蛋白的水解產物)40mg/ml抗HBsAg-POD(單克隆，小鼠)，POD(過氧化酶)0.04U/ml基質/色原緩衝劑磷酸鹽/檸檬酸鹽緩衝劑100mmol/l，pH4.4；H2O23.2mmol/1；2，2′-連氮基-二[3-乙基苯並噻唑啉磺酸(6)]二銨鹽(ABTS)1.9mmol/l試驗是在Boehringer Mannheim公司製造的ES600儀器上進行的。
100μl樣品和500μl有共軛物的溫育緩衝劑注入塗布了抗生蛋白鏈菌素的試管(Enzymuntest，Boehringer Mannheim公司)中，溫育(180分鐘，37℃)。用200μl洗滌溶液洗滌，除去試管中未結合到固相上的標記抗體。
添加500μl基質/色原緩衝劑溶液，60分鐘後用分光光度計在422nm測定色度。
b)在不同實驗中，向溫育緩衝劑中添加「減幹擾劑」1.按照本發明的乙醯化熱聚-BSA(熱聚牛血清白蛋白)(2mg/ml，粒度30nm)2.按照本發明的琥珀醯化熱聚-BSA(2mg/ml，粒度30nm)3.按照先有技術的單體醯化BSA(2mg/ml)4.按照先有技術的單體琥珀醯化BSA(2mg/ml)。
表1顯示無(實例1a)和有不同溫育緩衝添加劑1-4(實例1b)時不同樣品的測定結果。當使用減幹擾劑(實例1b，1.和2.)時，測試結果的空白值顯著降低，而且與按照先有技術的其它添加劑相比，陰性血清的標準偏差也有所降低。
1b，1.和2.以及與按照先有技術的其它添加劑相比時陰性血清(NS)標準偏差的降低 實例2降低抗-HIV-P24試驗中的空白值用Boehringer Mannheim公司製造的EnzymuntestAnti-HIV進行夾層免疫測定。
有共軛物的溫育緩衝劑磷酸鹽緩衝劑40mmol/l；pH7.0生物素基化的牛血清成分HIV-P24抗體(300ng/ml)POD標記的多克隆抗HIV抗體(100mU/ml)醯化熱聚BSA，粒度30nm，2mg/ml，見表2第2欄。
基質緩衝劑磷酸鹽/檸檬酸鹽50mmol/l；pH4.4H2O21.6mmol/lABTS0.9mmol/l200μl樣品在抗生蛋白鏈菌素試管中用500μl溫育緩衝劑溫育4小時。樣品血清不含HIV-P24抗原。隨後，進行一個洗滌步驟，溶液再次用700μl基質緩衝劑溫育1小時。然後在422nm進行測定。結果列於表2中。
第1欄表示溫育緩衝劑中不添加醯化熱聚BSA時測定的假陽性值(μg/ml)；第2欄表示溫育緩衝劑中有醯化熱聚BSA時的測定值。第2欄表明，按照本發明的物質導致假陽性信號減少多達64％。
1.有共軛物的溫育緩衝劑磷酸鹽緩衝劑40mmol/l，pH7.3MABPSA小鼠-PR 12-Eab-POD70mU/mlMABPSA小鼠-PR 1-IgG-生物素1ng/ml在此溫育緩衝劑中添加各種減幹擾蛋白(表3中添加劑1，2a-C)。
2.基質緩衝劑磷酸鹽/檸檬酸鹽緩衝劑100mmol/l，pH4.4H2O23.2mmol/l色原ABTS1.9mmol/l用50μl樣品、700ml有共軛物的溫育緩衝劑(溫育時間90分鐘)、200ml洗滌溶液、700μl基質緩衝劑(溫育時間30分鐘)，按照實例1進行試驗。表3 關於表3的說明PS1～5PSA陽性人體血清(男性試驗對象)NS1～10PSA陰性人體血清(女性血清)添加劑1是一種亞綱特有IgG聚合物，作為按照EP—A—33062的一種減幹擾蛋白(抗PSA抗體多共軛物)，它與直接針對免疫成分的幹擾成分(抗體或抗體片斷共軛物)結合產生一個信號。在這個實例中，無法看到效應(見右欄「無添加劑1」中的對照)。
添加劑2a是不同濃度的按照本發明的減幹擾物質(乙醯化熱聚BSA聚合物，粒度30nm)。實驗表明，不添加添加劑2a時測到假陽性的女性血清(NS)中的幹擾，在濃度為0.1mg/ml時是特別有效的。動態測定範圍也因空白值(標準物質A)降低而大大改善，對信號無不良影響(標定曲線標準物質A-E)。
添加劑2b是用於固相、呈溶解形式的減幹擾蛋白聚合物(熱聚BSA)。這種溫育緩衝劑添加劑對無論是表中給出的實例(0.1mg/ml)還是0.2～1.6mg/ml的更高濃度下的幹擾信號都沒有顯示出任何影響。提高被分析物濃度(標準物質A-E)導致標定曲線變平。
添加劑2c按照先有技術的一種蛋白水解產物(乳白蛋白水解產物)。需要高濃度(5mg/ml)才能顯著減少幹擾。
實例4本實例是對應於實例3進行的；然而，溫育緩衝劑不含任何添加劑(表4中對照1)或濃度為0.35mg/ml、範圍為8nm～74nm的不同粒度的琥珀醯化熱聚BSA。
表4 注表中的T-BSA-SuCC表示琥珀醯化聚牛血清白蛋白實例5乙醯化熱凝聚牛血清白蛋白(乙醯化熱聚BSA)的製備1.熱凝聚BSA的製備1gBSA在100ml50mM磷酸鉀緩衝溶液(pH7.0)中加熱到70℃，並在這個溫度保持4小時。然後使溶液冷卻下來，過濾，並利用超離心機濃縮到5Dmg/ml(排斥極限30，000Da)。然後對30倍體積的再蒸餾水進行滲析，隨後凍幹。所得到的產品的分子量為大約700，000，粒度為30±8nm(用光子修正光譜法(PCS)測定)。
2.熱聚BSA的醯化4000g熱凝聚BSA在100mM磷酸鉀緩衝劑(pH8.0)中加熱到25℃。用OD280nm測定蛋白質濃度，然後調節蛋白質濃度為10mg/ml。如有必要，可使用10mM磷酸鉀緩衝劑(pH8.0)調節到正確值。把熱聚BSA溶液傾入攪拌容器中，並加熱到25℃。濃度為100mg/ml的乙酸羥基琥珀醯亞胺酯溶液在室溫溶於無水DMSO(二甲基亞碸)中。每升乙醯化熱聚BSA溶液添加11.5ml琥珀醯亞胺酯溶液。這樣得到的、DMSO中的最終濃度約為1％。在核查pH值(目標為6.5-9)之後，乙醯化混合物在25℃攪拌120分鐘。用TSK3000/HPLC(在260nm檢測)監測乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯的減少。溫育後，通過添加鹽酸賴氨酸溶液至最終濃度為5mM，使乙醯化過程停止。
停止的乙醯化反應通過壓濾機過濾。隨後用水洗滌壓濾機。然後將濾液和洗滌液合併。
合併的濾液通過一種聚碸膜10KD濃縮到50L。濃縮溶液對10倍體積20mM磷酸鉀溶液pH7.0進行滲濾(diafiltrated)。然後，用滲濾緩衝劑把濃縮液稀釋到2倍體積，然後再次濃縮到初始體積。通過TSK 3000 HPLC分析測定滲濾結果。把溶液濃縮到80±10mg/ml，隨後用0.1％氯乙醯胺和0.01％甲基異噻唑酮(MIT)穩定。
PCS測定給出粒度為30±15nm。
實例6化學聚合琥珀醯化牛血清白蛋白(P-BSA-Succ)的製備1.牛血清白蛋白(BSA)的聚合a)BSA用順丁烯二醯亞胺基己醯-N-羥基琥珀醯亞胺(MHS)活化3g BSA溶於30ml30mM磷酸鉀緩衝劑(pH7.1)中，添加0.6ml180mg MHS/ml二甲基亞碸(DMSO)溶液。在25℃溫育1小時後，溶液補加10mM賴氨酸，並對150倍體積滲析緩衝劑(15mM磷酸鉀緩衝劑/50mM NaCl/1mM乙二胺四乙酸鹽(EDTA/pH6.2)進行滲析。
b)BSA用S-乙醯硫代丙醯-N-羥基琥珀醯亞胺(SATP)活化3g BSA溶於30ml 30mM磷酸鉀緩衝劑中並添加0.6ml 140mgSATP/ml DMSO溶液。在25℃溫育1小時後溶液補加10mM賴氨酸，並對150倍體積滲析緩衝劑(15mM磷酸鉀緩衝劑/50mMNaCl/1mM EDTA/pH6.2)進行滲析。
c)活化BSA成分的聚合從(b)得到的含SATP活化BSA的溶液補加25mM羥胺，調到pH7.5，在25℃進行1小時溫育。隨後，添加從(a)得到的含MHS活化BSA的溶液，在25℃再繼續溫育45分鐘。添加10mM半胱氨酸使聚合終止。再過30分鐘後，溶液補加25mM N-甲基順丁烯二醯亞胺，對150倍體積50mM磷酸鉀緩衝劑/0.15M NaCl/pH7.2進行滲析。
2.琥珀醯化把2.6ml含有0.1g琥珀酐/ml DMSO的溶液添加到從(1c)得到的滲析聚BSA溶液中。在25℃溫育60分鐘後，溶液補加50mM賴氨酸，對150倍體積20mM磷酸鉀緩衝劑(pH6.8)進行滲析，凍幹。
實例7用聚琥珀醯化BSA(P-BSA-Succ)減少肌鈣蛋白-T夾層免疫測定中的幹擾試驗是用Boehringer Mannheim GmbH公司製造的Enzymuntest肌鈣蛋白T進行的。
1.有共軛物的溫育緩衝劑40mM磷酸鹽緩衝劑7.0MAB肌鈣蛋白-T＞M-7-Fab-POD150mU/mlMAB肌鈣蛋白-T＞M-11-7-IGG-生物素2.5μg/ml0.5mg/ml P-BSA-Succ；在對比試驗中，溫育緩衝劑不含P-BSA-Succ。
2.基質緩衝劑磷酸鹽/檸檬酸鹽緩衝劑100mM，pH4.4H2O23.2mM色原ABTS 1.9mM實驗是按照實例1進行的，採用140μl樣品和700μl有共軛物的溫育緩衝劑(溫育30分鐘)；200μl洗滌溶液，700μl基質緩衝劑(溫育時間15分鐘)。
溫育緩衝劑中不添加P-BSA-Succ時，表A中所列幹擾血清顯著高於0.2ng/ml肌鈣蛋白T的截止值。添加0.5mg/ml P-BSA-Succ使所有血清的非特定信號都降低到該截止值以下和/或完全消除某種幹擾。這種減幹擾蛋白的添加對標定曲線(表A)的斜率不產生顯著影響。因此，陽性人體血清的回收率不受影響。
先有技術的單體琥珀醯化BSA(BSA-Succ)必須以高出50倍的濃度使用才能得到與聚合琥珀醯化BSA(P-BSA-Succ)大致相同的減幹擾(表B)。其後果是標定曲線變得非常扁平，進而導致大大提高陽性人體血清的回收率(表B)。因此，在肌鈣蛋白-T試驗中不能使用單體BSA-Succ。
表A用P-BSA-Succ減少肌鈣蛋白-T免疫測定中的幹擾截止值0.2 ng/ml
標定曲線
表B用單體BSA-Succ減少肌鈣蛋白-T免疫測定中的幹擾截止值0.2ng/ml
權利要求
1.用來減少免疫測定中非特定相互作用的含蛋白物質，其特徵在於該減幹擾物質是一種用-CO-R基團醯化的蛋白凝聚物，式中R是一個支化或無支化C1-C4烷基，該烷基可以有羧基、羥基、SO3H或PO3H2基團取代。
2.按照權利要求1的減幹擾物質，其特徵在於該蛋白是白蛋白。
3.按照權利要求2的減幹擾物質，其特徵在於該蛋白是牛血清白蛋白。
4.按照權利要求1～3的減幹擾物質，其特徵在於R是一個甲基基團或一個CH2CH2-COOH基團。
5.按照權利要求1～4之一的減幹擾物質，其特徵在於該蛋白凝聚物是用均質或非均質雙官能連接物化學凝聚的。
6.按照權利要求1～4之一的減幹擾物質，其特徵在於該蛋白凝聚物是熱凝聚的。
7.按照權利要求6的減幹擾物質，其特徵在於該減幹擾物質是熱凝聚乙醯化或琥珀醯化牛血清白蛋白。
8.按照權利要求1～7之一的減幹擾物質，其特徵在於該醯化蛋白凝聚物的粒度範圍為10～200nm。
9.按照權利要求8的減幹擾物質，其特徵在於粒度範圍為2 0～50nm。
10.用來減少免疫測定中非特定相互作用的減幹擾劑，其中包含一種緩衝劑和一種含蛋白減幹擾物質，其特徵在於它包含一種按照權利要求1～9之一的減幹擾物質。
11.按照權利要求10的減幹擾劑，其特徵在於該緩衝劑的pH值為4～9。
12.免疫測定用特定結合試劑，其中包含一個特定結合對的一種特定結合配偶體，和一種含蛋白減幹擾物質或減幹擾劑，其特徵在於它含有一種按照權利要求1～9之一的減幹擾物質或一種按照權利要求10或11之一的減幹擾劑。
13.按照權利要求12的特定結合試劑，其特徵在於該結合配偶體是一種標記的或生物素基化的結合配偶體。
14.按照權利要求12或13的特定結合試劑，其特徵在於該結合配偶體是一種抗原、抗體或抗體片段。
15.按照權利要求14的特定結合試劑，其特徵在於該結合配偶體是一種有酶標記或電化學發光標記的抗體或抗體片段。
16.在減少非特定相互作用的情況下測定樣品中免疫學配體的方法，它藉助於1)讓該配體的待測樣品接觸a)一種或若干種含蛋白減幹擾物質，或者含有含蛋白減幹擾物質和適用緩衝劑的若干種含蛋白減幹擾劑之一，和b)特定結合對的一種或若干種結合配偶體，其中至少一種結合配偶體是標記的，形成一個可檢測結合對，2)測定標記結合對的存在或數量或一種特定結合對的自由標記結合配偶體，作為樣品中配體存在或濃度的量度，其特徵在於該減幹擾物質是按照權利要求1～9之一的一種醯化蛋白凝聚物。
17.按照權利要求16的方法，其特徵在於該配體是一種病毒、病毒標記、腫瘤標記或一種激素。
18.按照權利要求16或17的方法，其特徵在於特定結合對的結合配偶體選自由抗原、抗體或抗體片段組成的這一組。
19.按照權利要求16～18的方法，其特徵在於一種結合配偶體攜帶一種酶標記或電化學發光標記。
20.按照權利要求16～19的方法，其特徵在於一種特定結合配偶體有另一個特定結合部位供一個結合到固相上的結合配偶體用。
21.按照權利要求20的方法，其特徵在於一種結合配偶體是生物素基化的，並能結合副一個抗生蛋白鏈菌素表面上。
22.按照權利要求1～9之一的減幹擾物質或按照權利要求10或11的減幹擾劑在免疫測定中的用途。
23.按照權利要求1～9之一的減幹擾物質或按照權利要求10或11的減幹擾劑用來減少免疫測定中非特定相互作用的用途。
24.按照權利要求1的減幹擾物質的製備方法，其特徵在於a)使蛋白質聚合生成一種凝聚物，b)該蛋白凝聚物用對應醯化劑醯化。
25.按照權利要求24的方法，其特徵在於使該蛋白質發生熱聚合。
26.按照權利要求24的方法，其特徵在於該蛋白凝聚物是用乙醯-O-琥珀醯亞胺或用琥珀酸酐醯化的。
全文摘要
本發明的主題是用於免疫測定的含蛋白減幹擾劑，其組成是用-CO-R基團醯化的蛋白凝聚物，式中R是一個支化或無支化的C
文檔編號G01N33/531GK1120864SQ94191748
公開日1996年4月17日 申請日期1994年12月21日 優先權日1993年12月21日
發明者D·施裡帕, F·施米德, M·考夫曼 申請人:曼海姆泊靈格股份公司