一種比率螢光納米探針及其製備方法和應用的製作方法
2023-05-15 02:10:41 3
一種比率螢光納米探針及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫學檢測和生化分析領域，具體公開了一種表面功能化的二氧化矽螢光納米粒子用於細胞內外鋅離子檢測的新螢光探針；所述探針是將接枝氨基喹啉的樹枝狀聚乙烯亞胺衍生物共價連接在包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子表面，利用比率螢光方法進行細胞內外鋅離子的檢測。該發明屬於對鋅離子螢光檢測方法的改進，能最大限度地提高檢測靈敏度。
【專利說明】一種比率螢光納米探針及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學檢測和生化分析領域，更具體地，涉及一種比率螢光納米探針及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]鋅離子是僅次於鐵離子之後人體內第二多的過渡金屬離子。其在生物過程中主要以二價陽離子的形式存在並且在整個生物體系中發揮著十分重要的作用。研究表明鋅離子能夠與一些特定的蛋白質結合，作為其結構的輔助因子和催化中心，發揮酶的作用，另外腦功能、基因轉移、免疫功能、神經信號傳導等生物過程都和鋅離子相關。所以鋅離子的檢測已經成為生物分析的一個重要研究方向，快速靈敏的進行鋅離子檢測在臨床上具有重要意義。
[0003]鋅離子穩定的cT電子結構使得許多光譜分析和電化學方法均不適於鋅離子的檢測，於是螢光分析方法就成為了鋅離子檢測的最好選擇。螢光檢測方法具有操作便捷、靈敏度高等優點，已經成為生物體內外各種金屬離子檢測的一種有力手段。基於光誘導電子轉移的喹啉衍生物，由於其PH不敏感，能夠與金屬配位，光穩定性好等優點被廣泛的用於生物體內鋅離子檢測。然而，大多數喹啉類的螢光探針在鋅離子檢測過程中往往存在複雜的合成過程，水溶性差，細胞通透性差，檢測靈敏度低等缺點，限制了其在生物分析中的應用。另外，傳統單發射螢光檢測 探針，往往易受檢測環境、樣品處理、儀器設備等因素的影響，其分析的精確性不易控制。
[0004]比率螢光測定方法是螢光分析中一個重要的方法，它利用螢光探針的物質響應螢光信號與自身內標螢光的比值來進行待測物的定量分析。這種檢測策略以相同背景下測定的螢光強度的比值作為信號參數，能夠極大的消除背景螢光對檢測信號的幹擾，從而提高檢測的靈敏度。這種雙發射的比率螢光探針對於細胞內物質的傳感檢測具有十分明顯的優勢，如能夠校正細胞中細胞液粘度、離子效應、pH、光散射等因素對螢光信號的幹擾，有效的提高檢測的準確性。因此設計合成比率型螢光探針具有很好的應用前景。納米技術的興起也極大的推動了新型螢光探針的製備和發展，構建新型納米螢光探針對Zn2+進行檢測已經引起廣泛關注。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是為了克服現有鋅離子螢光檢測方法中喹啉衍生物水溶性差，細胞通透性差，單發射檢測方法易受到複雜基質背景幹擾，靈敏度不高的缺陷，提供一種基於雙發射的比率螢光檢測方法。所述方法將接枝氨基喹啉的樹枝狀聚乙烯亞胺衍生物共價連接在包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子表面，利用氨基喹啉與鋅離子特異性識別反應產生的在波長500 nm處的螢光與二氧化矽螢光納米粒子在波長600 nm處固定不變的螢光的比值進行鋅離子的靈敏檢測，極大提高檢測靈敏度，並可用於細胞中鋅離子的實時成像。[0006]本發明首先提供一種比率螢光納米探針，包括包埋有聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子，和通過共價鍵與二氧化矽螢光納米粒子連接的水溶性鋅離子識別探針。
[0007]所述的水溶性鋅離子識別探針是由氨基喹啉類衍生物與樹枝狀聚乙烯亞胺接枝形成。
[0008]所述的氨基喹啉類衍生物為8-氯乙醯基氨基喹啉。
[0009]根據需求再提供一種上述的比率螢光納米探針的製備方法，包括以下步驟:
51.水溶性鋅離子識別探針的合成:將氨基喹啉類衍生物、樹枝狀聚乙烯亞胺與無水碳酸鉀混合，攪拌，進行接枝反應，加熱在惰性氣體保護下進行回流回收；
52.包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子的製備；
53.比率螢光納米探針的製備；將步驟SI所得的水溶性鋅離子識別探針和步驟S2所得的二氧化矽螢光納米粒子加入到磷酸緩衝液中，室溫反應，即得。
[0010]S2中所述的包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子的製備採用油包水的反相微乳法製備。
[0011]S3中所述的磷酸緩衝液含有N-羥基琥珀醯亞胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙
基碳二亞胺鹽酸鹽。 [0012]根據以上材料，再提供一種鋅離子螢光檢測方法，使用上述的比率螢光納米探針。
[0013]包括以下步驟:
S1.體液中鋅離子的檢測:將比率螢光納米探針加入到離心管中，加入不同濃度的鋅離子，再用磷酸緩衝液定容，孵育，在365 nm紫外燈下拍照，並用螢光分光光度計測定其在420-750 nm範圍內的螢光光譜，激發波長為370 nm ；
SI1.細胞內的鋅離子成像:分別用共聚焦顯微鏡觀察不用外源鋅粒子和用外源鋅離子(50 μ M的ZnCl2)處理的細胞，記錄綠色螢光通道和紅色螢光通道螢光信號的改變和二者比值的變化考察螢光納米探針對鋅離子的響應。
[0014]本文所製備的比率螢光納米探針具有一下特點和優勢:
(I)氨基喹啉衍生物作為鋅離子識別基團，被接枝在低分子量的樹枝狀的聚乙烯亞胺(PEI)上面，從而降低了其可能的細胞毒性，提高水分散性以及所製備探針的細胞滲透性。
[0015](2)將鋅離子螢光探針接枝在二氧化矽螢光納米粒子的表面，運用比率螢光的方法進行檢測，這種檢測方式能消除背景的幹擾，提高檢測的準確度，使螢光探針更加的穩定。
[0016](3)每個螢光納米二氧化矽表面都有大量的鋅離子識別單元，能夠使信號放大，從而能夠高效、靈敏地檢測鋅離子。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1.基於基於比率螢光納米探針用於鋅離子檢測的原理圖。
[0018]圖2.比率螢光納米探針對模擬體液中鋅離子的響應螢光光譜及標準曲線。
[0019]圖3.比率螢光納米探針對人宮頸癌細胞內的鋅離子成像圖。
【具體實施方式】
[0020]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，本發明採用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規市購的試劑、設備和常規使用的方法。
[0021]如圖1所示，本發明首先通過化學方法合成了 8-氯乙醯基氨基喹啉，而後用樹枝狀聚乙烯亞胺的氨基取代8-氯乙醯基氨基喹啉的氯製備出水溶性鋅離子識別探針(PE1-Q)，最後我們將這種水溶性的鋅離子識別探針通過共價鍵連接在包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子的表面，從而製得用於鋅離子檢測的新型比率螢光納米探針。
[0022](1)8-氯乙醯基氨基喹啉的合成:首先準確稱取288 mg 8_氨基喹啉於25 mL圓底燒瓶中，再向其中加入202 mg三乙胺以及10 mL 二氯甲燒，室溫攪拌一段時間使體系混合均勻。然後在冰浴下將246 mg氯乙醯氯緩慢的滴加到反應體系中，40 min內滴完。最後將反應體系升至室溫並使反應24 h。用薄層色譜檢測反應完全後，用真空旋轉蒸發除去溶劑得到粗產物。再將得到的粗產物用色譜柱(矽膠，PE/EA=3:1 )提純，得到為淺白色固體，真空乾燥箱40 °C乾燥後備用。
[0023](2)聚乙烯亞胺-氨基喹啉衍生物(PEIQ)的合成:取50 mL的圓底燒瓶，向其中加入44 mg的8-氯乙醯基氨基喹啉及20 mL乙腈,待反應物溶解後，再加入500 mg的聚乙烯亞胺和38.4 mg的無水碳酸鉀，攪拌一段時間後，加熱使體系在氮氣保護下回流8 h。薄層色譜用來檢測體系反應程度，待原料反應完全，用旋轉蒸發除去乙腈得到粗產物。再將得到的粗產物通過共沉澱除去未反應的雜質，純化後得到黃色油狀物，真空乾燥後備用。
[0024](3)包埋聯 吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子的製備:向50 mL圓底燒瓶中加入7.5mL環己烷，1.77 mL TX-100,1.8 mL正己醇和340 μ L重蒸水。均勻攪拌20 min後，反應體系形成了油包水的微乳體系，然後再向混合物中緩慢滴加80 μ L 0.1 mo I/L聯吡啶釕水合物以及100 μ L四甲氧基矽氧烷,反應30 min後,加入60μ L 28%氨水使矽氧烷水解。室溫下反應24h以後，再加入50 UL四甲氧基矽氧烷和50 UL CTES，隨後再在室溫下反應24 h。待反應完成，向反應體系中加入20 mL丙酮破乳，接著超聲，渦旋，8000 rmp離心。按照以上方法再用乙醇洗兩次，水洗一次後，將得到的二氧化矽螢光納米粒子分散於重蒸水中待用。
[0025](4)比率螢光納米探針的製備:將0.1 g羧基化的二氧化矽螢光納米粒子和0.05 gPEIQ加入到20 mL含5 mM N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和2 mM (1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的濃度為0.01 M的磷酸緩衝液中(pH = 7.4)。隨後將反應體系置於室溫下反應15 h。反應完成以後，用離心機除去未修飾的PEI衍生物及無機鹽，將最終製備的比率螢光納米探針分離出來，並依次用超純水洗滌後，分散於PBS中，放置於4 V備用。
[0026]本發明利用在單一波長激發下，二氧化矽螢光納米粒子(內標)在發射波長600 nm處的螢光強度和聚乙烯亞胺-喹啉衍生物與鋅離子絡合物發射的波長500 nm處螢光強度的比值作為檢測信號來檢測鋅離子濃度，這種雙發射的比率螢光探針能夠消除背景信號的幹擾，大大提高鋅離子檢測的靈敏度。本發明將其用於體外模擬體液中鋅離子的檢測，並用於細胞內鋅離子的實時螢光成像。
[0027](I)模擬體液中鋅離子的檢測:比率螢光納米探針用於在PBS中進行鋅離子檢測的過程:首先，取1.5 mL的離心管，向其中加入2.4 μ g的比率螢光納米探針，然後再向反應體系中加入不同濃度的鋅離子，最後用磷酸鹽緩衝溶液定容到1.2 mL (使得鋅離子的最終濃度為:0，1，2，4，6，10，15，20，30，50，100 μΜ)。然後混合體系在37 °C下孵育5 min後，在365 nm紫外燈下拍照，並用螢光分光光度計測定其在420-750 nm範圍內的螢光光譜，激發波長為370 nm。[0028](2)細胞內的鋅離子成像。
[0029]本發明以人宮頸癌細胞(HeLa細胞)作為細胞模型。用含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)、100 U mL—1青黴素及100 μ g mL—1鏈黴素的H-DMEM培養基培養HeLa細胞，培養條件:37 °C，5% CO2，兩天換液一次。細胞成像:將處在對數期的HeLa細胞接種於6孔的細胞培養皿中(每孔15個細胞)，當細胞覆蓋率到達60-70%左右時，將比率螢光納米探針懸浮液(10 yg mL—1)加入到6孔板中，37 °C下孵育3 h後，再向其中加入50 μ M氯化鋅溶液，繼續孵育半個小時，之後，棄去培養基，用PBS洗板兩次後，將HeLa細胞放在雷射共聚焦下觀察成像效果。
[0030]如圖2所示，當沒有鋅離子存在的情況下，只在波長600 nm附近看到了一個明顯的螢光發射光譜。隨著鋅離子濃度的不斷增大，在波長600 nm處的螢光強度基本保持不變，而在波長500 nm處的螢光強度持續增加，該比率螢光納米探針的螢光比值(F5TO/F_)不斷升高，而且在一定範圍內螢光比值還與鋅離子的濃度之間線性相關，這種比率螢光納米探針檢測到鋅離子的濃度低至0.5 μ M，線性範圍為1.0-20 μ M (R2=0.98)。與其他的喹啉基的分子探針或納米傳感器相比，這種比率螢光納米探針具有更好的水溶性和更低的靈敏度。
[0031]利用螢光顯微鏡對細胞內鋅離子螢光成像進行了研究，如圖3所示，當該比率螢光納米探針與HeLa細胞共同孵育3 h以後，從明場圖像中我們看到細胞伸展良好，具有完整的細胞核和細胞膜結構，而在綠色螢光通道中我們幾乎沒有觀察到螢光信號，這主要是由於HeLa細胞內的鋅離子濃度過低，相反通過紅色螢光通道我們觀察到了很強的螢光信號，這是二氧化矽螢光納米粒子本身的螢光信號。通過螢光通道和明場通道的疊加圖片，我們觀察到螢光信號定位於細胞核周圍的細胞質中的，顯示出納米探針具有優異的膜滲透性和小的細胞毒性。當細胞用外源性鋅粒子處理(50 μ M的ZnCl2)之後，相比於不經處理的細胞圖片，綠色螢光通道顯示出非常強的螢光發射，而紅色通道螢光基本沒有變化，從明場和螢光通道的疊加圖像可以看出螢光納米探針的的螢光發射顏色從紅色變成綠色，在HeLa細胞中呈現出黃綠色，這是由於紅光與綠光疊加為黃光的緣故，這與在水溶液中觀察到的螢光光譜非常一致，這種變化通過觀察分離的檢測通道更加明顯。實驗結果表明這種新穎的比率螢光納米探針顯示出細胞內鋅離子檢測的能力，能夠進行雙發射的細胞成像檢測。
【權利要求】
1.一種比率螢光納米探針，其特徵在於，包括包埋有聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子，和通過共價鍵與二氧化矽螢光納米粒子連接的水溶性鋅離子識別探針。
2.根據權利要求1所述的比率螢光納米探針，其特徵在於，所述的水溶性鋅離子識別探針是由氨基喹啉類衍生物與樹枝狀聚乙烯亞胺接枝形成。
3.根據權利要求2所述的比率螢光納米探針，其特徵在於，氨基喹啉類衍生物為8-氯乙醯基氨基喹啉。
4.一種根據權利要求1所述的比率螢光納米探針的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 51.水溶性鋅離子識別探針的合成:將氨基喹啉類衍生物、樹枝狀聚乙烯亞胺與無水碳酸鉀混合，攪拌，進行接枝反應，加熱在惰性氣體保護下進行回流回收； 52.包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子的製備； 53.比率螢光納米探針的製備；將步驟SI所得的水溶性鋅離子識別探針和步驟S2所得的二氧化矽螢光納米粒子加入到磷酸緩衝液中，室溫反應，即得。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，S2中所述的包埋聯吡啶釕的二氧化矽螢光納米粒子的製備採用油包水的反相微乳法製備。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，S3中所述的磷酸緩衝液含有N-羥基琥珀醯亞胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
7.一種鋅離子螢光檢測方法，其特徵在於，使用如權利要求1所述的比率螢光納米探針。
8.根據權利要求7所述的鋅離子螢光檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: S1.體液中鋅離子的檢測:將比率螢光納米探針加入到離心管中，加入不同濃度的鋅離子，再用磷酸緩衝液定容，孵育，在365nm紫外燈下拍照，並用螢光分光光度計測定其在420-750 nm範圍內的螢光光譜，激發波長為370 nm ； SI1.細胞內的鋅離子成像:分別用共聚焦顯微鏡觀察不用外源鋅離子和用外源鋅離子處理的細胞，記錄綠色螢光通道和紅色螢光通道螢光信號的改變和二者比值的變化考察突光納米探針對鋅離子的響應。
【文檔編號】C09K11/06GK104031634SQ201410217964
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】易長青, 時宇鵬, 陳志華, 程鑫, 潘益, 張恆, 張肇敏 申請人:中山大學