微小rna及其應用的製作方法

2023-05-14 15:59:21 1

專利名稱：：微小rna及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一組微小核酸的用途，尤其是涉及hsa-miR-17-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-27_a、hsa-miR-29-a作為生物標記物的應用，屬於生物醫學材料
技術領域：
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背景技術：
：近幾年來，從植物、線蟲到人的細胞中廣泛存在一種非編碼的單鏈RNA小分子(micro脂A—miRNA)，它們能以不完全互補的方式與其靶mRNA的3'非翻譯端特定區域相互作用，抑制蛋白質的合成。1993年Lee等採用經典克隆方法在線蟲中首次克隆了lin-4基因，通過點突變的方法證實小分子RNA的存在。2000年Reinhart等在人和果蠅中發現了let-7基因的存在，於是推測這類小分子可能是一類進化上保守，在生命過程中起重要作用的調節分子。隨後人們在植物、線蟲、果蠅和哺乳動物中己發現了一千多個miRNA基因。小RNA的研究給我們帶來重要的啟迪是基因組非組蛋白編碼區蘊含著重要的生命功能活動信息。現有研究表明生命的一些重要活動如幼蟲的生長發育、細胞的發生和分化、神經系統的分化等都被一些非蛋白編碼小RNA的調控;而除miRNA,siRNA以外的小RNA我們更是知之甚少。長期以來，有關基因的研究重點都在蛋白編碼基因上，而小RNA的發現和研究對揭示基因的表達調控機制，讓我們更為深入的了解生命之奧秘無疑具有重大的科學價值。據統計，miRNA在人類基因組中約佔1%的數量，在不同的時空發育階段表達量存在顯著差異。Bartel等(AmbrosV，BartelB,BartelDP,BurgeCB，CarringtonJC，ChenX，DreyfussqEddySR，Crriffiths_JonesS，MarshallM，MatzkeM，RuvkunqTuschlT.)提出,由於miRNA與耙miRNA互補程度不同，起著切割或微弱抑制作用。由於其作用靶點的多寡，miRNA表達量亦不同，通過基因晶片技術，可以同時檢測所有miRNA時空表達的狀況。在此基礎上，尋找mi認A耙基因，揭示其作用機制是目前研究的重點，也是後基因組時代需要解決的問題之一。全部miRNA基因功能的揭示可能會給人們對生命現象的理解帶來一場深刻的革命。5目前的研究已經發現多種miRNA與疾病的發生有關。如MiR-15a在白血病細胞中有調控作用(MiR-15aandmiR-16-lclusterfunctionsinhumanleukemia.CalinGA，CimminoA,FabbriM，etal.ProcNatlAcadSciUSA.2008，1;105(13):5166-71.)。有研究表明，MiR-15a通過耙向BCL2誘導凋亡(miR-15andmiR-16induceapoptosisbytargetingBCL2.CimminoA，CalinGA,FabbriM，etal.ProcNatlAcadSciUSA.2005，27;102(39):13944-9.)。MiR-342在多發性骨髓瘤骨髓微環境調控中起重要作用(AnintegrativegenomicapproachrevealscoordinatedexpressionofintronicmiR-335，miR—342，andmiR_561withderegulatedhostgenesinmultiplemyeloma.RonchettiD,LionettiM，MoscaL，etal.BMCMedGenomics.2008，13;1(1):37.)，在結腸癌中可通過宿主基因的表觀遺傳學改變被沉默(EpigeneticsilencingoftheintronicmicroRNAhsa-miR-342anditshostgeneEVLincolorectalcancer.GradyWM，ParkinRK，MitchellPS，etal.Oncogene.2008，19:27(27):3880-8.)。其他如let-7a，miR-98，miR-17-5p也在各種腫瘤中被廣泛研究。MiR-17-5p被研究的較廣泛較多，可通過與其他miRNA相互作用發揮作用。MiR-17-5p通過抑制AIB1mRNA的翻譯調控乳腺癌細胞增殖(Mir-17-5pregulatesbreastcancercellproliferationbyinhibitingtranslationofAIB1mRNA.HossainA，KuoMT,SaundersGF.MolCellBiol.2006:26(21):8皿-201.)。MiR-17-5p拮抗劑可以通過上調p21和BIM抑制難治性神經母細胞瘤的生長(Antagomir-17-5pabolishesthegrowthoftherapy-resistantneuroblastomathroughp21andBIM.FontanaL，FioriME,AlbiniS，etal.PLoSONE.2008May21;3(5):e2236.)。Mir-29a在愛滋病中靶向重要的基因nef基因，在延緩疾病進展中起重要作用(TargetsforhumanencodedmicroRNAsinHIVgenes.HariharanM，ScariaV，PillaiB，etal.BiochemBi叩hysResCommun.2005，2;337(4):1214-8.)。在散發的早老性痴呆患者中，miR-29a的缺失與BACEl/P分泌酶的表達增加相關(LossofmicroRNAclustertniR-29a/b-linsporadicAlzheimer'sdiseasecorrelateswithincreasedBACEl/beta-secretaseexpression.RelatedArticles,H6bertSS,Horr6K，Nicola'iLetal.ProcNatlAcadSciUSA.2008,29:105(17):6415-20.)。強直性脊柱炎由於該病一般先侵犯骶髂關節，並重點累及脊柱，最終導致脊6柱骨性強直，故目前國內外多稱之為強直性脊柱炎(AnkglosingSpondytitis)，簡稱AS。強直性脊柱炎是一種嚴重威脅人類健康的疾病，本病在不同人種、不同地區發病率不盡相同，平均患病率約佔人口的O.1%。本病多發於16-25歲人群，男女性別比例約為10:1。目前，強直性脊柱炎的診斷仍沿用1966年紐約標準，或1984年修訂的紐約標準，條件如下紐約標準(1966年)有X片證實的雙側或單側骶髂關節炎(按前述0—IV級分級)，並分別附加以下臨床表現的1條或2條，g卩，①腰椎在前屈、側屈和後伸的三個方向運動均受限；②腰背痛史或現有症狀；③胸廓擴展範圍小於2.5cm。根據以上幾點，診斷肯定的AS要求有X線片證實的m—IV級雙側骶髂關節炎，並附加上述臨床表現中的至少一條；或者X線證實的III一IV級單側骶髂關節炎或n級雙側骶髂關節炎，並分別附加上述臨床表現的i條或2條。修訂的紐約標準(1984年)①下腰背痛的病程至少持續3個月，疼痛隨活動改善，但休息不減輕；②腰椎在前後和側屈方向活動受限；③胸廓擴展範圍小於同年齡和性別的正常值；④雙側骶髂關節炎n—iv級，或單側骶髂關節炎ni—IV級。如果患者具備④並分別附加①一③條中的任何1條可確診為AS。從上述兩種標準可見，它們均缺乏對患者診斷的敏感性及重複性。並且，目前沒有對AS進行診斷的定量標準。為克服上述缺點，本領域仍需要提供一種新的可以作為強直性脊柱炎的生物學標誌物及其檢測方法。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一組新的作為強直性脊柱炎的生物標誌物並提供可用於該組生物標誌物表達量定量檢測的寡聚核苷酸，以及所述寡聚核苷酸的用途。本發明經過廣泛而深入的研究，發現並分離了新的可作為強直性脊柱炎標誌物的微小核酸hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a。上述微小核酸在正常人的血液樣本中不表達或表達量很低，而在強直性脊柱炎患者的血液樣本中表達量很高，並且在患者服藥後表達量有所下降。在此基礎上完成了本發明。在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a微小核酸，它包含具有SEQIDNO:14所示的多核苷酸序列、或其保守性變異核酸序列、或其片段。在本發明的第二方面，提供了用於檢測上述微小核酸的寡聚核苷酸，包括逆轉錄引物、探針和正向引物及反向引物，優選的，所述寡聚核苷酸的序列如SeqIDNo536所示。本發明中所述的一組寡聚核苷酸，是指用於檢測一種微小核酸的逆轉錄引物、探針和正向引物、反向引物。本發明的第三方面提供了上述寡聚核苷酸的用途，既可以用於檢測樣本中微小核酸hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a的表達量，又可以用於篩選調節所述微小核酸表達的調控因子，如藥物篩選，還可用於製備強直性脊柱炎診斷試劑。本發明中所述調控因子是指任何能夠影響所述微小核酸表達的分子，包括有機分子、無機分子、大分子化合物和小分子化合物、生物分子如siRNA或microRNA類似物等。在使用上述寡聚核苷酸製備檢測或診斷試劑時，既可以僅使用其中的任意一組用於檢測一種微小核酸，也可以使用其中的至少兩組寡聚核苷酸的組合，可以是檢測一種微小核酸的寡聚核苷酸的組合，也可以是檢測不同的微小核酸的寡聚核苷酸的組合。本發明的第四方面提供了應用上述寡聚核苷酸檢測所述微小核酸的方法，包括提取人組織樣本中的總RNA，加入逆轉錄引物反轉錄成cDNA後，以cDNA為模板向反應體系中加入探針和正向引物、反向引物、DNA聚合酶及四種脫氧核糖核苷酸底物、反應緩衝液等，通過反應產物的螢光強度，反映微小核酸的原始表達量。所述探針可在5'端連接螢光報告基團，螢光報告基團可以為SybrGreen、lux、FAM、HEX、CY3，VIC、TET、J0E，相應的在探針的3'端連接對應的螢光淬滅基團，例如當螢光報告基團為6-羧基-螢光素(簡稱FAM)時，其3'端連接的對應的螢光淬滅基團為4-(4'-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸(簡稱DABCYL)。優選的人的組織樣本為血液樣本。在上述技術方案的基礎上，本發明進一步提供了檢測微小核酸表達的試劑盒，所述試劑盒包含上述寡聚核苷酸的一組或多組，優選地還包含如下組分逆轉錄酶及其反應緩衝液四種脫氧核糖核苷酸底物DNA聚合酶螢光定量PCR反應緩衝液人工合成的snRNA—U6的內參及正常人對照品試劑盒使用說明書。8更進一步的，本發明還提供了一種診斷強直性脊柱炎的方法，包括下列步驟:從待診斷患者取得生物樣本；檢測生物樣本中hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a,hsa-miR-29-a中一個或多個微小核酸的表達水平，比較生物樣本中的微小核酸表達量與正常對照樣本中的相同微小核酸的表達量，其中出現一種或多種微小核酸增量表達的生物樣本的供體患有強直性脊柱炎。優選的，所述生物樣本為供試者的血液。本發明還提供了治療強直性脊柱炎藥物篩選的方法，^f述方法為用藥前後檢測hsa-miR-17-5P，hsa-tniR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29-a中至少一種微小核酸的表達量。另外，本發明包括與本文所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如，與本發明多核苷酸序列相比含有至少50%序列同一性、優選至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96°/。、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。本發明的有益效果1.提供了可以作為強直性脊柱炎的診斷標誌物；2.提供了定量檢測強直性脊柱炎標誌物表達的寡聚核苷酸；3.提供了定量檢測強直性脊柱炎標誌物表達的試劑盒。本發明的技術方案為強直性脊柱炎的檢測提供定量的標準，克服了以往疾病診斷中主要依靠醫生個人的主觀判斷，而且簡便易操作，取樣方便，對於強直性脊柱炎的準確診斷具有重要意義。圖1基因晶片分析microRNA表達譜檢測結果圖2內參基因U6在不同生物樣本中的擴增曲線圖，左圖是正常人，右圖是AS患者，CU值基本相同。圖3hsa-miR-17-5p在不同生物樣本中的擴增曲線圖，左圖是正常人，右圖是AS患者，與內參相比，正常人ACU大於患者，因此該miRNA在患者中相對於正常組表達較高。圖4hsa-miR-27a在不同生物樣本中的擴增曲線圖，左圖是正常人，右圖是AS患者，與內參相比，正常人ACU大於患者，因此該raiRNA在患者中相對於正9常組表達較高。圖5hsa-miR-29a在不同生物樣本中的擴增曲線圖，左邊圖是正常人，右圖是AS患者，與內參相比，正常人ACIJ大於患者，因此該miRNA在患者中相對於正常組表達較高。圖6hsa-miR-126-3p在不同生物樣本中的擴增曲線圖，左圖是正常人，右圖是AS患者，與內參相比，正常人ACU大於患者，因此該miRNA在患者中相對於正常組表達較高。具體實施例方式下面將結合實施例及附圖進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而並不是用來限制本發明的範圍。實施例1總RNA的製備A:分離外周血單個核細胞(PBMC)(1).用抗凝管(內含抗凝液0.2ml)收集血液，搖勻，加入的Hank，s液或PBS等體積(1:1)稀釋血液。(2).取淋巴細胞分層液2ral，放入15ml的離心管。(3).將離心管傾斜45°角，用吸管吸取稀釋血液，在離分層液面上lcm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液疊於分層液上，保持兩者界面清晰。(稀釋血液與分層液體積比例約為2:1)。(4).18-20°C，水平離心機以2000rpm離心20min，離心後其中的內容物分為四層，上層為血漿(內含血小板)，中間層為分層液，底層為紅細胞和粒細胞，在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個核細胞層(薄)。單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。(5).用毛細血管(或lml注射器)輕輕插入白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個核細胞，移入另一離心管中。(6).加入5ml的不含Ca2+和Mg2+的Hank's液或RPMI1640(請註明來源)洗滌2次，混勻，依次以1500rpm離心10min、1000rpm離心10min，吸棄上清。(7).末次離心後，棄上清，所得沉澱為外周血單個核細胞。B:細胞總RNA抽提(1).往離心管中加入500ylEzol。(2).稱取適量的組織樣品(1020mg左右)於2ml離心管中，勻漿。(3).勻槳後補加500ulEzol，將離心管上下顛倒混勻，室溫放置10min。(4).加入200ylRNA專用的三氯甲烷，劇烈上下顛倒混勻，直至離心管中的液體徹底混勻，成乳白色狀。(5).室溫放置5min，12000rpm/min離心15min。(6).小心將上清轉移至另一乾淨的1.5ml離心管中，避免吸動中層蛋白相和下層有機相。(7).往上清中加入500ul預冷的RNA專用的異丙醇，室溫放置5min。10000rpm/rain離心10min。(8).小心棄盡上清，加入lmlRNA專用的75%的乙醇洗滌沉澱，10000rpm/min離心10min。(9).小心棄盡上清，置於室溫晾乾乙醇，每管加入20ulDEPC水溶解，混勻。實施例2基因晶片分析microRNA表達譜(基因晶片購自Invitrogen)(1).外周血單個核細胞，總RNA和miRNA的提取抽取活動期AS患者治療前10個標本，Enbrel治療12周後AS患者10個標本，健康對照者10個標本靜脈血4ml，用實施例1所述方法提取PBMC。用TRIzolReagent(LifeTechnologies,Inc.)提取總RNA，然後用mirVanamicroRNAIsolationist(Ambion,Inc.)分離其中的miRNA，保存於-20°C。(2).miRNA晶片標記與純化將2—5yg的micro脂A真空乾燥，乾燥完畢後，用4y1Nuclease-freeWater重懸micro腿樣品；用rairV雄TMmicroRNALabelingKit(AmbionInc.)以MonoreactiveCy3dye/MonoreactiveCy5dye(AmershamPharmaciaBiotech,Ltd)作螢光標記，QIAgenePCRPurificationkit(QIAGEN，Inc.);標記後進行下一步的純化。(3).miRNA晶片的製備與雜交microRNA探針文庫包括1152個探針，包括重複點樣的331個人類來源的microRNA分子、236個小鼠來源的microRNA分子、189個大鼠來源的microRNA分子、以及142個預測的microRNA分子；其他為各種陰性對照和外參照分子。(4).晶片圖像採集與數據分析隨後進行數據分析和處理。對於microRNA分子表達變化的顯著性，判斷標準是將校正後的兩個樣品間雜交信號強度的比值(Ratio)大於2或小於0.5。聚類分析的數據來源為校正後的各樣品的平均雜交信號值的對數數值，聚類分析的計算方法為最小方差法(Ward，sminimumvariance)。結果見附圖1。實施例3cDNA的製備(總RNA逆轉錄)將實施例l抽提得到的總RNA進行逆轉錄，製備cDNA模板(逆轉錄引物序列如表1所示)。A:逆轉錄反應體系:tableseeoriginaldocumentpage12B:逆轉錄反應條件反應條件為16°C30min;42°C30min;85°ClOmin。實施例4螢光定量PCR檢測A:cDNA模板的稀釋-將實施例2逆轉錄後得到的cDNA稀釋3倍，例如往20的體系中加入40tilRNase/DNasefreeddH20，混勻。B:螢光定量PCR體系(PCR反應引物及探針序列如表l、2、3所示)tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13根據hsa-miR-17-5P，hsa-miR-126-3P，hsa-miR-27-a，hsa-miR-29_a的序列，設計檢測所需的逆轉錄引物、探針、正向引物和反向引物，實驗中分別選取兩組進行螢光實時定量PCR實驗。表1各微小脂A對應的第一組引物及探針序列(RTprimer:逆轉錄弓I物；Fprimer:正向弓l物；Rprimer:反向弓l物；Probe:探針)GeneSequenceRTPrimer5'-GGAACGCTTCACGAATTT-3'Fprimer5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGAT-3'U6snRNARprimer5'-TTTAAGCACTTCGCAAGG-3'ProbeFAM-5，-TGGCCCCTGCGCAAGGATG-3，-DABCYL—RTPrimer5'-CGCGTGCAGATCAGATGCGTTGCGTATACGTGCACGCGCGCAT-3hsa-miR-126-Fprimer5，-GGACTCGTACCGTGAGTA-3，3pRprimer5，-CATCAGATGCGTTGCGTA-3，BeaconFAM-5，-CGCACGCGCGCATTATTACCGTGCG-3'-DABCYLProbeRTPrimer5'-GATGCAATGCATGAGAGATCCCTACCGACATGCATTGCATCGCGGAhsa-miR-27aA-3'13tableseeoriginaldocumentpage14ProbeMM-5，-GCATCGTCTCCGCATTATTCGATGC-3，-DABCYLhsa—miR—27aRTPrimer5,-ATCACGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGTGATGCGGAA-3'Fpri鵬r5，-CGACGTTCACAGTGGCT-3,Rpri鵬r5，-CTGAGAGATCCGTAGCG-3，BeaconFAM-5'-GACTCGTGATGCGGAACTTCGAGTC-3，-MBCYLProbeRTPrimer5'-ATCTCGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGAGATACTACC-3'hsa—raiR-17-5FprimerP5，-GACGCAAAGTGCTTACAGT-3,5，-CTG雄GATCCGTAGCG-3，F細-5'-GACTCGAGATACTACCTGCCGAGTC-3'-MBCYLhsa—raiR一29aRprimerProbeRTPrimer5'-GTCACGAGTCCTGAGAGATCCGTAGCGACAGGACTCGTGACTAACCG-3，Fpri鵬r5,-CGTTCGTAGCACCATCTG-3，Rprimer5，-CTGAGAGATCCGTAGCG-3，Beacon剛-5,-GACTCGTGACTAACCGATTCGAGTC-3，-腦CYLProbeFAM為6-羧基-螢光素，DABCYL為4-(4'-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸。實施例5不同類型生物樣本中四種微小核酸的表達量檢測將所取得的生物樣本按照來源分為患者用藥前(簡稱A組)、患者用藥後(簡稱B組)及正常人對照組(簡稱C組)三組，每組30個生物樣本。經過螢光實時定量PCR實驗，結果如圖3圖6及表34所示A組與C組比較，四種微小核酸的表達量均有大幅度的升高，因此這四種微小核酸均可作為強直性脊柱炎的生物標誌物。而B組中，四種微小核酸的表達量與A組相比均有不同程度的降低，提示患者經治療後四種微小核酸的表達量降低，進一步表明四種微小核酸為強直性脊柱炎的生物標誌物。表3不同類型生物樣本中四種微小核酸的表達量(使用表1所示的引物和15tableseeoriginaldocumentpage16(設定C組的表達量為1，其他為c組表達量的倍數，數字都是相對於正常組的表達倍數)表4不同類型生物樣本中四種微小核酸的表達量(使用表2所示的引物和探針)tableseeoriginaldocumentpage16(設定c組的表達量為1，其他為c組表達量的倍數，數字都是相對於正常組的表達倍數)儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。序列表蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司〈120〉微小RNA及其應用<130〉123456789〈160〉36<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1Homosapiens<400〉1caaagugcuuacagugcagguagu24〈210〉2<211〉21〈212〉RNA<213〉Homosapiens〈400〉2uucacaguggcuaaguuccgc2117〈210〉3〈211〉22<212〉RNA<213〉Horaosapiens3uagcaccaucugaaaucgguua22〈210〉4〈211>225<211〉43〈212〉DNA<213〉Artificial<220〉〈223〉artificial<400〉5gcgtgcgacatcagatgcgttgcgtatacgcgcacgcactacc18<210〉6〈211〉25〈212〉腿〈213〉Artificial〈220〉artificial<400〉6cgcacgcactacctgcactcgtgcg25<210〉7〈211〉19〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉artificial〈400〉7ggaccaaagtgcttacagt19〈210〉8〈211〉18〈212〉DNAArtificial〈220〉artificial<400〉8atgcgttgcgtagactac18<210〉947〈212〉腿〈213〉Artificial〈220〉artificial<400〉9atctcgagtcctgagagatccgtagcgacaggactcgagatactacc47〈210〉10〈211〉25Artificial〈220>〈223>artificial20〈400〉10gactcgagatactacctgccgagtc25<210〉11〈211〉19<212〉腿〈213〉Artificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉11gacgcaaagtgcttacagt19〈210〉12〈211〉17<212〉蘭〈213〉Artificial〈223〉artificial<400〉12ctgagagatccgtagcg1721<210〉13〈211〉43〈212〉畫〈213〉Artificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉13cgcgtgcacatcagatgcgttgcgtatacgcgcacgcgcgcat43〈210〉1425〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉14cgcacgcgcgcattattaccgtgcg251518〈212〉DNA〈213>Artificial22〈220〉<223〉artificial15ggactcgtaccgtgagta1818〈212〉DNAArtificialartificial16catcagatgcgttgcgta18〈210〉17〈211〉47〈212>DNA〈213〉Artificial〈220>〈223〉artificial1723acgccaattcatgagagatccctaccgacatgtattggcgtcagatg4718〈211〉25Artificial〈220〉〈223〉artificial<400〉18gcattggcgtcagatggtgcaatgc25〈210〉19〈211〉17腿〈213〉Artificial〈220〉artificial〈400〉19cgagtcgtaccgtgagt17〈210〉2017<223〉artificial2147〈212〉DNA〈213〉Artificial〈223〉artificial<400〉21gatgc朋tgcatgagagatccctaccgacatgcattgcatcgcggaEi47〈210〉22DNA〈213〉Artificial<220〉25artificial2317〈212>DNAartificial23cgacgttcacagtggct17〈210>24〈211>17〈212〉■<213〉Artificial<220〉artificial<400〉24atgagagatccctaccg17<210〉25Artificial〈220〉〈223〉artificial25atcacgagtcctgagagatccgtagcgacaggactcgtgatgcggaa47〈210〉26〈211〉25<212〉腿〈213〉Artificial〈220〉artificial<400〉26gactcgtgatgcggaacttcgagtc25<210〉27<211〉17Artificial〈220>〈223>artificial17〈212〉腿〈213〉Artificial〈220>〈223〉artificial28ctgagagatccgtagcg17<210〉29<211〉47〈212〉腿〈213〉Artificial〈223>artificial<400〉29gttgcaatgcatgagagatccctaccgacatgcattgcaactaaccg47<210〉30〈211〉25〈212〉腿<213〉Artificial18〈212>DNAArtificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉31cgacgtagcaccatctga182917〈212〉DNA<213〉Artificialartificial〈400>32atgagagatccctaccg1733〈211〉47DNA〈213〉Artificial〈220〉<223〉artificial〈400〉33gtcacgagtcctg卿gatccgtagcgacaggactcgtgacta6iccg47〈210〉34〈211〉25〈212〉腿Artificial〈220〉<223〉artificial<400〉34gactcgtgactaaccgattcgagtc2535〈211〉18〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉35cgttcgtagcaccatctg18〈210〉3617〈212〉DNA〈213〉Artificialartificial〈400>36ctg卿gatccgtagcg311權利要求1.微小核酸hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a、hsa-miR-29-a作為強直性脊柱炎診斷標誌物的應用。2.—組寡聚核苷酸，其特徵在於包括逆轉錄引物、探針、正向引物和反向引物，並用於通過螢光實時定量PCR法檢測hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-raiR-27-a或hsa-miR-29-a的表達。3.如權利要求2所述的寡聚核苷酸，其特徵在於，具有SeqIDNo536的序列，tableseeoriginaldocumentpage2tableseeoriginaldocumentpage3其中RT-Primer為逆轉錄引物，Probe為探針，F-Primer為正向引物，R-Primer為反向引物。4.權利要求2或3所述的寡聚核苷酸，其特徵在於所述探針5'端連接螢光報告基團，3'端連接對應的螢光淬滅基團。5.權利要求4所述的寡聚核苷酸，其特徵在於所述探針5'端連接的螢光報告基團為6-羧基-螢光素，3'端連接的對應的螢光淬滅基團為4-(4'-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸。6.權利要求25任一項所述的寡聚核苷酸用於製備微小核酸hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a或hsa-miR-29-a表達量的檢測試劑。7.權利要求25任一項所述的寡聚核苷酸用於製備強直性脊柱炎診斷試劑。8.—種檢測強直性脊柱炎的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒含有權利要求25任一項所述的寡聚核苷酸中的一組或多組。9.權利要求8所述的檢測強直性脊柱炎的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還含有逆轉錄酶及其反應緩衝液四種脫氧核糖核苷酸底物DNA聚合酶螢光定量PCR反應緩衝液人工合成的snRNA—U6的內參及正常人對照品試劑盒使用說明書。10.—種使用權利要求2或3所述的寡聚核苷酸檢測樣品中hsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a、hsa-miR-29-a表達量的方法，其特徵在於，包括步驟1)取人的血液樣品，收集外周血單個核細胞；2)抽提外周血單個核細胞中的總RNA;3)使用權利要求2或3所述的寡聚核苷酸檢測步驟2)得到的RNA中hsa-miR-17-5Phsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a或hsa-miR-29-a表達量的變化；4)數據分析。全文摘要本發明公開了一組用於強直性脊柱炎診斷的寡聚核苷酸，包括逆轉錄引物、探針、正向引物和反向引物，以及所述寡聚核苷酸用於微小RNA表達量檢測的用途。寡聚核苷酸包括用於檢測下述微小RNAhsa-miR-17-5P、hsa-miR-126-3P、hsa-miR-27-a、hsa-miR-29-a的探針和引物。本發明進一步提供了包含上述寡聚核苷酸的試劑盒及檢測方法，對強直性脊柱炎患者的微小RNA進行雜交檢測，能檢測出患者樣本中上述微小RNA的表達量高於正常人，可作為強直性脊柱炎的診斷試劑。文檔編號C12N15/11GK101684488SQ200810200479公開日2010年3月31日申請日期2008年9月25日優先權日2008年9月25日發明者古潔若,張佩琢,李志甲,段春曉申請人:蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司;古潔若