一種藍莓胚狀體培養方法

2023-05-14 22:40:31 1

專利名稱：一種藍莓胚狀體培養方法
技術領域：
本發明涉及一種珍奇果品種藍莓胚狀體培養，屬於植物組織培養領域。
背景技術：
利用葉片來誘導愈傷組織在組培學上非常常見。藍莓都用單芽枝進行組織分化叢生芽，叢生芽雖然比較容易培養，但這對於大量培養藍莓苗木，是非常緩慢的。2007年第5期《分子植物育種》寧志怨等用藍莓叢生芽的誘導及植株再生即嫩葉的單芽枝培養藍莓植株，當ZT的濃度過高時即超過2.0 mg/L,會形成大量的不定芽，出現一些愈傷組織和玻璃化苗，降低有效苗的數量；2010年第9期《北方園藝》，於強波等用藍莓半質化新稍培養藍莓植株，很容易發生褐化。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種快速培養藍莓胚狀體的方法。本發明的技術方案是:一種藍莓胚狀體培養方法，用長出2-3個月葉子的藍莓作為外植體，配製培養基後，將外植體滅菌和接種，愈傷組織繼代，誘導單細胞，單細胞分化，培養胚狀體。所述配製培養基的配方為:
愈傷組織繼代培養基配方:WPM+ZT0.Γθ.5mg/L +2，4_D I 4mg/L + NAA 0.3 1.4mg/L + 6-BA 1.0^4.0mg/L + 蔗糖 20g/L + PVP 0.5 lg/L + 瓊脂 5.2g/L，PH 5.2 5.8，溫度25 °C，黑暗培養；
單細胞培養配方:WPM + ΖΤΟ.Γθ.5mg/L + 2，4_D I 4mg/L + NAA0.5 1.5mg/L +6-BA1.0 4.011^/1+蔗糖2(^/1 + PVP 0.5 lg/L + 瓊脂 5.2g/L, PH 5.2 5.8，溫度 25°C，黑暗
培養；
單細胞脫分化配方:1/2WPM + 6-BA 1.0 3.0mg/L + NAA0.5 1.6 mg/L + KT 0.Γ .5mg/L + 蔗糖 15 40g/L + PVP 0.5g I g/L, PH 5.2-5.8，溫度 25°C，黑暗培養；
胚狀體培養配方:WPM + ZT 0.1 2mg/L + IBA 1.0^2.0 mg/L+ 瓊脂 5.2g/L，PH
5.2-5.8，溫度25。。，光照12h培養。所述將外植體滅菌和接種的具體操作為:外植體用流水衝洗0.5h,將外植體刷乾淨，加入吐溫幾滴，放在流水下衝洗2(T30min ;處理好的外植體用酒精滅菌lmin，再用升汞滅菌3min，用無菌水洗5 8遍，放入無菌水中待接種；滅菌好的外植體用剪刀減掉邊緣，剪斷葉脈；遠軸面向上接種到誘導愈傷組織培養基上。所述愈傷組織繼代的具體操作為:將誘導出的愈傷組織剪下，接種到愈傷組織培養基上繼代培養，將繼代長出的愈傷組織再繼代兩次。所述誘導單細 胞的具體操作為:將繼代好的愈傷組織接種到繼代液體培養基上，加入珍珠巖，以200轉/分鐘震蕩培養。所述單細胞分化的具體操作為:從搖床上取出單細胞培養液，靜置，取上層清液，然後接入單細胞誘導液體培養基，放在搖床上溫度設成:25°C，轉數200轉/min，黑夜培養三天。所述胚狀體培養的具體操作為:震蕩培養2-3d後瓶中出現渾濁，光強調為5000勒克斯，再靜置培養12h，然後取上層清液接種到單細胞誘導培養基上，培養5-8d。本發明的有益效果是:利用藍莓葉子誘導到藍莓的愈傷組織，再將愈傷組織培養出單細胞，再將單細胞誘導出藍莓胚狀體，利用藍莓的胚狀體來培養藍莓植株，減少不定芽和玻璃化苗的形成，提高有效苗的數量；採用PVP就可以使得愈傷組織不發生褐化，這對藍莓愈傷組織很適用。培養速度快，可以在五個月內培養出十萬支藍莓組培苗；.培養出來的苗木長勢基本一樣；培養出的苗木植株品質較高，植物病毒比較少。
具體實施例方式實施例1 一種藍莓胚狀體培養方法，用生長在東北長白山野生藍莓為材料，用長出2-3個月葉子作為外植體，配製培養基後，將外植體滅菌和接種，愈傷組織繼代，誘導單細胞，單細胞分化，培養胚狀體。所述配製培養基的配方為:愈傷組織繼代培養基配方:WPM+ZT0.1mg/L +2，4-D lmg/L + NAA 0.3mg/L + 6-BA 1.0mg/L + 蔗糖 20g/L + PVP 0.5g/L + 瓊脂5.2g/L，PH 5.2，溫度 25°C，黑暗培養；單細胞培養配方:WPM + ΖΤΟ.lmg/L + 2, 4-D lmg/L + NAA0.5mg/L +6-BA 1.0mg/L+蔗糖 20g/L + PVP 0.5g/L + 瓊脂 5.2g/L, PH 5.2，溫度 25°C，黑暗培養；單細胞脫分化配方:1/2WPM + 6-BA 1.0mg/L + NAA0.5 mg/L + KT 0.1mg/L +蔗糖15g/L + PVP 0.5g g/L, PH 5.2，溫度25°C，黑暗培養；胚狀體培養配方:WPM+ ZT 0.lmg/L + IBA 1.0 mg/L+瓊脂 5.2g/L，PH 5.2，溫度 25°C，光照 12h 培養。將外植體滅菌和接種的具體操作為:外植體用流水衝洗0.5h，將外植體刷乾淨，加入吐溫幾滴，放在流水下衝洗2(T30min ;處理好的外植體用酒精滅菌lmin,再用升萊滅菌3min,用無菌水洗51遍，放入無菌水中待接種；滅菌好的外植體用剪刀減掉邊緣，剪斷葉脈；遠軸面向上接種到誘導愈傷組織培養基上。愈傷組織繼代的具體操作為:將誘導出的愈傷組織剪下，接種到愈傷組織培養基上繼代培養，將繼代長出的愈傷組織再繼代兩次。剛誘導出的愈傷組織為綠色帶點黃色，而繼代兩次後愈傷組織變成淡黃色，並且愈傷組織比較疏鬆。在愈傷繼代培養中不能超過五次，超過五次後單細胞不能分化成胚狀體。誘導單細胞的具體操作為:將繼代好的愈傷組織接種到繼代液體培養基上，加入珍珠巖，以200轉/分鐘震蕩培養。加入珍珠巖，是將愈傷組織打成大的細胞團，而大的細胞團在裂成小細胞團，然後再被打成單細胞。所述單細胞分化的具體操作為:從搖床上取出單細胞培養液，靜置，取上層清液，然後接入單細胞誘導液體培養基，放在搖床上溫度設成:25°C，轉數200轉/min，黑夜培養三天。胚狀體培養的具體操作為:震蕩培養2-3d後瓶中出現渾濁，光強調為5000勒克斯，再靜置培養12h，然後取上層清液接種到單細胞誘導培養基上，培養5-8d。固體培養基上又很多密密麻麻的綠點，胚狀體已經開始萌發，培養5-8d培養基表面長出葉子並伴隨著出現根源基，三天後，可以清晰的看見植株的芽和白根，胚狀體培養已經成功。實施例2
一種藍莓胚狀體培養方法，用生長在東北長白山野生藍莓為材料，用長出2-3個月葉子作為外植體，配製培養基後，將外植體滅菌和接種，愈傷組織繼代，誘導單細胞，單細胞分化，培養胚狀體。所述配製培養基的配方為:愈傷組織繼代培養基配方:WPM+ZT0.5mg/L+2，4-D 4mg/L + NAA 1.4mg/L + 6-BA 4.0mg/L + 蔗糖 20g/L + PVP I g/L + 瓊脂 5.2g/L，PH 5.8，溫度 25°C，黑暗培養；單細胞培養配方:WPM + ΖΤΟ.5mg/L + 2, 4-D 4mg/L +NAA 1.5mg/L +6-BA 4.0mg/L+蔗糖 20g/L + PVP I g/L + 瓊脂 5.2g/L，PH 5.8，溫度 25°C，黑暗培養；單細胞脫分化配方:1/2WPM + 6-BA 3.0mg/L + NAAl.6 mg/L + KT 1.5 mg/L +蔗糖40g/L + PVP I g/L, PH 5.8，溫度25°C，黑暗培養；胚狀體培養配方:WPM + ZT
0.1 2mg/L + IBA 2.0 mg/L+瓊脂5.2g/L，PH 5.8，溫度25°C，光照12h培養。將外植體滅菌和接種的具體操作為:外植體用流水衝洗0.5h，將外植體刷乾淨，加入吐溫幾滴，放在流水下衝洗30min ;處理好的外植體用酒精滅菌lmin,再用升萊滅菌3min,用無菌水洗8遍，放入無菌水中待接種；滅菌好的外植體用剪刀減掉邊緣，剪斷葉脈；遠軸面向上接種到誘導愈傷組織培養基上。愈傷組織繼代的具體操作為:將誘導出的愈傷組織剪下，接種到愈傷組織培養基上繼代培養，將繼代長出的愈傷組織再繼代兩次。剛誘導出的愈傷組織為綠色帶點黃色，而繼代兩次後愈傷組織變成淡黃色，並且愈傷組織比較疏鬆。在愈傷繼代培養中不能超過五次，超過五次後單細胞不能分化成胚狀體。誘導單細胞的具體操作為:將繼代好的愈傷組織接種到繼代液體培養基上，加入珍珠巖，以200轉/分鐘震蕩培養。加入珍珠巖，是將愈傷組織打成大的細胞團，而大的細胞團在裂成小細胞團，然後再被打成單細胞。所述單細胞分化的具體操作為:從搖床上取出單細胞培養液，靜置，取上層清液，然後接入單細胞誘導液體培養基，放在搖床上溫度設成:25°C，轉數200轉/min，黑夜培養三天。胚狀體培養的具體操作為:震蕩培養2-3d後瓶中出現渾濁，光強調為5000勒克斯，再靜置培養12h，然後取上層清液接種到單細胞誘導培養基上，培養5-8d。固體培養基上又很多密密麻麻的綠點，胚狀體已經開始萌發，培養5-8d培養基表面長出葉子並伴隨著出現根源基，三天後，可以清晰的看見植株的芽和白根，胚狀體培養已經成功。實施例3
一種藍莓胚狀體培養方法，用生長在東北長白山野生藍莓為材料，用長出2-3個月葉子作為外植體，配製培養 基後，將外植體滅菌和接種，愈傷組織繼代，誘導單細胞，單細胞分化，培養胚狀體。所述配製培養基的配方為:愈傷組織繼代培養基配方:WPM+ZT0.Γθ.5mg/L+2，4-D I 4mg/L + NAA 0.3 1.4mg/L + 6-BA 1.0 4.0mg/L + 蔗糖 20g/L + PVP 0.5 lg/L+瓊脂5.2g/L，PH 5.2 5.8，溫度25°C，黑暗培養；單細胞培養配方:WPM + ΖΤ0.1 0.5mg/L + 2，4-D I 4mg/L + NAA0.5 1.5mg/L +6-BA 1.0 4.0mg/L+蔗糖 20g/L + PVP 0.5 lg/L +瓊脂5.2g/L，PH 5.2 5.8，溫度25°C，黑暗培養；單細胞脫分化配方:1/2WPM + 6-BA
1.0 3.0mg/L + NAA0.5 1.6 mg/L + KT 0.Γ .5 mg/L + 蔗糖 15 40g/L + PVP 0.5g Ig/L，PH 5.2-5.8，溫度25°C，黑暗培養；胚狀體培養配方:WPM + ZT 0.1 2mg/L + IBA
1.0 2.0 mg/L+瓊脂5.2g/L，PH 5.2-5.8，溫度25°C，光照12h培養。將外植體滅菌和接種的具體操作為:外植體用流水衝洗0.5h，將外植體刷乾淨，加入吐溫幾滴，放在流水下衝洗2(T30min ;處理好的外植體用酒精滅菌lmin,再用升萊滅菌3min,用無菌水洗5 8遍,放入無菌水中待接種；滅菌好的外植體用剪刀減掉邊緣，剪斷葉脈；遠軸面向上接種到誘導愈傷組織培養基上。愈傷組織繼代的具體操作為:將誘導出的愈傷組織剪下，接種到愈傷組織培養基上繼代培養，將繼代長出的愈傷組織再繼代兩次。剛誘導出的愈傷組織為綠色帶點黃色，而繼代兩次後愈傷組織變成淡黃色，並且愈傷組織比較疏鬆。在愈傷繼代培養中不能超過五次，超過五次後單細胞不能分化成胚狀體。誘導單細胞的具體操作為:將繼代好的愈傷組織接種到繼代液體培養基上，加入珍珠巖，以200轉/分鐘震蕩培養。加入珍珠巖，是將愈傷組織打成大的細胞團，而大的細胞團在裂成小細胞團，然後再被打成單細胞。所述單細胞分化的具體操作為:從搖床上取出單細胞培養液，靜置，取上層清液，然後接入單細胞誘導液體培養基，放在搖床上溫度設成:25°C，轉數200轉/min，黑夜培養三天。胚狀體培養的具體操作為:震蕩培養2-3d後瓶中出現渾濁，光強調為5000勒克斯，再靜置培養12h，然後取上層清液接種到單細胞誘導培養基上，培養5-8d。固體培養基上又很多密密麻麻的綠點，胚狀體已經開始萌發，培養5-8d培養基表面長出葉子並伴隨著出現根源基，三天後，可以清晰的看見植株的芽和 白根，胚狀體培養已經成功。
權利要求
1.一種藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:用長出2-3個月葉子的藍莓作為外植體，配製培養基後，將外植體滅菌和接種，愈傷組織繼代，誘導單細胞，單細胞分化，培養胚狀體。
2.根據權利要求1所述的藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:所述配製培養基的配方為: 愈傷組織繼代培養基配方:WPM+ZT0.Γθ.5mg/L +2，4_D I 4mg/L + NAA 0.3 1.4mg/L + 6-BA 1.0^4.0mg/L + 蔗糖 20g/L + PVP 0.5 lg/L + 瓊脂 5.2g/L，PH 5.2 5.8，溫度25 °C，黑暗培養；單細胞培養配方:WPM + ΖΤΟ.Γθ.5mg/L + 2，4_D I 4mg/L + NAA0.5 1.5mg/L +6-BA1.0 4.0mg/L+ 蔗糖 20g/L + PVP 0.5 lg/L + 瓊脂 5.2g/L，PH 5.2 5.8，溫度 25°C，黑暗培養；單細胞脫分化配方:1/2WPM + 6-BA 1.0 3.0mg/L + NAA0.5 1.6 mg/L + KT 0.Γ .5mg/L + 蔗糖 15 40g/L + PVP 0.5g I g/L，PH 5.2-5.8，溫度 25°C，黑暗培養； 胚狀體培養配方:WPM + ZT 0.1 2mg/L + IBA 1.0^2.0 mg/L+ 瓊脂 5.2g/L，PH5.2-5.8，溫度25。。，光照12h培養。
3.根據權利要求1所述的藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:所述將外植體滅菌和接種的具體操作為:外植體 用流水衝洗0.5h，將外植體刷乾淨，加入吐溫幾滴，放在流水下衝洗2(T30min ;處理好的外植體用酒精滅菌Imin,再用升萊滅菌3min,用無菌水洗5 8遍,放入無菌水中待接種；滅菌好的外植體用剪刀減掉邊緣，剪斷葉脈；遠軸面向上接種到誘導愈傷組織培養基上。
4.根據權利要求1所述的藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:所述愈傷組織繼代的具體操作為:將誘導出的愈傷組織剪下，接種到愈傷組織培養基上繼代培養，將繼代長出的愈傷組織再繼代兩次。
5.根據權利要求1所述的藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:所述誘導單細胞的具體操作為:將繼代好的愈傷組織接種到繼代液體培養基上，加入珍珠巖，以200轉/分鐘震蕩培養。
6.根據權利要求1所述的藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:所述單細胞分化的具體操作為:從搖床上取出單細胞培養液，靜置，取上層清液，然後接入單細胞誘導液體培養基，放在搖床上溫度設成:25°C，轉數200轉/min，黑夜培養三天。
7.根據權利要求1所述的藍莓胚狀體培養方法，其特徵在於:所述胚狀體培養的具體操作為:震蕩培養2-3d後瓶中出現渾濁，光強調為5000勒克斯，再靜置培養12h，然後取上層清液接種到單細胞誘導培養基上，培養5-8d。
全文摘要
本發明公開了一種藍莓胚狀體培養方法，用長出2-3個月葉子的藍莓作為外植體，配製培養基後，將外植體滅菌和接種，愈傷組織繼代，誘導單細胞，單細胞分化，培養胚狀體。利用藍莓葉子誘導到藍莓的愈傷組織，再將愈傷組織培養出單細胞，再將單細胞誘導出藍莓胚狀體，利用藍莓的胚狀體來培養藍莓植株，減少不定芽和玻璃化苗的形成，提高有效苗的數量；採用PVP就可以使得愈傷組織不發生褐化，這對藍莓愈傷組織很適用。培養速度快，可以在五個月內培養出十萬支藍莓組培苗；.培養出來的苗木長勢基本一樣；培養出的苗木植株品質較高，植物病毒比較少。
文檔編號A01H4/00GK103181323SQ20111045053
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者王安亭, 王祖華, 李永程, 關潤伶, 黃向東 申請人:洛陽理工學院