檢測sars冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒的製作方法
2023-05-15 02:20:11
專利名稱：檢測sars冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及人類醫學衛生領域，尤其涉及一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒。
背景技術：
2002年底在世界各地爆發了導致全球150多人死亡的非典型肺炎，這次流行的非典型肺炎是一種急性呼吸道傳染病，國外稱其為重症急性呼吸症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳播快，病死率高達4.9％。目前涉及到世界近30個國家和地區，全球患者已達3389多例，且發病人數仍有不斷增加的趨勢。
美國疾病控制和預防中心的專家利用「非典」患者的組織樣本，藉助電子顯微鏡分離並判定「非典」病原體可能是新型冠狀病毒。幾乎同時，包括中國、新加坡、加拿大、德國在內的幾個實驗室也都確認了這種新型冠狀病毒的存在。
2003年4月16日，世界衛生組織宣布，經過全球10個國家和地區13個實驗室的通力合作，在全球多個國家快速傳染的非典型肺炎(英文名稱為SARS，下文簡稱「非典」)的病原體最終被確認。這是一種冠狀病毒，以前從未在人體中發現過。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分離和確證，對於該病的臨床診斷、治療及預防至關重要，這也是本發明所要解決的問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒。
其具體步驟如下1)利用純化的全病毒裂解液包被一種固相支持物；2)將待檢測的生物學樣本加入經包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結合複合物的條件下孵育；3)清洗去除任何未結合的SARS冠狀病毒抗體；4)加入經標記的針對人抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫複合物的條件下孵育；5)清洗去除任何未結合的第二抗體；6)檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結合複合物的存在。
其試劑盒組成為
1)包被抗原SARS冠狀病毒全病毒裂解液；2)抗原包被板採用國產96孔可拆板，並包被SARS冠狀病毒全病毒裂解液；3)酶標抗體辣根過氧化物酶標記的第二抗體(IgG或IgM)；4)陰性對照及陽性對照血清含0.05％硫柳汞，0.01％疊氮鈉；5)酶標抗體工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀釋液將酶標抗體稀釋至適當的效價；6)底物液A0.06％過氧化脲的0.01M pH4.5檸檬酸緩衝液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5檸檬酸緩衝液；7)終止液1M硫酸；8)洗滌液PBS，含0.1％吐溫-20；9)間接法檢測SARS冠狀病毒抗體試劑盒說明書一份。
本發明解決了臨床對SARS冠狀病毒感染者的快速診斷問題，具有較高的準確性，為臨床檢測該病提供了快速、準確的診斷方法。
圖1是SARS冠狀病毒全病毒裂解液抗原的SDS-PAGE結果示意圖；圖2是酶標第二抗體為IgG時cut-off態分布示意圖。
具體實施例方式
本發明所述的生物學樣本是指來自受試者(包括患者和陰性對照)的血液、血清、血漿、尿樣、體液、唾液和其它分泌物或排洩物以及組織或細胞提取物。
針對人抗體的第二抗體可以是用放射性同位素標記的(即RIA)，也可以是用辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶進行標記的(即ELISA)。
所述第二抗體可以是抗人-IgG或/和-IgM或/和-IgA抗體。這些第二抗體可以從市場上購得，如綿羊抗人-IgG或/和-IgM、山羊抗人-IgG或/和-IgM、小鼠抗人-IgG或/和-IgM、大鼠抗人-IgG或/和-IgM、兔抗人-IgG或/和-IgM等。
利用不同的第二抗體可以檢測出樣本中特定的抗體是否存在，以及不同抗體的相對存在量。由於在SARS冠狀病毒感染的不同時期IgG和IgM在人體內的相對量不同，利用不同的第二抗體進行多次檢測有助於判定患者的病程。
所述的「固相支持物」包括本領域周知的有機和無機多聚物，諸如包括但不局限於葡聚糖、天然或經修飾的纖維素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺，瓊脂糖，乳膠，容器內壁如試管、滴定板、玻璃杯等。
可使用本領域周知的多種方法包被固相支持物。例如利用雙功能試劑活化，參見美國專利5399501。
所述的「適合形成抗原抗體免疫複合物的條件」為本領域周知，是指在適當的溫度及時間條件下孵育抗原與含抗體的樣品的混合物，例如在約0-50攝氏度，優選約4-30攝氏度下，標記約20分鐘至約48小時，優選標記約20分鐘至約4小時。
經孵育形成抗原抗體免疫複合物後，用本領域常用的適當洗滌溶液洗滌檢測板數次，以清除未結合的經標記的抗原。所用清洗液一般為pH約5-8，優選為pH約7.4的磷酸鹽緩衝溶液。
可採用多種本領域周知的方法定量檢測抗原抗體複合物的形成。根據標記第二抗體所使用的方法，選擇適當的定量檢測方案。本發明一個優選的實施方案中，標記抗原時使用辣根過氧化物酶，所以使用以過氧化物溶液為A液及聯苯胺類物質為B液的底物與帶有含標記的辣根過氧化物酶的抗原抗體免疫複合物作用，顯色後在波長為450nm(參比波長630nm)酶標儀讀取吸光值。將所得讀數與陰性對照的讀數加以比較，判斷所測樣本的結果。
利用本發明的SARS冠狀病毒全病毒裂解液作為抗原，通過免疫法檢測個體生物學樣本中SARS冠狀病毒抗體的方法還包括本領域中常規使用的利用特定抗原檢測抗體的其它方法。
本發明也涉及用於這些方法檢測SARS冠狀病毒抗體的檢測試劑盒。根據本發明檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑盒包括用純化的本發明經修飾的重組非典型性肺炎病毒蛋白質作為抗原包被的固相支持物；和使用該試劑盒的說明。還包括如上文所述標記的第二抗體。該第二抗體可以是抗IgG抗體和/或抗IgM和/或抗IgA抗體。在上述檢測試劑盒中，還可以含有提供判斷檢測結果的相應的範圍。SARS冠狀病毒全病毒裂解液是採用Vero-E6細胞接種病毒後培養，經超聲裂解純化而得到的。
下列實施例詳細解釋本發明，但這並不限制本發明的範圍。實施例1、SARS冠狀病毒全病毒裂解液的製備及鑑定1、將病毒直接接種Vero E6後，每天觀察病變，當表現為聚集，圓形細胞，折光，並出現散在細胞脫落時，將細胞在-20C反覆凍溶2此，離心取上清。
2、SARS冠狀病毒純化過程，得到SARS冠狀病毒全裂解液。
1)上述上清進行超聲破碎(功率150W，超聲時間2秒，間歇時間4秒，60個循環)；2)13000RPM離心20分鐘；
3)置入透析袋進行透析(cut-off10000)；4)採用PEG20000濃縮樣品約6-7倍；5)將濃縮樣品轉移至潔淨試管；6)超聲破碎(功率150W，超聲時間2秒，間歇時間4秒，60個循環)；7)13000RPM離心10分鐘；除去不溶物；8)加入固體尿素至濃度為6M；9)超聲破碎(功率150W，超聲時間2秒，間歇時間4秒，60個循環)；10)13000RPM離心10分鐘，除去不溶物。得到SARS冠狀病毒全病毒裂解液。
3、純度鑑定以VERO-E6 CELL超聲粉碎的細胞液和全病毒裂解液同時進行SDS-PAGE電泳測定，濃縮膠濃度5％，分離膠濃度為10％，樣品上樣量為10μg。對照細胞及中毒細胞條帶應有明顯差異；比活用1μg/ml抗原包被的微孔板條，用質控P1號血清進行檢定，定義A值等於0.2時抗原比活為一個單位(IU)，比活應大於10IU。SARS冠狀病毒全病毒裂解液抗原的SDS-PAGE結果見附圖1。實施例2、SARS冠狀病毒全病毒裂解液包被固相支持物96孔板條選用吸附性良好的聚苯乙烯板(孔間，板間和批間差CV＜10％)，選用0.05M pH9.6碳酸鹽緩衝液(CB)為包被液，每孔加入按照實驗設計濃度配好抗原的包被液100微升，室溫包被過夜。然後棄去抗原液，包被板用含有0.5％TW-20的0.02M PBS洗滌液(PBS-T)洗兩次，拍幹，加入1％牛血清白蛋白(BSA)和1％脫脂奶粉的0.02M pH7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)室溫封閉2小時。棄去封閉液，風乾包被板，鋁箔袋真空包裝4℃保存。用內控SARS冠狀病毒血清進行效價滴定，用間接法測定用於包被的SARS冠狀病毒抗原效價，結果見表1，結果確定用於包被的SARS冠狀病毒抗原的效價為1∶60。
表1.用於包被的SARS冠狀病毒抗原效價滴定結果。
實施例3、酶標用抗人IgG、IgM的辣根過氧化物酶標記及鑑定酶標用抗人IgG、IgM經檢定合格後用於酶標記。辣根過氧化物酶購自Sigma公司，RZ＞3.0。標記方法採用改良過碘酸鈉法。
激活HRP稱取5mg HRP，溶於1ml 0.2M pH5.6醋酸鹽緩衝液中，加入新鮮配製的0.1M NaIO4 0.25ml，充分混勻，置於磁力攪拌器上充分反應，避光反應(150rpm)20分鐘，用1mM pH4.4的醋酸鹽緩衝液4℃充分透析24小時以除去小分子的雜質。
與抗人IgG/IgM抗體的交聯上述激活後的HRP中加入1/4體積1.0M pH9.6碳酸鹽緩衝液，調節pH值至9.6(HRP濃度變為4mg/ml)。取1.25mg抗人IgG/IgM加入1/4體積的1.0M pH9.6碳酸鹽緩衝液調節pH值至9.6，將抗人IgG/IgM溶液緩慢加入到激活的HRP中，室溫，避光反應2小時。
還原Shiff鹼將上述交聯後的產物中加入0.01ml 5mg/ml的NaBH4，充分混勻後4℃避光靜置2小時。
除去小分子雜質將上述的交聯產物對0.01MpH7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)充分透析16小時。
去除游離未標記的HRP從透析袋取出液體，緩慢加入等體積的飽和(NH4)2SO4，充分混勻後4℃靜置過夜，離心4000rpm 20分鐘，收集沉澱，用0.01MpH7.4的PBS溶解沉澱，對0.01M pH7.4 PBS充分透析16小時。
標記抗體經Sephadex G-50柱層析，收集第一峰，合併樣品管，濃縮。
保存加入等體積滅菌甘油，-20℃保存備用。
酶標記抗體外觀澄清、無混濁、無沉澱。活性檢定用HCV系統檢測酶標記抗體的敏感性和特異性，結果見表2。結果表明該酶標抗體敏感性和特異性良好，可用於SARS系統。
表2.酶標記的抗體活性檢定結果。
實施例4合適的抗原抗體反應條件及時間的確定在上述實施例確定的包被抗原及酶標第二抗體濃度下，採用如前述的酶標板和反應緩衝液，研究適於抗原抗體反應形成免疫結合複合物的條件。選用弱、中、強3個陽性血清及陰性對照，按照實施例6中詳細描述的操作方法進行間接法實驗。通過在37℃條件下分別反應20、30、60、90、120分鐘，標記抗體反應20、30、60分鐘，顯色10分鐘。
1)當酶標第二抗體為IgM時，所測的OD值在60分鐘時達到最高值。故選擇反應時間為60分鐘。
2)當酶標第二抗體為IgG時，所測的OD值在30分鐘時達到最高值。故選擇反應時間為30分鐘。實施例5間接法免疫檢測樣品的陽性閾值cut-off的確定1)酶標第二抗體為IgG按照實施例6所述免疫檢測的方法，檢測300份經間接ELISA法確定為陰性的正常義務獻血員血清，取正態分布值進行統計分析。得均值為0.021，SD為0.004。設定陽性閾值為0.18+陰性對照均值。
檢測1000份正常獻血員隨機血清標本，將S/Co比值進行正態統計分析，同時檢測10份臨床確診SARS的患者血清標本，分析S/Co值，設定Cut-off值。檢測1000份正常獻血員隨機血清標本，陰性對照OD值低於0.05按0.05計算，高於0.05按實際值計算，計算A值，將A值進行正態統計分析，均值為0.05，標準差(SD)為0.044。以均值+3倍標準差＝0.05+3×0.044＝0.182Cut-off值＝0.13+陰性對照A值其正態分布圖見圖2。
據此設定Cut-off值為判定界值。如大於Cutoff為陽性，反之為陰性。同時檢測10份臨床確診為SARS的患者血清標本，均大於Cut-off值。
2)同理，酶標第二抗體為IgM時，計算得Cut-off值為0.14。實施例6、間接法檢測SARS冠狀病毒抗體1)每次試驗設空白對照、陰性對照和陽性對照各1孔。空白孔不加液體；陰、陽性對照無需稀釋直接取50μl加入陰、陽性對照孔中；其餘檢測孔加入樣品稀釋液，每孔100μl，再加入待測樣品10μl。充分混勻，貼上封口膠，置37℃溫育30分鐘。
2)將50倍濃縮洗板液用雙蒸水50倍稀釋後用於洗滌板孔。
3)棄去各孔中樣品，每孔加滿洗液，靜置數秒後棄去，重複5次，拍幹。
4)每孔加入酶標抗人IgG工作液100μl，貼上封口膠。置37℃溫育20分鐘。
5)棄去各孔中液體，用洗板液反覆洗滌5次，拍幹。
6)每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，輕拍混勻，置37℃避光溫育10分鐘。
7)顯色完畢後，每孔加入終止液50μl，輕拍混勻，立即以空白孔調零，置酶標儀450nm波長下測定OD值(參考波長為630nm)。實施例7、SARS冠狀病毒檢測試劑盒的組成本發明優選的SARS冠狀病毒檢測試劑盒由以下幾個部分組成包被抗原SARS冠狀病毒全病毒裂解液；抗原包被板為國產96孔可拆板，按照實施例4所述包被SARS冠狀病毒全病毒裂解液；酶標抗體辣根過氧化物酶標記的第二抗體(IgG或IgM)；陰性對照及陽性對照血清各0.2毫升，含0.05％硫柳汞，0.01％疊氮鈉；酶標抗體工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀釋液將酶標抗體稀釋至適當的效價。
底物液A0.06％過氧化脲的0.01M pH4.5檸檬酸緩衝液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5檸檬酸緩衝液；終止液1M硫酸洗滌液50×PBS，含0.1％吐溫-20；抗SARS冠狀病毒陽性血清OD值當在0.13(IgG)陰性對照均值以上。
抗SARS冠狀病毒陰性血清OD值當在0.13(IgG)以下。
抗SARS冠狀病毒陽性血清OD值當在0.11(IgM)陰性對照均值以上。
抗SARS冠狀病毒陰性血清OD值當在0.11(IgM)以下。
間接法檢測SARS冠狀病毒抗體試劑盒說明書一份。
權利要求
1.一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於具體檢測步驟如下1)利用純化的全病毒裂解液包被一種固相支持物；2)將待檢測的生物學樣本加入經包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結合複合物的條件下孵育；3)清洗去除任何未結合的SARS冠狀病毒抗體；4)加入經標記的針對人抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫複合物的條件下孵育；5)清洗去除任何未結合的第二抗體；6)檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結合複合物的存在。
2.根據權利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於所說的生物學樣本是指來自受試者的血液、血清、血漿、尿樣、體液、唾液和其它分泌物或排洩物以及組織或細胞提取物。
3.根據權利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於所說的固相支持物包括有機和無機多聚物。
4.根據權利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於所說的適合形成抗原抗體免疫複合物的條件，是指可以孵育抗原與含抗體的樣品的混合物的適當的溫度及時間條件，其中溫度為0-50攝氏度，時間約20分鐘至約48小時。
5.根據權利要求4所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於所說的權利要求4中所述的條件，其中溫度為4-30攝氏度，時間為20分鐘至4小時。
6.根據權利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於所說的第二抗體是抗IgG抗體和/或抗IgM或IgA抗體。
7.根據權利要求1所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，其特徵在於所說的第二抗體是用放射性同位素標記的，或者是用辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶進行標記。
8.一種檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑盒，其特徵在於其試劑盒組成為1)包被抗原SARS冠狀病毒全病毒裂解液；2)抗原包被板採用為國產96孔可拆板，並包被SARS冠狀病毒全病毒裂解液3)酶標抗體辣根過氧化物酶標記的第二抗體(IgG或IgM或IgA)；4)陰性對照及陽性對照血清含0.05％硫柳汞，0.01％疊氮鈉；5)酶標抗體工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀釋液將酶標抗體稀釋至適當的效價；6)底物液A0.06％過氧化脲的0.01M pH4.5檸檬酸緩衝液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5檸檬酸緩衝液；7)終止液1M硫酸；8)洗滌液PBS，含0.1％吐溫-20；9)間接法檢測SARS冠狀病毒抗體試劑盒說明書一份。
9.根據權利要求8所述的一種檢測SARS冠狀病毒抗體的試劑盒，其特徵在於所說的SARS冠狀病毒全病毒裂解液是採用Vero-E6細胞接種病毒後培養，經超聲裂解純化而得到的。
全文摘要
本發明提供了公開了一種檢測SARS冠狀病毒抗體的方法及其試劑盒。具體檢測步驟如下(1)利用純化的全病毒裂解液包被一種固相支持物；(2)將待檢測的生物學樣本加入經包被的固相支持物上，在適合形成抗原抗體免疫結合複合物的條件下孵育；(3)適度清洗去除任何未結合的SARS冠狀病毒抗體；(4)加入經標記的針對人抗體的第二抗體，在適合形成抗原抗體免疫複合物的條件下孵育；(5)適度清洗去除任何未結合的第二抗體；(6)定量檢測孵育混合物中抗原抗體免疫結合複合物的存在。本發明解決了臨床對SARS冠狀病毒感染者的快速診斷問題，具有較高的準確性，為臨床檢測該病提供了快速、準確的診斷方法。
文檔編號G01N33/536GK1469126SQ0311666
公開日2004年1月21日 申請日期2003年4月26日 優先權日2003年4月26日
發明者汪建, 祝慶餘, 方健秋, 秦鄂德, 文潔, 於曼, 牟峰, 司炳銀, 陳唯軍, 劉斯奇, 胡詠武, 殷劍寧, 王俊, 楊煥明, 汪 建 申請人:杭州華大基因研發中心, 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所