一種細胞培養裝置及方法
2023-05-14 08:11:46
專利名稱：一種細胞培養裝置及方法
技術領域：
本發明涉及細胞體外培養，特別是涉及一種大規模自動培養細胞的細胞培養裝置 及方法。
背景技術：
惡性腫瘤是目前危害人類身體健康的主要疾病之一，1990年，惡性腫瘤已成為中 國人病死率第一位的疾病，到2008年，年間每10萬人中有153. 6人因惡性腫瘤死亡，佔病 死率的27. 12%，高於心臟病、腦血管疾病的19. 65%和19. 62%。目前，惡性雖通過外科根治 性切除，結合放射線治療和化學藥物治療，依然有近50%癌正患者死於術後復發和轉移。而 放療和化療雖然能夠作用於無法進行手術治療的腫瘤，但均具有嚴重的副作用，對機體組 織傷害大，而且某些腫瘤細胞對其不敏感，療效也不理想。免疫細胞治療作為一種癌症新型治療手段，得到日益廣泛的應用。免疫細胞治療 是指將自身或異體的抗腫瘤效應細胞的前體細胞，在體外採用激活劑進行誘導、激活和擴 增，然後輸入給腫瘤患者，從而提高患者的抗腫瘤免疫力，以達到治療和預防復發的目的。 與傳統的治療方法相比，該方法具有療效確切、對人體損傷小、不良反應低、療效維持時間 長以及能有效防止術後復發等優點。然而抗癌免疫細胞的培養不同於藥物生產，免疫細胞無法滅菌處理，因此要求更 高的無菌操作環境和無菌操作技術。抗癌免疫細胞的生產既受患者個體差異的影響，也受 培養技術的限制。如何進行免疫細胞的大規模培養是免疫細胞治療的新挑戰。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是彌補上述現有技術的不足，提出一種細胞培養裝 置及方法，可進行細胞的大規模批量生產。本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決
一種細胞培養裝置，包括集成在一個機體內的控制系統、冷藏箱、加液機構、第一離心 機、第二離心機、血漿製備器、培養箱、視頻檢視系統和層流潔淨系統。優選的技術方案中，
所述控制系統控制所述加液機構、所述第一離心機、所述第二離心機、所述血漿製備 器、所述培養箱和所述視頻檢視系統的工作，並設置所述培養箱和所述冷藏箱內的環境；所 述冷藏箱用於存放細胞培養所需的材料；所述加液機構在所述控制系統的控制下將材料定 量加入到相應的器皿中；所述第一離心機對加入的血液進行分離、漂洗和收集；所述第二 離心機對培養好的細胞進行出庫前的清洗和分離；所述血漿製備器對所述第一離心機分離 得到的血漿進行血漿激活；所述培養箱用於細胞的培養繁殖；所述視頻檢視系統用於觀察 所述培養箱內細胞的生長狀態；所述層流潔淨系統控制所述培養裝置內的潔淨度。所述控制系統控制所述加液機構、所述第一離心機和所述血漿製備器針對不同來 源的血液依次製備各來源血液的淋巴細胞和激活血漿，並控制所述加液機構將製備的所述淋
3巴細胞和激活血漿按來源不同分別送入所述培養箱中不同的培養瓶中同時進行誘導培養，並 待誘導期培養結束後將不同來源的細胞溶液轉移至不同的培養袋中同時進行生長期培養。所述血漿製備器包括加熱裝置和離心裝置；所述加熱裝置用於對所述離心機分離 得到的血漿進行加熱至56°C，並保持該溫度30-60min ；所述控制系統控制所述加液機構將 加熱後的血漿送入4攝氏度條件下冷卻30-60min後送入所述離心裝置，所述離心裝置用於 對冷卻後的血漿進行離心操作。所述培養箱為水車式轉動二氧化碳培養箱，所述控制系統設置所述水車式轉動二 氧化碳培養箱內溫度為25-37攝氏度，控制所述水車式轉動二氧化碳培養箱內空氣中二氧 化碳的體積濃度百分比為5%。所述冷藏箱包括兩個冷藏櫃，所述控制系統設置其中一個冷藏櫃的溫度為-20攝 氏度，設置另一個冷藏櫃的溫度為4攝氏度。所述控制系統、冷藏箱、加液機構、離心機、血漿製備器、培養箱和視頻檢視系統集 成在超淨工作空間內。所述冷藏箱、離心機、培養箱、視頻檢視系統設置在萬級超淨工作櫃內部，所述加 液機構設置在百級超淨工作櫃內部。本發明的技術問題通過以下進一步的技術方案予以解決
一種細胞培養方法，包括以下步驟1)取血液導入離心機中分離得到血漿及血細胞； 2)將步驟1)中分離得到的血漿進行血漿激活得到激活血漿；3)將步驟1)中分離得到的血 細胞中加入緩衝液、分離液後重新導入所述離心機中分離，得到中層淋巴細胞溶液；4)所述 淋巴細胞溶液中的淋巴細胞經培養液漂洗後，加入誘導培養液和所述激活血漿後進行誘導 培養；5)誘導培養期完成後將步驟4)中細胞溶液轉移至大規模培養瓶或培養袋中，加入培 養液及所述激活血漿，進行生長期培養；6)待生長期培養完成後使用生理鹽水稀釋漂洗淋 巴細胞，進行質量檢測、出庫。優選的技術方案中，
所述步驟2)中血漿激活包括如下步驟2-1)將分離得到的血漿加熱至56°C，保持該溫 度30-60min ；2_2)將加熱後的血漿在4°C條件下冷卻30-60min ；2_3)將冷卻後的血漿進行 離心操作。本發明與現有技術對比的有益效果是
本發明的細胞培養裝置及方法，將細胞培養所需的部件，如控制系統、冷藏箱、加液機 構、離心機、培養箱、視頻檢視系統和層流潔淨系統均集成在一個機體內的，可實現細胞的 培養生產。同時裝置中集成有血漿製備器，用於進行血漿的激活得到激活血漿，進行細胞培 養時，在誘導期以及生長培養期均加入激活血漿，由於激活血漿與被培養細胞同源，可使被 培養細胞更易接受培養環境，從而提高培養細胞的產量。另外，由於本發明中，細胞培養裝 置的各個部件均集成在一起，無需特殊的空間環境場所，整個過程全部有裝置自動執行，隔 離人體接觸，減少操作汙染的機會，最大程度保障細胞培養過程的清潔，可提高培養出的細 胞的質量。
圖1是本發明具體實施方式
中細胞培養裝置的結構示意圖；圖2是本發明具體實施方式
中細胞培養裝置的各部件在控制系統的控制下的工作流 程圖3是本發明具體實施方式
中細胞培養方法的流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
並對照附圖對本發明做進一步詳細說明。本具體實施方式
中細胞培養裝置的結構示意圖如圖1所示，包括控制系統、冷藏 箱、加液機構、第一離心機、第二離心機、血漿製備器、培養箱、視頻檢視系統、層流潔淨系統 和廢液箱，上述部件均集成在機體內。其中，細胞培養裝置所需的材料，如血液、緩衝液、分離液、培養液、誘導培養液、生 理鹽水等，通過入庫接口進入裝置內冷藏箱中儲藏。培養好的細胞溶液通過出庫接口轉移 出去。控制系統控制加液機構、離心機、培養箱和視頻檢視系統的工作，並設置培養箱和 冷藏箱內的環境。優選地，冷藏箱包括兩個冷藏櫃，控制系統設置其中一個冷藏櫃的溫度 為-20攝氏度，用於儲藏血液、緩衝液、分離液、生理鹽水等；控制系統設置另一個冷藏櫃的 溫度為4攝氏度，用於儲藏培養液和誘導培養液。而培養箱為水車式轉動二氧化碳培養箱， 通過培養箱的轉動使得培養液流動，可提高被培養的細胞的活力，從而提高培養成功率和 效率。控制系統設置水車式轉動二氧化碳培養箱內溫度為25-37攝氏度，控制箱內空氣中 二氧化碳的體積濃度百分比為5%。加液機構在控制系統的控制下將材料定量加入到相應的器皿中。離心機對加入的細胞進行分離、漂洗和收集。血漿製備器對離心機分離得到的血漿進行血漿激活，該激活後的血漿作為後續細 胞的誘導培養期和生長期的材料之一。優選地，血漿製備器包括加熱裝置和離心裝置；加熱 裝置和離心裝置均在控制系統的控制下進行相應操作。培養箱用於細胞的培養繁殖。視頻檢視系統用於觀察培養箱內細胞的生長狀態。層流潔淨系統控制整個培養裝置內的潔淨度，包括對空氣和相關物品的消毒。優選地，控制系統、冷藏箱、加液機構、離心機、血漿製備器、培養箱和視頻檢視系 統集成在超淨工作空間內。進一步優選地，冷藏箱、離心機、培養箱、視頻檢視系統設置在萬 級超淨工作櫃內部，加液機構設置在百級超淨工作櫃內部。各部件在控制系統控制下，工作流程如圖2所示，包括以下步驟
1)分離離心加液機構從冷藏箱中取一定量的血液導入離心機中，離心機對加入的血 液進行離心分離操作，得到血漿和血細胞。2)激活血漿加液機構將上層血漿導入血漿製備器中進行血漿激活，該激活的血 漿由加液機構移送至冷藏箱中存儲，控制系統記錄激活後血漿的儲存位置。具體地，血漿激活步驟包括加熱裝置將上層血漿加熱至56 °C，保持該溫度 30-60min ；然後控制系統控制加液機構將加熱後的血漿送入4攝氏度條件下冷卻30-60min 後送入離心裝置，離心裝置對冷卻後的血漿進行離心操作。對離心操作後的血漿抽取上層 血漿溶液，該上層血漿溶液即為激活的血漿。
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3)分離血細胞溶液加液機構從冷藏箱中取一定量的緩衝液、分離液加入到上述 剩餘的血細胞溶液中，由離心機離心分離得到淋巴細胞溶液，剩餘溶液回收至廢液箱。4)漂洗淋巴細胞由加液機構從冷藏箱中取一定量培養液對離心機的離心瓶中的 淋巴細胞溶液進行漂洗。5)誘導期培養由加液機構從冷藏箱中取一定量誘導培養液、過程2)中的激活血 漿以及步驟4)中離心瓶中漂洗後的淋巴細胞至水車式轉動二氧化碳培養箱的培養瓶內進 行誘導期培養。於此同時，控制系統記錄培養瓶的儲存位置。6)生長期培養待誘導期培養完成後，加液機構將水車式轉動二氧化碳培養箱的 培養瓶中的細胞溶液轉移至水車式轉動二氧化碳培養箱的培養袋中，並從冷藏箱中取一定 量誘導培養液、過程2)中的激活血漿加入其中，進行生長期培養。7)分離細胞溶液待生長期培養完成後，加液機構將水車式轉動二氧化碳培養箱 的培養袋中的細胞溶液轉移至離心機進行分離，得到含有大批量細胞的細胞溶液，廢液由 離心瓶底部接口到處至廢液箱。8)衝洗細胞加液機構從冷藏箱中取一定量生理鹽水，衝洗離心瓶內細胞，衝洗後 由離心機進行分離操作得到細胞和清洗液，清洗液由離心瓶底部接口到處至廢液箱。9)稀釋細胞加液機構從冷藏箱中取一定量生理鹽水，稀釋離心瓶內細胞，得到細 胞生理鹽水溶液。10)出庫加液機構將離心瓶內細胞生理鹽水溶液，通過出庫接口轉移至出庫容 器，完成出庫。整個工作過程中，可以通過視頻檢視系統監控操作過程以及細胞的培養狀況。在 培養過程中，也可以通過控制系統修改培養計劃，隨時調整細胞的培養過程。另一方面，也 可通過控制系統的控制實現不同來源，如a病人個體和b病人個體的血液的同時培養。具 體地，通過控制系統先控制加液機構、第一離心機和血漿製備器針對a個體和b個體的血液 依次製備a病人個體的淋巴細胞和激活血漿、b病人個體的淋巴細胞和激活血漿，並控制加 液機構將製備的a病人個體的淋巴細胞和激活血漿送入培養箱中的一個培養瓶中，將製備 的b病人個體的淋巴細胞和激活血漿送入培養箱中的另一個培養瓶中，同時進行a病人個 體和b病人個體細胞的誘導培養。待誘導期培養結束後將a病人個體和b病人個體的細胞 溶液轉移至不同的培養袋中同時進行生長期培養，從而實現不同源細胞的同時培養，節約 培養時間。本具體實施方式
中，細胞培養裝置中集成有血漿製備器，能激活血漿。在誘導期以 及生長培養期均加入激活血漿到細胞培養溶液中，由於激活血漿與被培養細胞同源，可使 被培養細胞更易接受培養環境，從而提高培養細胞的產量。另一方面，由於細胞培養裝置的 各個部件均集成在一起，無需特殊的空間環境場所，整個過程全部有裝置自動執行，隔離人 體接觸，減少操作汙染的機會，最大程度保障細胞培養過程的清潔，可提高培養出的細胞的 質量。本具體實施方式
在，還提出一種細胞培養方法，包括以下步驟1)取血液導入離心 機中分離得到血漿及血細胞；2)將步驟1)中分離得到的血漿進行血漿激活得到激活血漿； 3)將步驟1)中分離得到的血細胞中加入緩衝液、分離液後重新導入離心機中分離，得到中 層淋巴細胞溶液；4)淋巴細胞溶液中的淋巴細胞經培養液漂洗後，加入誘導培養液和激活血漿後進行誘導培養；5)誘導培養期完成後將步驟4)中細胞溶液轉移至大規模培養瓶或 培養袋中，加入培養液及激活血漿，進行生長期培養；6)待生長期培養完成後使用生理鹽水 稀釋漂洗淋巴細胞，進行質量檢測、出庫。優選地，步驟2)中血漿激活包括如下步驟2-1)將分離得到的血漿加熱至56°C， 保持該溫度30-60min ；2_2)將加熱後的血漿在4°C條件下冷卻30-60min ；2_3)將冷卻後的 血漿進行離心操作。抽取離心後的上層血漿溶液，該上層血漿溶液即為激活的血漿。如圖3所示，為針對50ml的血液，採用本具體實施方式
的細胞培養方法進行大批 量細胞培養生產的流程示意圖
1)抽取50ml血並離心分離，分離過程中採用光照、視頻觀察。2)進行血漿激活抽取25ml上層溶液，加熱至56°C，保持該溫度30-60min ；於4°C 條件下冷卻30-60min ；離心操作，抽取23ml上層血漿溶液，該上層血漿溶液即為激活的血 漿。3)分離血漿溶液將步驟1)剩餘的25ml下層溶液加入25ml緩衝液混合，加入50 分離液離心，抽取中層淋巴細胞溶液。分離過程中也採用光照、視頻觀察。4)淋巴細胞經培養液漂洗3次後，加入培養液和步驟2)中的血漿，置入培養瓶，培 養3-7天。5)待誘導培養期結束後，將步驟4)中的細胞溶液轉移至生產培養袋培養，每3天 田炯培養液、血漿，培養約14- 天。6)待生長期培養結束後，離心細胞溶液，用生理鹽水漂洗淋巴細胞3次。7)再次加入生理鹽水混合稀釋淋巴細胞，進行質量檢測、出庫。由於本具體實施方式
中，增加激活血漿的步驟，在後續進行誘導期培養和生長期 培養時均加入激活血漿，可提高培養出的細胞的產量。以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下做出若干替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當視為 屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種細胞培養裝置，其特徵在於包括集成在一個機體內的控制系統、冷藏箱、加液 機構、第一離心機、第二離心機、血漿製備器、培養箱、視頻檢視系統和層流潔淨系統。
2.根據權利要求1所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述控制系統控制所述加液機 構、所述第一離心機、所述第二離心機、所述血漿製備器、所述培養箱和所述視頻檢視系統 的工作，並設置所述培養箱和所述冷藏箱內的環境；所述冷藏箱用於存放細胞培養所需的 材料；所述加液機構在所述控制系統的控制下將材料定量加入到相應的器皿中；所述第一 離心機對加入的血液進行分離、漂洗和收集；所述第二離心機對培養好的細胞進行出庫前 的清洗和分離；所述血漿製備器對所述第一離心機分離得到的血漿進行血漿激活；所述培 養箱用於細胞的培養繁殖；所述視頻檢視系統用於觀察所述培養箱內細胞的生長狀態；所 述層流潔淨系統控制所述培養裝置內的潔淨度。
3.根據權利要求2所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述控制系統控制所述加液機 構、所述第一離心機和所述血漿製備器針對不同來源的血液依次製備各來源血液的淋巴細 胞和激活血漿，並控制所述加液機構將製備的所述淋巴細胞和激活血漿按來源不同分別送 入所述培養箱中不同的培養瓶中同時進行誘導培養，並待誘導期培養結束後將不同來源的 細胞溶液轉移至不同的培養袋中同時進行生長期培養。
4.根據權利要求1所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述血漿製備器包括加熱裝置 和離心裝置；所述加熱裝置用於對所述離心機分離得到的血漿進行加熱至56°C，並保持該 溫度30-60min ；所述控制系統控制所述加液機構將加熱後的血漿送入4攝氏度條件下冷卻 30-60min後送入所述離心裝置，所述離心裝置用於對冷卻後的血漿進行離心操作。
5.根據權利要求1所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述培養箱為水車式轉動二氧 化碳培養箱，所述控制系統設置所述水車式轉動二氧化碳培養箱內溫度為25-37攝氏度， 控制所述水車式轉動二氧化碳培養箱內空氣中二氧化碳的體積濃度百分比為5%。
6.根據權利要求1所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述冷藏箱包括兩個冷藏櫃，所 述控制系統設置其中一個冷藏櫃的溫度為-20攝氏度，設置另一個冷藏櫃的溫度為4攝氏 度。
7.根據權利要求1所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述控制系統、冷藏箱、加液機 構、離心機、血漿製備器、培養箱和視頻檢視系統集成在超淨工作空間內。
8.根據權利要求7所述的細胞培養裝置，其特徵在於所述冷藏箱、離心機、培養箱、視 頻檢視系統設置在萬級超淨工作櫃內部，所述加液機構設置在百級超淨工作櫃內部。
9.一種細胞培養方法，其特徵在於包括以下步驟1)取血液導入離心機中分離得到 血漿及血細胞；2)將步驟1)中分離得到的血漿進行血漿激活得到激活血漿；3)將步驟1) 中分離得到的血細胞中加入緩衝液、分離液後重新導入所述離心機中分離，得到中層淋巴 細胞溶液；4)所述淋巴細胞溶液中的淋巴細胞經培養液漂洗後，加入誘導培養液和所述激 活血漿後進行誘導培養；5)誘導培養期完成後將步驟4)中細胞溶液轉移至大規模培養瓶 或培養袋中，加入所述培養液及所述激活血漿，進行生長期培養；6)待生長期培養完成後使 用生理鹽水稀釋漂洗淋巴細胞，進行質量檢測、出庫。
10.根據權利要求9所述的細胞培養方法，其特徵在於所述步驟2)中血漿激活包括 如下步驟2-1)將分離得到的血漿加熱至56°C，保持該溫度30-60min ；2-2)將加熱後的血 漿在4°C條件下冷卻30-60min ；2-3)將冷卻後的血漿進行離心操作。
全文摘要
本發明公開了一種細胞培養裝置，包括集成在一個機體內的控制系統、冷藏箱、加液機構、第一離心機、第二離心機、血漿製備器、培養箱、視頻檢視系統和層流潔淨系統。本發明細胞培養裝置，裝置中集成有血漿製備器，用於進行血漿的激活得到激活血漿，進行細胞培養時，在誘導期以及生長培養期均加入激活血漿，由於激活血漿與被培養細胞同源，可使被培養細胞更易接受培養環境，從而提高培養細胞的產量。另外，由於本發明細胞培養裝置的各個部件均集成在一起，無需特殊的空間環境場所，整個過程全部有裝置自動執行，隔離人體接觸，減少操作汙染的機會，最大程度保障細胞培養過程的清潔，可提高培養出的細胞的質量。
文檔編號C12M3/00GK102093954SQ20101059153
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者萬書波, 張利峰, 汪華 申請人:萬書波, 張利峰, 汪華