一種區分土壤N₂O微生物排放源的方法

2023-05-14 18:01:16

專利名稱：一種區分土壤N2O微生物排放源的方法
技術領域：
本發明涉及土壤微生物分子生態學，具體的說是一種區分土壤N2O微生物排放源的方法。
背景技術：
氧化亞氮(N2O)是重要的三大溫室氣體之一，它的增溫潛勢是CO2的298倍(百年時間尺度上)，而且還參與了臭氧層的破壞。土壤被認為是陸地生態過程中的主要N2O排放來源，土壤排放N2O過程的區分一直以來是一個棘手的難題。土壤中產生N2O的過程較多，主要涉及到硝化、反硝化、硝化細菌的反硝化作用等，而且這些過程在土壤中可能同時發生。另夕卜，土壤產生N2O的過程受到許多因子的影響，如溫度、水分含量、pH、可利用氮等，這些因子之間的相互作用、相互影響，使得土壤產生隊0的過程變得更為複雜。事實上所檢測到的土 壤排放的N2O是這些因子共同作用的結果。因此，準確地區分土壤的N2O排放源是有針對性地制定合理的土壤N2O減排措施的前提與依據。前期的研究多採用C2H2對土壤中硝化過程或反硝化過程進行抑制，測定土壤排放的N2O,可以估計硝化過程、反硝化過程對土壤排放N2O的相對貢獻。由於在培養過程中土壤微生物對C2H2的分解會導致C2H2濃度不斷下降，以至於不能完全抑制土壤的硝化作用，使實驗的結果造成偏差。近年來，穩定同位素技術已被證明是研究土壤N2O排放的不同微生物過程相對貢獻的有力工具。細菌的純培養實驗顯示硝化細菌的硝化作用比反硝化細菌的反硝化作用對15N的同位素分餾作用大。這就意味著，假如當底物的同位素值相同時，硝化作用比反硝化作用產生的N2O的S 15N更偏向負值。基於此，有些學者研究了不同時期土壤排放N2O過程的轉變。另外，有些研究對NH4+或N03_底物進行了 15N或18O的同位素標記，並施加到土壤中進行培養，測定被標記的N2O的排放，進而判斷N2O的產生過程及其這些過程的相對貢獻。

發明內容
本發明的目的在於提供一種區分農田土壤N2O排放源的方法。為實現上述目的，本發明採用技術方案為一種區分土壤N2O微生物排放源的方法，將待分析土壤處理後測定其所排放N2O的同位素S 15N值以及土壤產生隊0過程中相關微生物基因的拷貝數，基因豐度與S 15N-N2O的豐度值間相關性檢驗P〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。所述土壤為農田土壤、森林土壤和草地土壤。所述待分析土壤在不含N2O的人造空氣中培養。所述待分析土壤在不含N2O的人造空氣中以25 28°C條件下，培養l_45h。將待分析土壤處理後，採用穩定同位素比率質譜儀測定其排放的N2O的同位素，以螢光定量PCR測定土壤產生N2O過程中相關微生物基因的拷貝數，基因豐度與8 15N-N2O的豐度值間相關性檢驗P〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。本發明所具有的優點I.本發明提出了一種能夠精確區分土壤中產生N2O的主要微生物群體的技術，即應用穩定同位素測定法結合土壤微生物分子生態學手段分析土壤N2O排放的同位素特徵值與土壤功能微生物群體數量的相關關係，從而尋找對土壤排放N2O貢獻較大的特定微生物群體。2.本發明採用土壤芯作為實驗材料，減少了對土壤原來狀態的擾動，也不需添加同位素標記物而擾動了土壤原有的狀態，因此對土壤的N2O產生過程影響極小。3.由於土壤中不同的微生物組成對N2O產生的同位素分餾效應不同，所以可從微生物組成變化，結合N2O的同位素分餾效應，來分析土壤產生N2O的過程或與N2O產生過程相關的微生物群體。
4.本發明使用不含N2O的人造空氣作為培養實驗的背景氣體，避免了空氣中高濃度的N2O對實驗結果的影響。


圖I為本發明土壤培養方法的示意圖(其中，I鋼瓶；2空氣減壓閥；3三通閥；4軟膠管；5空氣泵；6膠塞；7玻璃瓶；8 土芯)。
具體實施例方式本發明對土壤排放N2O主要過程的微生物功能群體進行精確區分，可能為硝化過程的氨氧化細菌或氨氧化古菌，可能為反硝化過程的nirK型反硝化菌或nirS型反硝化菌等。土壤可以是玉米、大豆、高粱等作物的田間土壤。在作物的重要發育期採集作物田間土壤，如苗期、分枝(拔節)期、開(揚)花期、結莢鼓粒(灌漿)期、成熟期等。對土壤樣品進行瓶培養，培養裝置如圖I所不，培養瓶7為體積為6. OL的玻璃瓶,8為用環刀米取的表層(TlOcm的土芯，用帶有導管4的軟膠塞6密封培養瓶。用真空泵5對瓶進行抽真空，然後用鋼瓶I中不含N2O的人造空氣衝洗培養瓶，這一過程可以用空氣減壓閥2及三通3實現，直至瓶中的氣體中不含有N2O為止，然後將瓶置於室內，25 28°C條件下，培養l_45h。培養結束後，用穩定同位素比例質譜儀測定瓶中土壤排放N2O的8 15N值，用實時螢光定量PCR檢測土壤中與N2O產生相關的功能基因豐度。這些基因主要為具有硝化或反硝化作用的細菌、古菌的功能基因，如硝化過程中氨氧化細菌、氨氧化古菌的編碼單氨加氧
酶的基因-amoA、反硝化細菌的編碼亞硝酸還原酶的基因-nirK和nirS等。不同功
能微生物群體對產生N2O過程中15N的分餾作用存在差異，因此通過分析功能微生物群體豐度與8 15N-N2O值的相關性，可以判斷出哪種微生物群體對土壤排放N2O起重要作用。實施例本次試驗在遼寧省瀋陽市蘇家屯區十裡河鎮進行，土壤為棕壤土，種植作物為大豆。N肥為尿素，種植時一次性施肥，施肥量為60kg N/ha。在整個大豆生長季的六個發育時期進行了土壤樣品的採集，分別為種植後第19、35、52、66、99、115天，此時對應的大豆的發育期為發芽出苗期、苗期、分枝期、開花期、鼓粒期、成熟期。每次採樣時間為上午9:00—11:00。具體採取方法為用木塊墊在環刀之上，用錘子將環刀敲進土中直至環刀上沿與土壤齊平，後用鐵鍬將環刀從土壤中小心挖出，用一鐵片將環刀下沿的土壤切平，用一層薄塑膠袋將環刀的下沿包裹住，再用橡皮套紮緊，以防土壤從環刀中漏出，立即拿回實驗室待用於土壤的培養實驗。將採集來的18個環刀土芯，6個一組分為3組並稱重(約2Kg 土)，然後分裝於3個6L的玻璃試劑瓶中。用帶有進氣-出氣孔的橡膠塞塞緊瓶子，瓶塞的進氣口、出氣口分別通過三通閥連接鋼瓶(內含去除了 N2O的人造空氣)和真空泵，通過三次真空泵抽真空一鋼瓶充氣的循環過程後，經氣相色譜檢測瓶中的氣體均為不含N2O的空氣(實驗裝置見圖I)。將氣體置換過的培養瓶放於實驗桌上，室內環境下，平均溫度為25-28°C，放置約40h。用注射器抽取培養瓶中的氣體，注入預先抽真空的氣體採樣袋中。氣體樣品中的N2O濃度用配有電子捕獲檢測器(ECD)的氣相色譜儀測定。氣體樣品中N2O的同位素S15N值用穩定同位素比率質譜儀測定(參見表I)。提取土壤樣品的總DNA，運用實時螢光定量PCR儀測定土壤中總細菌的16SrDNA、氨氧化細菌的單氨加氧酶基因amoA、氨氧化古菌的單氨加氧酶基因amoA、反硝化細菌的銅 離子型(Cu2+)亞硝酸還原酶基因nirK和反硝化菌的細胞色素型(cdl)亞硝酸還原酶基因nirS的拷貝數(參見表I)。統計分析表明，土壤排放N2O的同位素S 15N值與土壤中氨氧化細菌的豐度存在顯著相關性(r=0.80，p〈0.01)(表I )，而與其它菌群的豐度相關性不顯著，表明氨氧化細菌是本試驗土壤中與N2O產生主要相關的微生物群體。表I 土壤排放N2O的同位素S 15N值與土壤中N2O相關微生物基因豐度
權利要求
1.ー種區分土壤N2O微生物排放源的方法，其特徵在於將待分析土壤處理後測定其所排放N2O的同位素S 15N值以及土壤產生N2O過程中相關微生物基因的拷貝數，基因豐度與S 15N-N2O的豐度值間相關性檢驗p〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。
2.按權利要求I所述的區分土壤隊0微生物排放 源的方法，其特徵在於所述土壤為農田土壌、森林土壤和草地土壌。
3.按權利要求I所述的區分土壤隊0微生物排放源的方法，其特徵在於所述待分析土壤在不含N2O的人造空氣中培養。
4.按權利要求I所述的區分農田土壤隊0排放源的方法，其特徵在於所述待分析土壌在不含N2O的人造空氣中以25 28°C條件下，培養l_45h。
5.按權利要求I所述的區分土壤N2O排放源的方法，其特徵在於將待分析土壤處理後，採用穩定同位素比率質譜儀測定其排放的N2O的同位素，以螢光定量PCR測定土壤產生N2O過程中相關微生物基因的拷貝數，基因豐度與8 15N-N2O的豐度值間相關性檢驗p〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。
全文摘要
本發明涉及土壤微生物分子生態學，具體的說是一種區分土壤N2O排放源的方法。將待分析土壤處理後測定其所排放N2O的同位素δ15N值以及土壤產生N2O過程中相關微生物基因的拷貝數，基因豐度與δ15N-N2O的豐度值間相關性檢驗p<0.05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。本方法適用於區分某種土壤中排放N2O的微生物群體。
文檔編號G01N27/62GK102758017SQ20121023948
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月11日 優先權日2012年7月11日
發明者夏宗偉, 孔雙, 徐慧, 董丹, 陳冠雄, 韓斯琴 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所