貓棒束孢粗多糖及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-14 19:25:51 1

專利名稱：貓棒束孢粗多糖及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及真菌提取物，具體屬於一種貓棒束孢粗多糖(IFP)及其製備方法，以及IFP在製備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應用。
背景技術：
貓棒束孢(Isaria felina)是從天然冬蟲夏草子實體中經菌種分離培養獲得的一種菌株，在分類上屬於半知菌綱、叢梗孢目、棒束孢屬。經中國科學院微生物研究所鑑定為 Isaria felina (DC. :Fr) Fr,該菌種已被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(保藏號=CGMCC NO. 0706)，並取得國家發明專利(ZL02103669. I)。Deffieux Gerard 等人(J Antibiot (Tokyo)· 1981,34 (10) 1261-1265.)從 Isaria felina中提取分離得到環羧酹酸肽結構的殺蟲劑Isariins B, C和D,並對 Isariins B, C 和 D 的結構進行了鑑定(J Antibiot (Tokyo) · 1981，34 (10) : 1266-1270.)。 郭永霞從貓棒束孢菌絲體中分離純化得到具有抗真菌作用的環縮肽isarfelin，並對 isarfelin進行了理化性質的分析、結構鑑定，並發現isarfelin具有抑制細菌、抵抗真菌的活性(郭永霞.貓棒束孢菌抗真菌多肽和巨大口蘑抗真菌蛋白的分離純化及特性的研究[博士論文].北京中國農業大學，2005)。Ikumoto等研究發現冬蟲夏草、蛹蟲草及貓棒束孢的浸出液對離體心房有負收縮效應，同時對電刺激迴腸的收縮反應及人血小板的凝結有抑制作用(Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 1991, 111 (9) 504-509)。我們在對貓棒束孢的研究中發現貓棒束孢菌絲粉對順鉬引起的急性腎功能損傷有很好的保護作用，並申報了專利，專利申請號為201110175421. 4。經過對貓棒束孢粗多糖的提取及其治療慢性腎功能衰竭的研究，發現貓棒束孢中的粗多糖成分同樣具有腎臟保護作用，對慢性腎功能衰竭有較好的治療效果。目前尚未見到關於貓棒束孢粗多糖在治療慢性腎功能衰竭方面的研究報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種貓棒束孢粗多糖，以及該多糖在製備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應用。本發明所涉及的貓棒束孢是從天然冬蟲夏草子實體中經分離培養獲得，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 0706。本發明使用的貓棒束孢菌絲體可由專利號ZL02103669. I的方法培養得到。本發明提供的一種貓棒束孢粗多糖(IFP)，通過如下方法製得取菌絲粉，加入
3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取70-110min,3000r/min轉速下離心4_6min ;於沉澱中繼續加人3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min轉速下離心
4-6min;於沉澱中繼續加人3_5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20_40min, 3000r/min離心4-6min ;合併三次提取的上清液，水浴濃縮至800_1000mL ;加人3_4倍的95%乙醇，充分混勻，沉澱過夜；取沉澱，於70°C烘乾備用。所述95%乙醇的加人量優選為濃縮後上清液體積的3. 75倍。本發明貓棒束孢粗多糖在製備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應用將貓棒束孢粗多糖用於動物實驗。實驗結果顯示大鼠連續灌胃腺嘌呤30d後(IOOmgCf1)，其血清中CRE和BUN水平顯著升高，成模大鼠在灌胃貓棒束孢粗多糖後其血清中CRE和BUN水平均顯著下降；IFP可以部分糾正慢性腎功能衰竭病情進展中常見的貧血問題；IFP模型組大鼠腎臟病變嚴重，而給藥組大鼠腎臟病理改變較輕。實驗研究結果表明，貓棒束孢粗多糖對腺嘌呤引起的大鼠慢性腎功能衰竭有很好的治療作用，在不超過50mg/kg的給藥劑量下對慢性腎功能衰竭有較好的治療效果，是一種具有良好開發前景的抗腎功能衰竭的藥物。


圖I :正常組腎臟病理圖(HE染色，X 100)。圖2 :模型組腎臟病理圖(HE染色，X 100)圖3 :IFP給藥低劑量組腎臟病理圖(HE染色，X 100)
具體實施例方式I.實驗材料及方法I. I實驗動物SPF (specific pathogen free)級 SD 大鼠，雄性，220_240g, 7-8 周齡，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK-(軍)2007-004。飼養溫度為 200C _22°C，12h/12h照明，自由飲水，飼餵無菌全價營養顆粒飼料(北京科奧協力飼料有限公司)。I. 2貓棒束孢菌絲體的培養培養基組成蛋白腖0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，MgSO4 0.05 %, KH2PO4
O.I %以及飽和NaHCO3溶液。培養方法將O. 5g菌種接種於裝有500mL培養基的3000mL三角瓶中，牛皮紙封口，於180r/min搖床上培養，培養溫度為26. 5°C，2d_3d後收集發酵液，將發酵液在2000r/ min轉速條件下離心5min，得菌絲體。所得菌絲體乾燥粉碎後用於以下實驗。I. 3貓棒束孢粗多糖(IFP)的提取取300g菌絲粉,加入1200mL蒸懼水,沸水浴提取90min, 3000r/min離心5min ;於沉澱中繼續加人1200mL蒸懼水,沸水浴提取30min, 3000r/min離心5min ;於沉澱中繼續加人1200mL蒸懼水,沸水浴提取30min, 3000r/min離心5min ;合併三次提取的上清液,水浴濃縮至900mL ;加人3. 75倍的95%乙醇，充分混勻，沉澱過夜；取沉澱，於70°C烘乾備用。I. 4動物分組與造模40隻SD大鼠購入後，適應性飼養一周，稱重，按體重隨機分為5組，分別為正常對照組，腺嘌呤模型組，IFP給藥高劑量組、IFP給藥中劑量組、IFP給藥低劑量組，每組8隻動物。
4
除正常對照組外，其餘各組大鼠每天灌胃給予腺嘌呤100mg/kg，每天一次，連續灌胃30d。尾尖採血，檢測血清中BUN和CRE水平，驗證造模是否成功。I. 5給藥方法及取材造模結束後IFP給藥組開始給藥治療，給藥劑量按每公斤體重中佔有體表面積比值確定，IFP給藥高、中、低劑量組給藥量分別為200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，灌胃量為 5mL/kg，空白對照組和模型對照組給予等量蒸餾水。給藥治療60d，給藥過程中大鼠自由進食、進水。給藥結束前一天，將大鼠轉移至代謝籠飼養，收集24h尿液，測定尿蛋白及尿肌酐含量。末次給藥後24h，稱重大鼠，將已禁食I !的大鼠用20%烏拉坦(氨基甲酸乙酯) 麻醉，劑量為5mL/kg。分別用普通血清管和EDTA抗凝管腹主動脈採血，一部分EDTA抗凝血做血常規檢測，將另一部分EDTA抗凝血離心，分離血漿，-80°C冷凍保存待測；離心普通血清管血液，取血清，-80°C冷凍保存待測。剖取左、右腎臟，稱重。取左腎，剝除外膜，固定於 4%甲醛溶液中，待測。I. 6觀察及檢測項目及方法I. 6. I觀察造模過程及給藥過程中大鼠的一般生存情況及進食進水情況。1.6.2定期對大鼠進行尾尖採血，測定血清CRE、BUN水平採用肌酐試劑盒和尿素氮試劑盒進行檢測。I. 6. 3大鼠血清CRE、BUN、UA、GLU、CK、LDH等生化指標測定採用全自動生化分析儀檢測。I. 6. 4大鼠血常規RBC、HGB、HCT、MCV等測定採用全自動血細胞分析儀檢測。1.6.5腎臟病理檢測取左腎，剝除外膜，固定於4%甲醛溶液中，常規脫水、透明、 石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察腎臟病理改變。I. 6. 6統計學分析實驗數據以表示，採用SPSS17. O軟體進行數據統計分析，組間均數比較採用單因素方差分析，兩組間比較採用最小顯著差異法(LSD)，取α =0.05為檢驗水準。2.結果2. I實驗過程中大鼠的一般狀態與正常對照組大鼠相比，造模組大鼠用腺嘌呤灌胃3-5天後，開始表現出進食量減少，尿量增多，活動力下降，一周左右開始出現皮毛稀疏，無光澤，體重增長緩慢。造模過程中動物死亡I只。給藥過程中動物死亡4隻，其中模型組I只，IFP高劑量組I只，中劑量組2隻。 2. 2造模期間動物血清BUN和CRE的變化表I、表2結果顯示，造模組與正常對照組比較，BUN、CRE顯著增高(P < O. 05)，說明造模成功。表I造模期間大鼠血清BUN的變化
權利要求
1.一種貓棒束孢粗多糖，其特徵在於，通過如下方法製得取菌絲粉，加入3-5倍重量的蒸懼水，沸水浴提取70-110min, 3000r/min轉速下離心4_6min ;於沉澱中繼續加人3_5 倍菌絲粉重量的蒸懼水，沸水浴提取20-40min, 3000r/min轉速下離心4_6min ;於沉澱中繼續加人3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min離心4_6min ;合併三次提取的上清液，水浴濃縮至800-1000mL ;加人3_4倍的95%乙醇，充分混勻，沉澱過夜； 取沉澱，於70°C烘乾備用。
2.如權利要求I所述的貓棒束孢粗多糖，其特徵在於，所述95%乙醇的加人量為濃縮後上清液體積的3. 75倍。
3.如權利要求I所述的貓棒束孢粗多糖在製備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種貓棒束孢粗多糖(IFP)及其製備方法，以及該多糖在製備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應用。貓棒束孢粗多糖製備取菌絲粉，加入3-5倍重量的蒸餾水，沸水浴提取70-110min，3000r/min轉速下離心4-6min；連續提取三次；合併提取的上清液，水浴濃縮至800-1000mL；加人3-4倍的95％乙醇，充分混勻，沉澱過夜；取沉澱即得貓棒束孢粗多糖。該多糖在一定劑量下可以顯著降低腎衰大鼠血清中肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)的水平，對腎臟的病理性損害有較好的保護作用，可以部分糾正慢性腎功能衰竭病情進展中常見的貧血症狀。該多糖能夠改善腎功能，對慢性腎功能衰竭具有顯著的治療作用。
文檔編號A61K31/715GK102585024SQ20121001195
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月15日 優先權日2012年1月15日
發明者任連生, 張生萬, 楊喜花 申請人:山西大學